DD204265A5 - Verfahren zur herstellung eines rekombinanten dna klonierungsvektors - Google Patents
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Abstract
Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA Klonierungsvektors, das darin besteht, dass man ein oder mehrere DNA-Segmente, die gegenueber wenigstens einem Antibiotikum nach Uebertragung in eine sensitive Wirtszelle eine Resistenz verleihen, an einen funktionalen Ursprung eines replikationshaltigen Restriktionsfragments des Plasmids pEL 103 bindet und die erhaltene rekombinierende DNA durch Selbstbindung in einen Klonierungsvektor ueberfuehrt.
Description
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA Klonierungsvektors
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA Klonierungsvektors aus einem funktionalen Ursprung an replikationshaltigem Restriktionsfragment des Plasmids pEL103 und einem oder mehreren DNA Segmenten, die Träger einer Antibiotikaresistenz sind.
Die eine Antibiotikaresistenz übertragenden oder verleihenden Klonierungsvektoren eignen sich zum Einsatz in Streptomyceten und damit verwandten Wirtszellen. Die Entwicklung und Ausnutzung der rekombinanten DNA Technologie in den obigen Organismen hat sich bisher verzögert und besonders schwierig gestaltet," weil es bisher allgemein keine selektierbaren genetischen Marker an Klonierungsvektoren gab. Die erfindungsgemäß zugänglichen Vektoren sind demgegenüber funktional und selektierbar sowohl bei Streptomyceten als auch anderen Wirtsstämmen, so daß sie einen bedeutenden technischen Fortschritt darstellen.
Diese Vektoren sind vor allem deshalb besonders gut OJ brauchbar, weil sie klein und versatil sind und sich in irgendeine Streptomyceszelle transformieren und selektieren lassen, die empfindlich ist gegenüber einem Anti.biot.i~
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kum, für das eine Resistenz übertragen wird. Mehr als die Hälfte der klinisch wichtigen Antibiotika wird von Stämmen der Streptomyceten gebildet, so daß die Entwicklung von Klonierungssystemen und Klonierungsvektoren wünschenswert ist, die sich auf diese industriell wichtige Gruppe anwenden lassen. Die erfindungsgemäß zugänglichen Vektoren ermöglichen nun die Klonierung von Genen in Streptomyceten, und hierdurch lassen sich sowohl die Ausbeuten bekannter Antibiotika erhöhen als auch neue Antibiotika und Antibiotikaderivate bilden.
Die vorliegend zugänglichen Vektoren stellen Träger zur Klonierung von DNA in Wirtszellen von Streptomyceten dar und ermöglichen ferner auch eine einfache Selektion von Transformanten. Die Transformation ist ein Ereignis mit sehr geringer Häufigkeit und ein solcher funktionaler Test ist daher eine praktische Notwendigkeit für die Bestimmung, welche Zellen von den Millionen Zellen das Plasmid DNA an sich gebracht haben. Dies ist wichtig, weil nichtselektierbare DNA Sequenzen auf die Vektoren inseriert werden können und sich nach erfolgter Transformation die Zellen, die den Vektor und die jeweils interessierende bestimmte DNA Sequenz enthalten, dann durch geeignete antibiotische Selektion isolieren lassen. Im vorliegenden Zusammenhang werden einige Spezialbegriffe verwendet, die folgende Bedeutungen haben:
Rekombinanter DNA Klonierungsvektor: Hierunter wird jedes sich autonom replizierende Mittel unter Einschluß von Plasmiden verstanden, das ein DNA Molekül enthält, an welches ein oder mehr weitere DNA Segmente addiert sein oder addiert worden sein können.
Transformation: Hierunter versteht man die Einführung von DNA in eine RezipientenwirtszelIe, die den Genotyp verändert und infolgedessen zu einer stabilen, vererbbaren Veränderung in der Rezipientenzelle führt.
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Transformant: Hierunter wird eine Rezipientenwirtszelle verstanden, die eine Transformation durchgemacht hat.
Sensitive Wirtszelle: Hierunter ist eine Wirtszelle gemeint, die in Anwesenheit eines bestimmten Antibiotikums ohne ein DNA Segment nicht wachsen kann, das ein Resistenzüberträger hierfür ist.
Restriktionsfragment: Hierunter ist jedes lineare Teilstück oder Gesamte eines Plasmids zu verstehen, das durch Einwirkung von ein oder mehr Restriktionsenzymen auf das Plasmid erzeugt worden ist.
Insertionsisomer: Hierunter versteht man zwei oder mehr mögliche rekombinante DNA Moleküle, die durch Insertion eines DNA Fragments an einer von zwei oder mehr kompatiblen Stellen am Rezipienten DNA gebildet werden.
Plasmid pLR2 1.6kb BamHI Restriktionsfragment: Hierunter wird das gleiche 1.6 kb BamHI Thiostreptonresistenz-Übertragungsfragment verstanden, das im Plasmid pIJ6 enthalten ist.
Plasmid pLRl oder pLR4 3.4 kb BamHI Restriktionsfragment: Hierunter wird das gleiche 3.4 kb BamHI Neomycinresistenz-Übertragungsfragment verstanden, das im Plasmid pIJ2 enthalten ist.
R Amp : Hierunter wird der ampicillinresistente Phenotyp ver-
30 standen.
Tet : Hierunter wird der tetracyclinsensitive Phenotyp verstanden
ThioR: Hier verstanden.
Thio : Hierunter wird der thiostreptonresistente Phenotyp
Neo : Hierunter wird der neomycinresistente Phenotyp verstanden.
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Die rekombinanten DNA Klonierungsvektoren bestehen aus
a) einem funktionalen Ursprung eines replikationshaltigen Restriktionsfragments des Plasmids pEL103 und
b) einem oder mehreren DNA Segmenten, die eine Resistenz gegenüber wenigstens einem Antibiotikum übertragen,
wenn sie in eine sensitive Wirtszelle transformiert sind, wobei diese Wirtszelle einer Transformation, Zellteilung und Züchtung zugänglich ist.
Die rekombinanten DNA Klonierungsvektoren, die bifunktionell sind, nämlich in E. coli, Streptomyceten und anderen Organismen verwendet werden können, bestehen aus a) einem funktionalen Ursprung eines replicationshaltigen Restriktionsfragments des Plasmids pELlO3,
b) einem oder mehreren DNA Segmenten, die eine Resistenz gegenüber wenigstens einem Antibiotikum übertragen, wenn sie in eine sensitive Wirtszelle transformiert sind, wobei diese Wirtszelle einer Transformation, Zellteilung und Züchtung zugänglich ist,und
c) einem funktionalen replikonhaltigen und Antibiotikaresistenz übertragenden Restriktionsfragment eines Plasmids von E. coli.
Die Vektoren werden konstruiert durch Ligierung von einem oder mehreren Antibiotikaresistenz übertragenden DNA Segmenten und einem Ursprung an replikationshaltigem Restriktionsfragment des Plasmids pELlO3, wobei man zur Kontruktion bifunktioneller Vektoren ein funktionelles replikonhaltiges und Antibiotikaresistenz übertragendes Restriktionsfragment eines Plasmids von E. coli verwendet. Das Plasmid pELl03, aus welchem der Ursprung an replikationshaltigen Fragmenten konstruiert wird, hat eine Größe von etwa 20,0 kb und enthält mehrere Restriktionsstellen, die sich besonders gut für eine molekulare Klonierung eignen. Da der Ursprung der Rep«likation beim Plasmid pEL103 innerhalb des 2,8 kb BamHI Restriktionsfragments lokalisiert worden ist, läßt sich eine Reihe replikationshaltiger Fragmente unterschiedlichen Ursprungs herstellen, indem
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man das Plasmid mit Restriktionsenzyxnen digestiert, die außerhalb des Bereichs 2,8 kb BamHI schneiden. Ein detaillierter Restriktionsstellenplan und Funktionsplan für das Plasmid pELlO3 geht aus Fig. 1 der Zeichnung hervor. Diese Fig. 1 und alle anderen Figuren sind jedoch keine maßstabsgerechte Zeichnungen.
Das Plasmid pELlO3 läßt sich am einfachsten aus Streptomyces granuloruber Nr. A39912.13/pEL103 isolieren. Hierbei handelt es sich um einen Stamm, der in der ständigen Kulturensammlung von Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois hinterlegt ist und von dort unter der Hinterlegungsnummer NRRL 12549 frei bezogen werden kann. Streptomyces granuloruber Nr. A39912.13/pELlO3 ist abgeleitet von Streptomyces granuloruber Nr. A39912, und hierbei handelt es sich um einen Stamm, der auch das Plasmid pELlO3 beherbergt und der ebenfalls in der oben erwähnten ständigen Kulturensammlung hinterlegt ist und von dort unter der Hinterlegungsnummer NRRL 12389 frei bezogen wer-
20 den kann.
Es lassen sich zwar replikationshaltige Fragmente von Plasmid pEL103 verschiedensten Ursprungs konstruieren, wobei a-ls Beispiele hierfür vorliegend jedoch nur die 2,8 kb und 19,9 kb BamHI Restriktionsfragmente erläutert werden. Diese Fragmente sind an eines oder mehrere Antibiotikaresistenz übertragende DNA-Fragmente ligiert, beispielsweise das Thiostreptonresistenz übertragende 1,6 kb BamHI Restriktionsfragment des Plasraids pLR2 und das Neomycinresistenz übertragende 3,4 kb BamHI Restriktionsfragment des Plasmids pLRl oder des Plasrnids pLR4, wodurch erfindungsgemäße Vektoren gebildet werden.
Das Plasmid pLR2, nämlich die Quelle für das Thiostreptonresistenz verleihende Fragment, hat eine Größe von etwa 18,7 kb und wird konstruiert durch Ligierung von mit Hindlll behandeltem Plasmid pIJ6 gemäß Nature 186, 525 (1980) an das mit Hindlll behandelte Plasmid pBR322. Das
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Plasmid pLRl, welches die Quelle für das Neomycinresistenz verleihende Fragment ist, hat eine Größe von etwa 14,8 kb und wird ähnlich konstruiert, mit der Ausnahme, daß hierzu anstelle des Plasmids pIJ6 das Plasmid pIJ2 gemäß Nature 286, 525 (1980) verwendet wird. Beide Plasmide pLR2 und pLRl sind in E. coli funktional und lassen sich daher für eine nachfolgende Manipulierung einfach amplifizieren und isolieren. Eine analoge Konstruktion, welche zum Plasmid pLR4 führt, wird durchgeführt durch Ligation von mit BamHI behandeltem Plasmid pBR322 an mit BamHI behandeltes Plasmid pLRl. Ein Restriktionsstellenplan und ein Funktionsplan für die Plasmide pLRl, pLR2 und pLR4 geht jeweils aus den Fig. 2 bis 4 der Zeichnung hervor.
Zur entsprechenden Konstruktion ligiert man das die Thiostreptonresistenz verleihende 1,6 kb BamHI oder das die Neomycinresistenz verleihende 3,4 kb BamHI an den 2,8 kb oder 19,9 kb Ursprung des replikationshaltigen BamHI Fragments des Plasmids pELlO3. Die erhaltene rekombinierende DNA unterzieht man dann einer Selbstligierung, wodurch man zu erfindungsgemäßen Plasmiden gelangt. Je nach der Orientierung des inserierten DNA-Fragments erhält man dabei Rekombinationsplasmide mit zwei Orientierungen. Die Ligierung des 1,6 kb BamHI Fragments des Plasmids pLR2 an das 2,8 kb BamHI Fragment des Plasmids pELlO3 führt zu den Plasmiden pELlO7 und pELlO5. Durch Ligierung des 3,4 kb BamHI Fragments des Plasmids pLRl oder des Plasmids pLR4 gelangt man zu den Plasmiden pELlO9 und pELllO. Die Ligierung beider erwähnter Fragmente führt zu den Plasmiden pELH3, pELll4, pEL115 und pELH6. In ähnlicher Weise gelangt man durch Ligierung des 1,6 kb BamHI Fragments an das 19,9 kb BamHI Fragment des Plasmids pEL103 zu den Plasmiden pELlO8 und pELlO4. Die Ligierung des 3,4 kb BamHI Fragments ergibt die Plasmide pELlll und pELll2.
3-> Durch Ligierung beider erwähnter Fragmente erhält man die Plasmide pELll7, pELll8, pEL119 und pEL120.
Für die Ligation von Antibiotikaresistenz verleihenden
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] DNA-Segmenten lassen sich die verschiedensten Restriktionsfragmente von Plasmid pEL103 verwenden, sofern der Ursprung der Replikation vorhanden ist, der im 2,8 kb BamHI Restriktionsfragment enthalten ist. Beispiele für weitere Restriktionsfragmente des Plasmids pELlO3, die sich zur Konstruktion von weiteren erfindungsgemäßen Plasmiden verwenden lassen, sind unter anderem die Fragmente Pstl, Sphl, BgIII, CIaI und Xhol. Ein bestimmtes Antibiotikaresistenz verleihendes DNA-Segment ist nicht an eine einzelne Stelle am Fragment eines Plasmids pEL103 gebunden, sondern es kann an verschiedenen Stellen ligiert oder inseriert sein, sofern der Ursprung der Replikation oder einer sonstigen kritischen durch ein Plasmid gesteuerten physiologischen Funktion nicht zerstört sind. Der Fachmann kann ohne weiteres diejenigen Stellen ermitteln, die für die Ligation und Insertion eines bestimmten DNA-Fragments geeignet sind.
Die eine Resistenz gegenüber den Antibiotika Thiostrepton und Neomycin verleihenden bzw. übertragenden DNA-Segmente werden vorliegend zwar anhand der Restriktionsfragmente 1,6 kb und 3,4 kb BamHI der Plasmide pLR2 und pLRl erläutert, doch kann der Fachmann selbstverständlich auch entweder einzeln oder in Kombination weitere DNA-Segmente konstruieren, die ebenfalls für eine Resistenz gegenüber Thiostrepton oder Neomycin sorgen. Zu weiteren für eine Thiostreptonresistenz sorgenden DNA-Segmenten des Plasmids pLR2 gehören beispielsweise das 13 kb Pstl Restriktionsfragment und ferner auch das Bell Subfragment des 1,6 kb BamHI Restriktionsfragments. Zu anderen für eine Neomycinresistenz sorgenden DNA-Segmenten des Plasmids pLRl gehören beispielsweise das 3,5 kb Pstl Restriktionsfragment und auch das größere Subfragment aus den Sstl-Kpnl Subfragmenten des 3,4 kb BamHI Restriktionsfragments.
Es liegt auch im Rahmen des fachmännischen Könnens, noch andere DNA-Segmente aufzubauen, die eine Resistenz gegenüber dem gleichen oder auch anderen Antibiotika verleihen,
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wie beispielsweise gegenüber Chloramphenicol, Streptomycin, Hygromycin, Viomycin, Tylosin oder Erythromycin. Zu Beispielen für DNA-Segmente, die für eine Resistenz gegenüber Erythromycin sorgen, gehören unter anderem die Re-Striktionsfragmente ^2,8 kb Sail, ^2,7 kb SaII-BgIII, ^"3,0 kb HindIII,~2,5 kb Sall-BamHI, ^2,8 kb Xhol-Bqlll und ~4,1 kb EcoRI-BamHI des Plasmids pIJ43. Das Plasmid pIJ43 ist erhältlich aus E. coli 803/pIJ43, nämlich über einen in der ständigen Kulturensammlung von American. Type Culture Collection, Rockville, Maryland ohne Beschränkung über seine Verfügbarkeit hinterlegten Stamm, der von dieser Sammlung unter der Nr. ATCC 39156 frei bezogen werden kann.
Funktionale Derivate der verschiedenen Antibiotikaresistenz verleihenden DNA-Fragmente lassen sich herstellen, indem man dem genetischen Code entsprechend bestimmte Nucleotide addiert, eliminiert oder substituiert. Die Ligation dieser modifizierten Segmente oder irgendwelcher anderer für eine Antibiotikaresistenz sorgender DNA-Segmente an einen Ursprung eines replikationshaltigen Fragments des Plasmids pELlO3 führt natürlich ebenfalls zu erfindungsgemäßen Vektoren.
Es lassen sich auch derivatisierte Vektoren konstruieren, durch welche die Erfindung weiter erläutert wird. So erhält man beispielsweise durch Entfernung von BclI-BamHI vom Plasmid pELlO5 das Plasmid pFJl24, und aus diesem Plasmid lassen sich ebenfalls weitere Derivate herstellen.
Durch Insertion des für eine Neomycinresistenz sorgenden Fragments 3,4 kb BamHI des Plasmids pLRl oder pLR4 in das Plasmid pFJl24 erhält man beispielsweise die Plasmide pFJl44 und pFJl45. Durch Entfernung von (BclI-BamHI) aus dem Plasmid pFJ144 gelangt man beispielsweise zum Plasmid pFJl46. Durch Insertion des eine Erythromycinresistenz verleihenden Fragments ~2,7 kb SaII-BgIII des Plasmids pIJ43 in das Plasmid pFJl24 ergibt sich beispielsweise das Plasmid pFJl47. Durch Insertion des eine Erythromy-
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cinresistenz ergebenden Fragments ^2,Q kb Sail des Plasmids pIJ43 gelangt man in ähnlicher Weise zu den Plasmiden pFJl48 und pFJl49. Die oben erwähnten und für eine Antibiotikaresistenz sorgenden derivierten Plasmide enthalten den Ursprung pEL103 der Replikation, und sie gehören daher ebenfalls zur Erfindung.
Sowohl die Restriktionsfragmente des Plasmids pELlO3 als auch die verschiedenen für eine Antibiotikaresistenz sorgenden DNA-Segmente können zur Erleichterung einer Ligation entsprechend modifiziert sein. So lassen sich beispielsweise entweder an einem bestimmten Restriktionsfragment eines Plasmids pELl03 oder an einem bestimmten für eine Antibiotikaresistenz sorgenden DNA-Segment Molekularverknüpfer anordnen. Hierdurch können in einfacher Weise bestimmte Stellen für eine anschließende Ligation konstruiert werden. Ferner lassen sich auch das Plasmid pELlO3 und die replikationshaltigen Restriktionsfragmente mit einem Ursprung von pELlO3 durch Addierung, Eliminierung oder Substituierung bestimmter Nucleotide so modifizieren, daß es hierdurch zu einer Veränderung der jeweiligen Eigenschaften und zur Bildung einer Reihe von Restriktionsstellen für eine Ligation von DNA kommt. Der mit der Nucleotidchemie und dem genetischen Code vertraute Fachmann weiß nämlich, welche Nucleotide gegenseitig austauschbar sind und welche DNA-Modifikationen für einen bestimmten Zweck wünschenswert sind.
Die erfindungsgemäß erhältlichen Vektoren, beispielsweise die Plasmide pELlO3, pELlO5, pEL109, pEL113, pELlO4, pELlll, pELll7, pFJ124, pFJl44 und pFJl47, lassen sich an ein ein funktionales replikonhaltiges und für eine Antibiotikaresistenz sorgendes Restriktionsfragment von Plasmiden von E. coli ligieren, beispielsweise von Plasmiden pBR322, pBR324, 3^ pBR32 5 oder pBR328, wodurch in E. coli und Streptomyceten verwendbare neue bifunktionelle Plasmide entstehen. Diese Konstruktionen, die vorliegend durch die Plasmide pELl21, pELl22, pFJl50 und pFJl51 beispielsmäßig erläutert werden,
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•1 haben besondere Vorteile, weil sich eine Amplifizierung und Manipulierung von Plasmiden rascher und einfacher in E. coli als in Streptomyceten erreichen läßt. Nach erfolgter Durchführung der jeweils gewünschten Verfahren mit rekombinierender DNA in dem aus E. coli bestehenden Wirtssystem kann man das Gesamtsystem oder die jeweilige Streptomyces DNA daher entfernen, erforderlichenfalls wieder zur Plasmidform rekonstruieren und dann zu einem Streptomyces oder einer damit verwandten Wirtszelle transformieren.
Die erfindungsgemäß herstellbaren rekombinanten DNA Klonierungsvektoren sind nicht auf eine Verwendung in einer einzelnen Art oder einem einzelnen Stamm von Streptomyces beschränkt. Die Vektoren lassen sich vielmehr ganz breit anwenden und in Wirtszellen von Streptomyceten verschiedenster Taxa transformieren, insbesondere in restriktionslose Stämme wirtschaftlich wichtiger Taxa, die Antibiotika bilden, wie Aminoglykosid-, Macrolid-, ß-Lactam-, Polyether- oder GIykopeptidantibiotika. Solche restriktionslose Stämme lassen sich ohne weiteres aus Streptomyces Taxa unter Anwendung herkömmlicher Verfahren selektieren und isolieren, und hierzu wird beispielsweise hingewiesen auf Microbiological Reviews 44, 206 (1980). Die Wirtszellen restriktionsloser Stämme haben keine Restriktionsenzyme, so daß sie nach Transformation das Plasmid DNA nicht verkürzen oder abbauen. Wirtszellen, die Restriktionsenzyme enthalten, welche keine Restriktionsstellen der vorliegenden Vektoren verkürzen, werden daher ebenfalls als restri-ktionslos angesehen.
Bevorzugte Wirtszellen restriktionsloser Stämme der Streptomyces Taxa, die Aminoglykosidantibiotika bilden und in denen die erfindungsgemäB herstellbaren Vektoren besonders geeignet sind, sind unter anderem restriktionslose Zellen von beispielsweise: S. kanamyceticus (Kanamycine), S. chrestomyceticus (Aminosidin), S. griseoflavus (Antibiotikum MA 1267), S. microsporeus (Antibiotikum SF-767), S. ribosidificüs (Antibiotikum SF733), S. flavopersicus (Spectinomycin), S.
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spectabilis {Actinospectacin), S. rimosus forma paromomycinus (Paromomycine, Catenulin), S. fradiae var. italicus (Aminosidin) , S. bluensis var. bluensis (Bluensornycin) , S. catenulae (Catenulin), S. olivoreticuli var. cellulophi 1 us (Destomycin A), S. tenebrarius (Tobramycin, Apramycin), S. lavendulae (Neomycin), S. albogriseolus (Neomycine), S. albus var. metamycinus (Metamycin), S. hygroscopicus var. sagamietisis (Spectinomycin), S. bikiniensis (Streptomycin), S. griseus (Streptomycin), S. erythrochromogenes var. narutoensis (Streptomyein), S. poolensis (Streptomycin), S. galbus (Streptomycin), S. rameus (Streptomycin), S. olivaceus (Streptomycin), S. mashuensis (Streptomycin), S. hygroscopicus var. limoneus (Validamycine), S. rimofaciens (Destomycine), S. hygroscopicus forma glebosus (Glebomycin), S. fradiae (Hybrimycine, Neomycine), S. eurocidicus (Antibiotikum A16316-C), S. aquacanus (N-Methylhygromycin B), S. crystallinus (Hygromycin A), S. noboritoensis (Hygromycin), S. hygroscopicus (Hygromycine), S. atrofaciens (Hygromycin), S. kasugaspinus (Kasugamycine), S. kasugaensis (Kasugamycine),"S.
netropsis (Antibiotikum LL-AM31), S. lividus (Lividomycine) , S. hof- ' ·= - (Seldomycin-Komplex) oder S. canus (Ribosylparomamin).
Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme aus der Streptomyces Taxa, die , Makrolidantibiotika bilden und in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar und transformierbar sind, gehören restriktionslose Zellen von beispielsweise S. caelestis (Antibiotikum M188), S. platensis (Platenomycin), S. rochei var. volubilis (Antibiotikum T2636), S. venezuelae (Methymycine), S. griseofuscus (Bundlin), S. narbonensis (Josamycin, Narbomycin), S. fungicidicus (Antibiotikum NA-181), S. griseofaciens (Antibiotikum PA133A, B), S. roseocitreus (Albocyclin), S. bruneogriseus (Albocyclin), S. roseochromogenes (Albocyclin), S. cinerochromogenes (Cineromycin B), S. albus (Albomycetin), S. felleus (Argomycin, Picromycin), S. rochei (Lankacidin, Borrelidin), S. violaceoniger (Lan-
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kacidin), S. griseus (Borrelidin), S. maizeus (Ingramycin), S. albus var. coilmyceticus (Coleimycin), S. mycarofaciens (Acetylleukomycin, Espinomycin), S. hygroscopicus (Turimycin, Relomycin, Maridomycin, Tylosin, Carbomycin), S. griseospiralis (Relomycin), S. lavendulae (Aldgamycin), S. rimosus (Neutramycin), S. deltae (Deltamycine), S. fungicidicus var. espinomyceticus (Espinomycine), S. furdicidicus (Mydecamycin), S. ambofaciens (Foromacidin D), S. eurocidicus (Methymycin), S. griseolus (Griseomycin), S. flavochromogenes (Amaromycin, Shincomycine), S. fimbriatus (Amaromycin), S. fasciculus (Amaromycin), S. erythreus (Erythromycine), S. antibioticus (Oleandomycin), S. olivochromogenes (Oleandomycin), S. spinichromogenes var« suragaoensis (Kujimycine), S. kitasatoensis (Leucomycin), S.
narbonensis var. josamyceticus (Leucomycin A3, Josamycin), S. albogriseolus (Mikonomycin), S. bikiniensis (Chalcomycin), S. cirratüs (Cirramycin), S. djakartensis (Niddamycin), S. eurythermus (Angolamycin), S. fradiae (Tylosin, Lactenocin, Macrocin), S. goshikiensis (Bandamycin), S.
griseoflavus (Acumycin), S. halstedii (Carbomycin), S.
tendae (Carbomycin), S. macrosporeus (Carbomycin), S. thermotolerans (Carbomycin) oder S. albireticuli (Carbomycin).
Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme aus " der Streptomyces Taxa, die ß-Lactamantibiotika bilden und in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden können, gehören die restriktionslosen Zellen von beispielsweise S. lipmanii (A16884, MM4550, MM13902), S. clavuligerus (A16886B, Clavulansäure), S. lactamdurans (Cephamycin C), S. griseus (Cephamycin A, B), S. hygroscopicus (Deacetoxycephalosprin C), S. wadayamensis (WS-3442-D), S. chartreusis (SF 1623), S. heteromorphus und S. panayensis (C2081X); S. cinnamonensis, S. fimbriatus, S. halstedii, S. rochei und S. viridochromogenes (Cephamycine A, b); S. cattleya (Thienamycin) oder S. olivaceus, S. flavovirens, S. fla-
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vus, S. fulvoviridis, S. argenteolus und S. sioyaensis (MM 4550 und MM 13902).
Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme aus der Streptomyces Taxa, ,-. die Polyetherantibiotika bilden und in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden können, gehören die restriktionslosen Zellen von beispielsweise S. albus (A204, A28695A und B, Salinomycin), S. hygroscopicus (A218, Emericid, DE3936, A120A, A28695A und B, Etheromycin, Dianemycin), S. griseus (Grisorixin), S. conglobatus (lonomycin), S. eurocidicus var. asterocidicus (Laidlomycin), S. lasaliensis (Lasalocid), S. ribosidificus (Lomomycin), S. cacaoi var. asoensis (LysoceHin) , S. cinnamonensis (Monensin), S. aureofaciens (Narasin), S. gallinarius (RP 30504), S. longwoodensis (Lysocellin), S. flaveolus (CP38936), S. mutabilis (S-11743a) und S. violaceoniger (Nigericin).
Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme aus der Streptomyces Taxa, die Glykopeptidantibiotika bilden und in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden können, gehören die restriktionslosen Zellen von beispielsweise S. orientalis und S. haranomachiensis (Vancomycin), S. candidus (A-35512, Avoparcin) und S. eburosporeus (LL-AM 374).
Zu bevorzugten Zellen anderer restriktionsloser Stämme der Streptomyceten, in denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden können, gehören unter anderem die restriktionslosen Zellen von beispielsweise S. coelicolor, S. granuloruber, S. roseosporus, S. lividans, S. tenebrarius, S. acrimycine, Ξ. glaucescens, S. parvilin, S. pristinaespiralis, S. violaceoruber, S. vinaceus,S. espinosus und S. azureus.
Zusätzlich zu den oben erwähnten Beispielen von Wirtszel-
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] len von Streptontyceten sind die vorliegenden Vektoren auch in anderen Taxa brauchbar und zu Zellen restriktionsloser Stämme transformierbar, und Beispiele für solche andere Klassen an Mikroorganismen sind Bacillus, Staphylococcus und die damit verwandten Actinomyceten unter Einschluß von Streptosporangium, Actinoplanes, Nocardia und Micromonospora. Die erfindungsgemäß herstellbaren Vektoren sind daher breit anwendbar und lassen sich in Wirtszellen aus einer Vielfalt von Organismen transformieren.
Obwohl alle Ausführungsformen geeignet sind,
werden doch einige der erfindungsgemäß erhältlichen rekombinanten DNA KIonierungsvektoren und Transformanten gegenüber anderen stärker bevorzugt. Bevorzugte Vektoren sind daher die Plasmide pEL103, pEL105, pELlO9, pELll3, pEL104, pELlll, pELll7, pELl21, pFJl24, pFJ144, pFJl46, pFJ147, pFJlSl, pFJ153, pFJl55 und pFJl60. Bevorzugte Transformanten sind Streptomyces ambofaciens/pELlO3, S. ambofaciens/pELlQ5, S. ambofaciens/pELlO9, S. ambofaciens/pELl13, S. ambofaciens/ pELlO4, S. ambofaciens/pELlll, S. ambofaciens/pEL117,
E. coil K12 HBl01/pELl21, S. ambofaciens/pFJl24, S. ambofaciens/pFJl44, S. ambofaciens/pFJl46, S. ambofaciens/pFJl47, E. coli K12 HBl01/pFJ150, E. coli K12 HBl01/pFJl53, E. co il K12 HBl01/pFJl55 und E. coli K12 HB101/pFJl60. Aus diesen bevorzugten Gruppen werden wiederum die Plasmide PEL103, pELlO5, pEL113, pELlO9, pFJ124, pFJl44 und pFJl47 und die Transformanten S. ambofaciens/pEL10 3, S. ambofaciens/pELlO5, S. ambofaciens/pELll3, S. ambofaciens/pEL109, S. ambofaciens/pFJl24, S. ambofaciens/pFJl44 und S. ambo-
30 faciens/pFJl47 besonders bevorzugt.
Die erfindungsgemäß herstellbaren rekombinanten DNA Klonierungsvektoren und Transformanten lassen sich vielseitig einsetzen und tragen zur Auffüllung des Bedarfs an geeigneten KIonierungsträgern bei, die in Streptomyceten und damit verwandten Organismen verwendet werden können. Die Fähigkeit der vorliegenden Vektoren, eine Resistenz gegenüber Antibiotika zu verleihen, die für nichttransformierte Wirts-
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zellen toxisch sind, eröffnet weiter auch eine brauchbare Möglichkeit zur Selektierung von Transforrnanten. Dies ist wichtig, weil in der Praxis die Notwendigkeit zur Bestimmung und Selektierung der bestimmten Zellen besteht, die den Vektor DNA angenommen haben. Weitere DNA-Segmente, für die es keine Funktionstests bezüglich ihrer Anwesenheit gibt, können in die vorliegenden Vektoren ebenfalls inseriert werden, wobei sich dann durch geeignete antibiptische Selektion die Transformanten isolieren lassen, die die nichtselektierbare DNA enthalten. Solche nichtselektierbare DNA-Segmente lassen sich an irgendeiner Stelle inserieren, mit Ausnahme der Bereiche, die für die Plasmidf unktion und Replikation erforderlich sind, und hierzu gehören unter anderem Gene, die antibiotische Modifikationsenzyrne spezifizieren, sowie Regulationsgene aller Art.
Ein nichtselektierbares DNA-Segment, das ein Gen enthält, wird erfindungsgemäß in ein Plasmid, beispielsweise das Plasmid pELll3, an der zentralen Sail Restriktionsstelle des Resistenz verleihenden 1.6 kb BamHI Fragments inseriert. Durch eine solche Insertion kommt es zu einer Inaktivierung des thiostreptonresistenten Gens, wodurch sich die Transformanten, die das rekombinante Plasmid enthalten, leicht identifizieren lassen. Zu diesem Zweck führt man zuerst eine Selektion bezüglich der Neomycinresistenz durch und identifiziert dann diejenigen neomycinresistenten Transformanten, die gegenüber Thiostrepton nicht resistent sind. In ähnlicher Weise ergibt eine Insertion eines jeweils interessierenden DNA-Segments, beispielsweise an der inneren
°0 BamHI Restriktionsstelle des. Resistenz verleihenden 3.4 kb BamHI Fragments, eine Inaktivierung des neomycinresistenten Gens. Transformanten, die dieses rekombinante Plasmid enthalten, lassen sich daher ebenfalls leicht identifizieren, indem man zuerst eine Selektion bezüglich der Thiostreptonresistenz vornimmt und dann diejenigen thiostreptonresistenten Transformanten identifiziert, die nicht gegenüber Neomycin resistent sind. Die Fähigkeit zu einer Selektierung bezüglich der Antibiotikaresistenz in Streptomyceten
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und damit verwandten Zellen erlaubt daher eine wirksame Isolierung der äußerst seltenen Zellen, die die jeweils interessierende nicht selektierbare DNA enthalten.
Der oben beschriebene Funktionstest hinsichtlich einer Antibiotikaresistenz läßt sich ferner auch zur Durchsuchung großer Mengen an DNA nach den Segmenten verwenden, die als Steuerelemente wirken und eine Expression eines bestimmten Gens für eine Antibiotikaresistenz bewerkstelligen können. Solche Segmente, zu denen auch Promotoren, Abschwächer, Repressoren, Induktoren und ribosomale Bindestellen gehören, werden zur Steuerung der Expression anderer Gene in Zellen von Streptomyceten und damit verwandten Organismen verwendet.
Die erfindungsgernäß erhältlichen Vektoren, die eine Resistenz gegenüber Thiostrepton und Neomycin verleihen, sind auch zur Sicherung dafür brauchbar, daß verknüpfte DNA-Segmente in Wirtszellen über eine Reihe von Generationen stabil bleiben. Diese Gene oder DNA-Fragmente, die an das die Thiostreptonresistenz oder Neomycinresistenz verleihende Fragment kovalent gebunden sind und die entweder in Streptomyceten oder in Zellen damit verwandter Organismen propagiert werden, werden dadurch aufrechterhalten, daß man die Trans™ formanten Konzentrationen an Thiostrepton oder Neomycin aussetzt, die für die nichttransformierten Zellen toxisch sind. Transformanten, die den Vektor und infolgedessen auch jegliche kovalent gebundene DNA verlieren,.können nicht wachsen und werden daher aus der Kultur eliminiert.
Durch die erfindungsgemäßen Vektoren läßt sich somit'die jeweils gewünschte DNA-Sequenz stabilisieren und aufrechterhalten.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren Klonierungsvektoren und Transformanten ermöglichen eine Klonierung von Genen unter Verbesserung der Ausbeuten verschiedener Produkte, die gegenwärtig in Streptomyceten und damit verwandten Zellen gebildet werden. Zu Beispielen für solche Produkte gehören unter ande-
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rem Streptomycin, Tylosin, Cephalosporine, Actaplanin, Narasin, Monensin, Apramycin, Tobramycin oder Erythromycin. Ferner werden erfindungsgemäß auch selektierbare Vektoren bereitgestellt, die sich zur Klonierung, Charakterisierung und Rekonstruktion von DNA-Sequenzen eignen, welche wirtschaftlich wichtige Produkte codieren, wie Humaninsulin, Humanproinsulin, Glucagon oder Interferon. Ferner sind diese Vektoren auch für enzymatische Funktionen in metabolischen Vorgängen brauchbar, die technisch wichtige
"IO Verfahren und Verbindungen ergeben, und sie eignen sich weiter als Steuerungselemente, welche die Genexpression verbessern. Zu diesen wünschenswerten DNA-Sequenzen gehört unter anderem DNA, die für Enzyme codiert, welche eine Synthese von Antibiotikaderivaten katalysieren wie von De-
]5 rivaten von Streptomycin, Cephalosporin, Tylosin, Actaplanin, Narasin, Monensin, Apramycin oder Erythromycin, oder die für Enzyme codiert, welche eine Bioproduktion von Antibiotika und anderen Produkten erleichtern oder erhöhen. Die Möglichkeit zur Inserierung und Stabilisierung solcher DNA-Segmente ergibt daher eine Erhöhung der Ausbeute und Verfügbarkeit von Antibiotika, die durch Streptomyceten und damit verwandte Organismen gebildet werden.
Streptomyces granuloruber Nr. A39912.l3/pELlO3 kann auf verschiedene Art und Weise unter Einsatz mehrerer unterschiedlicher Medien gezüchtet werden. Solche Züchtungsmedien enthalten als Kohlenhydratquellen vorzugsweise Melasse, Glucose, Dextrin oder Glycerin, und als Stickstoffquellen unter anderem beispielsweise Sojabohnenmehl, Amin.osäuregemische oder Peptone. Ferner sind in solchen Medien auch noch übliche anorganische Nährsalze enthalten, beispielsweise Salze, die für Natrium, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Chlorid- und/oder Sulfationen sorgen. Weiter müssen derartige Kulturmedien auch noch essentielle Spurenelemente enthalten, wie sie auch für das Wachstum und die Entwicklung anderer Mikroorganismen notwendig sind. Derartige Spurenelemente werden normalerweise in Form von Verunreinigungen zugeführt, die in den anderen Bestandtei-
244037 0 -!β-
1 len des Mediums vorhanden sind
Streptomyces granuloruber Nr. A39912.13/pELlO3 wächst unter aeroben Züchtungsbedingungen innerhalb eines verhältnismäßig breiten pH-Bereichs von etwa 5 bis 9 bei Temperaturen zwischen etwa 15 und 400C. Zur Bildung des Plasmids pELlO3 in höchster Kopienzahl geht man zweckmäßigerweise von einem Kulturmedium mit einem pH-Wert von etwa 7,2 aus und führt die Züchtung in diesem Medium dann bei einer Temperatur von etwa 3O0C durch. Durch Züchtung von Streptomyces granuloruber Nr. A39912.13/pEL103 unter den oben.erwähnten Bedingungen gelangt man zu einem Zellvorrat, aus dem sich das Plasmid pELlO3 ohne weiteres isolieren läßt.
15 Ausführungsbeispiele:
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert.
Beispiell 20
Isolierung des Plasmids pELl03
A. Züchtung von Streptomyces granuloruber Nr. A39912.13/ PEL10 3
Ein vegetatives Inokulum von Streptomyces granuloruber Nr. A39912.13/pELl03 (NRRL 12549) wird in üblicher Weise hergestellt, indem man diesen Stamm unter submersen aeroben Bedingungen in 50 ml sterilisierter Trypticasesojabrühe mit 35 g/l in deionisiertem Wasser wachsen läßt.
Das Inokulum aus der Trypticasesojabrühe bebrütet man 48 Stunden bei einer Temperatur von 300C. Nach Abschluß der Bebrütung überträgt man etwa 10 ml des Inokulums in 500 ml der sterilisierten Brühe und inkubiert das Ganze etwa 20 Stunden bei 300C. Hierbei wird der pH-Wert nicht eingestellt. Nach erfolgter Inkubation erntet man die Zellen von Streptomyces granuloruber Nr. A39912.13/pELl03 und
244037 0
- 19 } isoliert dann das Plasmid DNA.
*) Trypticasesojabrühe = Trypticase soy broth von Difco Laboratories, Detroit, Michigan, V.St.A.
B. Isolierung des Plasmids
Man erntet etwa 12 g (Naßgewicht) Zellen von Streptomyces granuloruber Nr. A39912.13/pELlO3 durch Zentrifugieren (10 Minuten, 4°C, 10 000 U/min) des in obiger Weise erhaltenen Reaktionsgemisches. Die Zellen werden zuerst mit etwa 50 ml TES-Puffer (0,01M Tris(hydroxymethyl)aminoethan ,/Tris/, 0,001m EDTA, 34 % Saccharose, pH 8) versetzt, worauf man dann etwa 0,25 g Lysozym in 10 ml 0,25 molarer EDTA zugibt. Das Gemisch wird etwa 15 Minuten bei 37°C bebrütet und dann mit etwa 0,5 ml 10 %-igem Triton X-100 in TE-Puffer (0,01 Mol Tris, 0,001 Mol EDTA, pH 8) versetzt. Das erhaltene Gemisch wird hierauf etwa 50 Minuten bei 650C bebrütet. Nach Zentrifugieren (45 Minuten, 4°C, 18 000 U/min) des Lysats wird die überstehende Flüssigkeit viermal mit Isoamylalkohol und einmal mit einem Gemisch (24 : 1) aus Chloroform und Isoamylalkohol extrahiert. Die erhaltene wäßrige Phase wird dann zuerst mit etwa 0,5 ml 3 molarem Natriumacetat und dann mit 3 Volumina an kaltem (-200C) 95 %-igem Ethanol versetzt. Die Ausfällung mit Ethanol wird rasch in einem Bad aus Trockeneis und Ethanol durchgeführt, und die hierbei ausgefallene DNA wird abzentrifugiert (15 Minuten, 40C, 10 000 U/ min). Der Niederschlag wird unter Vakuum getrocknet und dann in 1,1 ml STE-Puffer (0,01 Mol Tris, 0,001 Mol EDTA, 0,01 Mol Natriumchlorid) resuspendiert. Zur Reinigung wird das Plasmid DNA dann unter Anwendung von Cäsiumchloridgradienten mit Ethidiumbromid zentrifugiert (40 Stunden, 15°C,35 000 U/min). Nach dem Zentrifugieren entfernt man die gewünschte Bande des Plasmids pEL103 DNA und extrahiert das Ethidiumbromid in üblicher Weise. Das nach Ausfällung der DNA in 3 Volumina Ethanol erhaltene Plasmid pELl03 DNA wird in 1 ml eines 10-fach verdünnten TE-
2U037 O.
Puffers gelöst und dann zur Aufbewahrung bei -2O0C eingefroren.
Konstruktion des Plasmids pLR2
A. Hiridlll Digestion von Plasmid pIJ6
Man bebrütet etwa 20 μΐ (20 μg) Plasmid pIJ6 DNA (Nature 286, 525 (1980)), 5 μΐ BSA (Rinderserumalbumin, 1 mg/ml), 19 μΐ Wasser, 1 μΐ HindIII Restriktionsenzym* (das 3 New England Bio Labs Einheiten enthält) und 5 μΐ Reaktionsmischung** 2 Stunden bei 370C. Sodann wird die Umsetzung durch Zugabe von etwa 50 μΐ 4 molarem Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol beendet. Der erhaltene Niederschlag an DNA wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet, in 20 μΐ TE-Puffer suspendiert und zur Aufbewahrung bei -200C eingefroren.
*) Solche Restriktionsenzyme sind von folgenden Firmen
erhältlich:
New England Bio Labs., Inc.
32 Tozer Road 25 Beverly, Massachusetts 01915, V.St.A.
Boehringer Mannheim Biochemicals 7941 Castleway Drive
Indianapolis, Indiana 46250, V.St.A. 30
Bethesda Research Laboratories Inc.
P.O. Box 577
Gaithersburg, Maryland 20760, V.St.A.
**) Diese Reaktionsmischung für das HindIII Restriktionsenzym wird ausgehend von folgender Zusammensetzung hergestellt: 600 mM NaCl
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1 100 mM Tris-HCl, pH 7,9 70 mM MgCl2 10 mM Dithiothreit
5 B. HindIII Digestion von Plasmid pBR322
Man bebrütet etwa 8 μΐ (4 μg) Plasmid pBR322 DNA, 5 μΐ Reaktionsmischung, 5 μΐ BSA (1 mg/ml), 31 μΐ Wasser und 1 μΐ HindIII Restriktionsenzym 2 Stunden bei 37°C. Nach Beendigung der Reaktion durch 10 Minuten langes Bebrüten bei 600C versetzt man das Ganze mit etwa 50 μΐ Ammoniumäcetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol. Der erhaltene Niederschlag an DNA wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in 45 μΐ Wasser suspendiert.
C. Ligation von HindIII Digestionsplasmiden pIJ6 und pBR32 2
Man bebrütet etwa 20 μΐ von mit HindIII behandeltem Plasmid pU6 (von Beispiel 2 A. ) , 20 μΐ von mit Rindl11 behandeltem Plasmid pBR322 (von Beispiel 2 B), 5 μΐ BSA (1 mg/ ml), 1 μΐ Τ4 DNA Ligase* und 5 μΐ Ligationsmischung** 4 Stunden bei 16°C. Die Umsetzung wird durch Zugabe von.etwa 50 μΐ 4 molarem Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol beendet. Der erhaltene Niederschlag an DNA wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in TE-Puffer suspendiert. Die suspendierte DNA bildet das gewünschte Plasmid pLR2.
*) <p4 DNA Ligase ist von folgender Quelle erhältlich: New England Bio Labs., Inc
32 Tozer Road Beverly, Massachusetts 01915, V.ST.A.
**) DiQ Ligationsmischung wird ausgehend von folgender Zusammensetzung hergestellt: 500 mM Tris-HCl, pH 7,8 200 mM Dithiothreit
24 4 0 37 G-"-
1 100 mM MgCl2
' 10 mM ATP
Konstruktion von E. coli K12 HBl01/pLR2
Man pelletisiert etwa 10 ml gefrorene leistungsfähige Zellen von E. coli K12 HBlOl (Gene 2, 75 bis 93 (1977))durch Zentrifugieren und suspendiert das Ganze dann in etwa 10 ml 0,01 molarem Natriumchlorid. Hierauf werden die Zellen erneut pelletisiert, in etwa 10 ml 0,03 molarer CaI-ciumchloridlösung resuspendiert, 20 Minuten auf Eis inkubiert, ein drittes Mal pelletisiert und schließlich in 1,25 ml 0,03 molarer Calciumchloridlösung resuspendiert. Die erhaltene Zellsuspension ist für eine anschließende Transformation leistungsfähig und geeignet.
Das Plasmid pLR2 in TE-Puffer (hergestellt gemäß Beispiel 2 C) wird in Ethanol ausgefällt, in 150 μΐ 30 millinolarer Calciumchloridlösung suspendiert und in einem Versuchsröhrchen mit etwa 200 μΐ der in obiger Weise erhaltenen leistungsfähigen Zellen von E. coli K12 HBlOl leicht durchmischt. Das erhaltene Gemisch inkubiert man zuerst etwa 45 Minuten auf Eis und dann etwa 1 Minute bei 42°C. Sodann versetzt man das Ganze mit etwa 3 ml L-'-Brühe (J. Bacteriology 62, 293 (1951)), die 50 μg/ml Ampicillin enthalt. Das Gemisch wird unter Schütteln 1 Stunde bei 37°C inkubiert und dann auf L-Agar aufgegeben (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York (1972 , Mil ler ).), der Ampicillin enthält.
Die überlebenden Kolonien werden selektiert und bezüglich
R S des erwarteten Phenotyps (Amp , Tet ) untersucht, und sie stellen dann die gewünschten Transforrnanten E. coli K12 HBl01/pLR2 dar.
244037 O
1' Beispiel 4 Konstruktion des Plasmids pLRl
Unter Anwendung der in Beispiel 2A bis C beschriebenen Arbeitsweise stellt man das Plasmid pLRl her, wobei man anstelle des Plasmids pIJ6 hier jedoch das Plasmid pIJ2 (Nature 286, 525 (1980)) verwendet. Das gewünschte Plasmid pLRl wird in TE-Puffer suspendiert. 10
Konstruktion von E. coli K12 HBlOl/pLRl
Die gewünschte Konstruktion wird unter Anwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens durchgeführt, wobei man anstelle des Plasmids pLR2 hier zur Transformation jedoch das Plasmid pLRl verwendet. Die überlebenden Kolonien werden selektiert und bezüglich des erwarteten Phenotyps (Amp , Tet ) untersucht, und sie stellen die gewünschten Transformanten E. coli Kl2 HBlOl/pLRl dar.
Beispiel6 25 Konstruktion des Plasmids pLR4
A. BamHI-Partia!digestion des Plasmids pLRl
Man inkubiert etwa 10 μΐ (10 μg) des Plasmids pLRl, 5 μΐ BSA (1 mg/ml), 29 μΐ Wasser, 1 μΐ BamHI Restriktionsenzym (•mit Wasser auf 1 : 4 verdünnt) und 5 μΐ Reaktionsmischung* 15 Minuten bei 370C. Die Umsetzung wird durch Zugabe von etwa 50 μΐ 4 molarem Amir.oniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol beendet. Der erhaltene Niederschlag an DNA wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in 20 μΐ Wasser suspendiert.
*) Die Reaktionsmischung für das Elam'HI Restriktionsenzym
I k A U 3 /
1 wird aus folgender Zusammensetzung hergestellt: 1,5 M NaCl 60 mM Tris-HCl, pH 7,9 60 mM MgCl2
B. BamHI Digestion des Plasmids pBR322
Die gewünschte Digestion wird praktisch wie in Beispiel
2 B beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle von
Hindill Restriktionsenzym hier jedoch BamHI Restriktionsenzym verwendet. Das dabei erhaltene digestierte Plasmid pBR322 wird in 29 μΐ Wasser suspendiert.
C. Ligation von partiell mit BamHI digestiertem Plasmid pLRl und von mit BamHI digestiertem Plasmid pBR322
Die gewünschte Ligation wird wie in Beispiel 2 C beschrieben durchgeführt. Die dabei erhaltene ligierte DNA wird in TE-Puffer suspendiert und stellt das gewünschte Plasmid pLR4 dar.
Konstruktion von E. coli K12 HBl01/pLR4
Die gewünschte Konstruktion wird praktisch wie in Beispiel
3 beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle des Plasmids pLR2 zur Transformation jedoch das Plasmid pLR4 verwendet.
Die überlebenden Kolonien werden selektiert und bezüglich
R S des erwarteten Phenotype (Amp , Tet ) untersucht, und sie stellen die gewünschten Transformanten E. coli K12 HBlOl/ pLR4 dar.
244037 0
- 25 1 Beispiel 8
Konstruktion der Pläsmide pEL107, pEL105, pELlO8 und pEL104
A. BamHI Digestion des Plasmids pLR2 und Isolierung des 1.6 kb Thiostreptonresistenz-Übej-cragungsf ragments
Man inkubiert etwa 50 μg Plasmid pLR2 DNA, 10 μΐ Reaktionsmischung, 10 μΐ BSA (1 mg/ml), 29 μΐ Wasser und 1 μΐ (4 Einheiten/μΐ) BamHI Restriktionsenzym 2 Stunden bei 37°C. Das Reaktionsgemisch wird dann mit einem gleichen Volumen an 4 molarem Ammoniumacetat und mit 2,5 Volumina an 95 %-igem Ethanol versetzt, worauf man das Ganze zur Ausfällung der DNA etwa 18 Stunden auf -200C kühlt. Die ausgefallene DNA wird abzentrifugiert und in etwa 50 μΐ TE-Puffer suspendiert. Das gewünschte 1.6 kb BamHI Restriktionsfragment wird aus der DNA-Suspension durch übliche Gelelektrophorese isoliert. Nach erfolgter Isolierung wird das Fragment zur anschließenden Ligation in etwa 20 μΐ TE-Puffer
20 resuspendiert.
B. BamHI Partialdigestion des Plasmids pELlO3
Man inkubiert etwa 20 μg Plasmid pELl03 DNA, 10 μΐ Reaktionsmischung, 10 μΐ BSA (1 mg/ml), 39 μΐ Wasser und 1 μΐ BamHI Restriktionsenzym (hergestellt durch Verdünnung von 2 μΐ Enzym in 8 μΐ Wasser) etwa 15 Minuten bei Umgebungstemperatur. Nach Zugabe eines gleichen Volumens an 4 molarem Ammoniumacetat und von 5 Volumina an 95 %-igem Ethanol kühlt man das Gemisch zur Ausfällung der DNA etwa 18 Stunden auf -200C. Der Niederschlag an DNA wird abzentrifugiert, mit 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und dann in etwa 50 μΐ TE-Puffer suspendiert.
35 C. Ligation
Ein Gemisch aus etwa 20 μg des partialdigestierten Plasmids pEL103 DNA, 10 μg des 1.6 kb BamHI Restriktionsfrag-
244037 0
] ments des Plasmids pLR2, 5 μΐ der Ligationsmischung, 5 μΐ BAS (1 mg/ml), 10 μΐ Wasser und 1 μΐ T4 DNA Ligase wird etwa 4 Stunden bei etwa 160C bebrütet. Nach Zugabe von
40 μΐ 4 molarem Ammoniumacetat und 200 μΐ kaltem Ethanol kühlt man das Reaktionsgemisch zur Ausfällung der DNA etwa 18 Stunden auf -2O0C. Der Niederschlag an DNA wird abzentrifugiert, mit 70 %-igem Ethanol gewaschen, erneut zentrifugiert und dann in 50 μΐ Medium P (J. Molecular and General Genetics 162, 307 (1978)) zur anschließenden Transformation suspendiert.
Abhängig davon, welches der möglichen pELlO3 Restriktionsfragmente an das 1.6 kb BamHI Thiostreptonresistenz-Übertragungsfragment ligiert wird, erhält man wenigstens zwei Arten an rekombinierenden Plasmiden. Die Ligation an das 2.8 kb BamHI Restriktionsfragment des Plasmids pEL103 führt daher zu den 4.4 kb Plasmiden pELlO7 und pELlO5, während sich durch Ligation an das 19.9 kb BamHI Fragment (linearisiertes pELlO3) die 21.5 kb Plasmide pELlO8 und
pELlO4 ergeben. Ferner werden auch die Insertionsisomeren der Plasmide pEL108 und pEL104 gebildet, da das Plasmid pEL103 über drei BamHI Restriktionsstellen für die Insertion des Fragments für die Thiostreptonresistenz verfügt. Das 1.6 kb BamHI Resistenz-Übertragungsfragment kann in
eine von zwei Richtungen orientiert sein, und infolgedessen ergeben sich rekombinante Plasmide mit zwei Orientierungen. Die Restriktionsstellenpläne und die Funktionspläne für jedes der Plasmide pEL107 und pELlO5 und für die Plasmide pELlO8 und pELlO4 gehen aus den Fig. 5 und 6 der
30 Zeichnung hervor.
Durch BamHI Teildigestion des Plasmids pELlO3 ergibt sich selbstverständlich ein Gemisch aus verschiedenen Restriktionsfragmenten, die entweder miteinander ligiert oder mit ein oder mehreren Resistenz verleihenden DNA-Fragmenten ligiert werden können, wodurch mehrere weitere rekombinierende Plasmide gebildet werden. Jedes dieser weiteren Plasmide, das den 2.8 kb BamHI Ursprung des replika-
244037 0
tionshaltigen Fragments enthält, ist funktional und gehört daher zur Erfindung. Die oben erwähnten weiteren Plasmide lassen sich in herkömmlicher Weise in geeignete Wirtszellen transformieren, und sie können dann jeweils durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese identifiziert werden.
Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pELlO7, S. ambofaciens/pELlO5, S. ambofaciens/pELlO8 und S. ambofaciens/ PEL104
Unter Verwendung von etwa 20 μg der DNA von Beispiel 8C
9 und von 1 χ 10 Protoplasten von Streptomyces ambofaciens (NRRL 2420) führt man die gewünschte Konstruktion unter Anwendung des in Beispiel 2 von WO-OS 79/01169 beschriebenen Verfahrens durch. Die gewünschten Transformanten werden hinsichtlich ihrer Thiostreptonresistenz selektiert, indem man die regenerierten Protoplasten mit einer ein R2-Medium (Molecular and General Genetics 162, 30 (1978)) enthaltenden Agardeckschicht überschichtet, die so viel Thiostrepton enthält, daß sich auf der fertigen Platte eine Konzentration von 50 μg/ml ergibt. Die dabei erhaltenen thiostreptonresistenten Kolonien von Streptomyces arnbofaciens/pELlO7, S. ambofaciens/pELlO5, S. ambofaciens/pELlO8 und S. ambofaciens/pELlO4 werden in bekannter Weise isoliert, gezüchtet und dann in herkömmlicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese identifi-
30 ziert.
244037 0
- 28 1 B e i s ρ i e 1 10
Konstruktion der Plasmide pELl09, pELllO, pELlll und pELll2
A. BamHI Digestion des Plasmids pLRl und Isolierung des 3.4 kb Neomycinresistenz-iJbertragungsfragments
Die gewünschte Digestion und Isolierung wird praktisch wie
in Beispiel 8A beschrieben durchgeführt. Das 3.4. kb BamHI
Restriktionsfragment wird zur anschließenden Ligation in etwa 20 μΐ TE-Puffer suspendiert.
B. Ligation
Das 3.4 kb BamHI Neomycinresistenz-Übertragungsrestriktionsfragment wird an mit BamHI partialdigestiertes Plasmid pELl03 (hergestellt gemäß Beispiel 8B) unter Anwendung des in Beispiel 8C beschriebenen Verfahrens ligiert.
Abhängig davon, welches der möglichen pELl03 Restriktionsfragmente an das 3.4 kb BamHI Neomycinresistenz-Übertragungsfragment ligiert wird, erhält man wenigstens zwei Arten an rekombinierenden Plasmiden. Die Ligation an das 2.8 kb BamHI Restriktionsfragment des Plasmids pELlO3 führt daher zu den 6.2 kb Plasmiden pELlO9 und pELllO, während sich durch Ligation an das 19.9 kb BamHI Fragment (linearisiertes pEL103) die 23.3 kb Plasmide pELlll und pELll2 ergeben. Ferner werden auch die Insertionsisomeren der Plasmide pELlll und pEL112 gebildet, da das Plasmid pELlO3 über drei BamHI Restriktionsstellen für die Insertion des Fragments für die Neomycinresistenz verfügt. Das 3.4 kb BamHI Resistenz-Übertragungsfragment kann in eine von zwei Richtungen orientiert sein, und infolgedessen ergeben sich rekombinante Plasmide mit zwei Orientierungen. Die Restriktionsstellenpläne und die Funktionspläne für jedes der Plasmide pELlO9 und pELllO und für die Plasmide pELlll und pELll2 gehen aus den Fig. 7 und 8 der Zeichnung
24 4 03 7 0 -»- 1 hervor.
Genauso wie bei Beispiel 8C lassen sich auch hier selbstverständlich weitere rekombinierende Plasmide bilden, die den 2.8 kb BamHI Ursprung des replikationshaltigen Frag-. ments enthalten. Diese Plasmide sind funktional und stellen daher weitere erfindungsgemäße Beispiele dar. Diese weiteren Plasmide können in üblicher Weise transformiert und dann durch Restriktionsenzymanalyse sowie Gelelektrophorese identifiziert werden.
Beispiel 11
Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pEL109, S. ambofaciens/pELl10, S. ambofaciens/pELlll und S. ambofaciens/ pELH2
Unter Verwendung von etwa 20 μg der DNA von Beispiel 10
und von 1 χ 10 Protoplasten von Streptomyces ambofaciens (NRRL 2420) führt man die gewünschten Konstruktionen unter Anwendung des in Beispiel 2 von WO-OS 79/01169 beschriebenen Verfahrens durch. Die gewünschten Transformanten werden bezüglich ihrer Neomycinresistenz selektiert, indem man die regenerierenden Protoplasten mit R2 Medium Deckagar überschichtet, der so viel Neomycin* enthält, daß sich auf der fertigen Platte eine Konzentration von 1 |jg/ml ergibt.
Die erhaltenen neomycinresistenten Kolonien von Streptomyces ambof aciens/pEL109, S. ambof aciens/pEll 10, S. arnbofaciens/pELl11 und S. ambofaciens/pELl12 werden unter Anwendung üblicher Verfahren isoliert und dann in herkömmlicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse sowie Gelelektrophorese identifiziert
35
*) Das Antibiotikum Neomycin ist von Sigma, St. Louis, Missouri, V.St.A. erhältlich.
244 037
W _ 30 -
} Beispiel 12
Konstruktion der Plasmide pEL113 und pELll4
Das Plasmid pEL107 wird aus Streptomyces ambofaciens/pELlO7 (hergestellt gemäß Beispiel 9) unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens isoliert und dann nach dem in Beispiel 8B beschriebenen Verfahren einer Teildigestion mit BamHI Restriktionsenzym unterzogen. Das teildigestierte BamHI wird hierauf nach dem in Beispiel 8C beschriebenen Verfahren mit dem 3.4 kb großen und für eine Neomycinresistenz sorgenden BamHI Fragment (hergestellt gemäß Beispiel 10A) des Plasmids pLRl ligiert, wodurch man zu den gewünschten Plasmiden gelangt. Bei diesem Verfahren werden auch die Insertionsisomeren der Plasmide PEL113 und pELll4 gebildet, da das Plasmid pEL108 zwei BamHI Restriktionsstellen für die Insertion des die Neomycinresistenz ergebenden Fragments hat. Weiter, ergeben sich hierbei rekombinante Plasmide mit zwei Orientierungen, weil das für die Neomycinresistenz verantwortliche 3.4 kb BamHI Fragment in eine von zwei Richtungen orientiert sein kann. Die Restriktionsstellenpläne und die Funktionspläne für die Plasmide pELll3 und pELll4 gehen aus Fig. 9 der Zeichnung hervor.
Beispiel 13
Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pELll3 und S. ambofaciens/pELl14 30
Unter Verwendung von etwa 20 μg der DNA von Beispiel 12
und von 1x10 Protoplasten von Streptomyces ambofaciens (NRRL 2420) führt man die gewünschten Konstruktionen unter Anwendung des in Beispiel 2 von WO-OS 79/01169 beschriebenen Verfahrens durch. Die gewünschten Transformanten werden zuerst hinsichtlich ihrer Thiostreptonresistenz und dann bezüglich ihrer Neomycinresistenz nach den in den Beispielen 9 und 11 beschriebenen Methoden selektiert. Die
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erhaltenen thiostreptonresistenten und neomycinresistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pELl13 und S. ambofaciens/pELl14 werden unter Anwendung bekannter Verfahren isoliert und in üblicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse sowie Gelelektrophorese identifiziert.
Beispiel 14
Konstruktion der Plasmide pEL115 und pELll6
Die gewünschten Plasmide werden praktisch wie in Beispiel 12 beschrieben konstruiert, wobei man bei der BamHI Partialdigestion anstelle des Plasmids pEL107 hier jedoch das Plasmid pELlO5 verwendet. Bei diesem Verfahren werden auch die Insertionsisomeren der Plasmide pELll5 und pELll6 gebildet, weil das Plasmid pELlO5 über zwei BamHI Restriktionsstellen für die Insertion des die Neomycinresistenz ergebenden Fragments verfügt. Ferner ergeben sich rekombinierende Plasmide mit zwei Orientierungen, da das für die Neomycinresistenz verantwortliche 3.4 kb BamHI Fragment in eine von zwei Richtungen orientiert sein kann. Die Restriktionsstellenpläne und die Funktionspläne für die Plasmide pELH5 und pELll6 gehen aus der Fig. 10 der Zeichnung hervor.
Beispiel 15
Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pEL115 und S.
ambofaciens/pELl16 30
Unter Verwendung von 20 μg der DNA von Beispiel 14 führt man die gewünschten Konstruktionen praktisch wie in Beispiel 13 beschrieben durch. Die erhaltenen thiostreptonresistenten und neomycinresistenten Kolonien von Strepto-0^ myces ambofaciens/pELl15 und S. ambofaciens/pELll6 werden nach bekannten Verfahren isoliert und dann in herkömmlicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse sowie Gelelektrophorese identifiziert.
244037 0 -32-
1 Beispiel 16
Konstruktion der Plasmide pELll7 und pELH8 und der Plasmide pELH9 und pEL120
Die gewünschten Plasmide werden unter Anwendung der in den Beispielen 12 und 14 beschriebenen Verfahren konstruiert, wobei man für die BamHI Teildigestionen anstelle der Plasmide pELlO7 und pEL105 hier jedoch die Plasmide pELlO8 und pELlO4 verwendet. Bei diesem Verfahren werden zusätzlich auch die Insertionsisomeren der Plasmide pELll7, pELll8, pEL119 und pELl20 gebildet, da die Plasmide pELlO8 und pELlO4 drei BamHI Restriktionsstellen für die Insertion des die Neomycinresistenz ergebenden Fragments enthalten. Zugleich entstehen rekombinante Plasmide mit zwei Orientierungen, weil das für die Neomycinresistenz verantwortliche 3.4 kb BajnHI Fragment in eine von zwei Richtungen orientiert sein kann. Die Restriktionsstellenpläne und die Funktionspläne für die Plasmide pELll7 und pELllß sowie die Plasmide pELll9 und pEL120 gehen aus den Fig. 11 und 12 der Zeichnung hervor.
Beispiel 17
Konstruktion von Streptomyces ambof ciciens/pELl 17 und S. ambofaciens/pEL 118 sowie Streptomyces ambofaciens/ pELH9 und S. ambofaciens/pEL120
Unter Anwendung der in den Beispielen 13 und 15 beschriebenen Maßnahmen transformiert man etwa 20 μg des jeweiligen Plasmids pELH7, pELll8, pELH9 und pELl20 DNA Gemisches von Beispiel 16 in Streptomyces ambofaciens. Die dabei erhaltenen thiostreptonresistenten und neomycinresistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pELl17, S. ambofaciens/pEll18, S. ambofaciens/pELll9 und S. ambofaciens/pELl20 werden nach bekannten Verfahren isoliert und in herkömmlicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse sowie Gelelektrophorese identifiziert.
244037 O -33-1 Beispiel 18
Konstruktion der Chimären Plasmide pELl21 und pELl22
Zur Bildung der gewünschten chimärem Plasmide ligiert man ein BamHI Teildigestionsprodukt des Plasmids pELlO7 an mit BamHI digestiertes Plasmid pBR322 praktisch nach dem in Beispiel 8C beschriebenen Verfahren. Zur Isolierung des Plasmids pEL107 aus Streptomyces ambofaciens/pELlO7 (hergestellt gemäß Beispiel 9) geht man praktisch wie in Beispiel 1 beschrieben vor, und dieses Plasmid unterzieht man dann einer B_amHI Teildigestion nach dem in Beispiel 8B beschriebenen Verfahren. Das mit BamHI digestierte Plasmid pBR322 wird praktisch wie in Beispiel 2B beschrieben hergestellt, wobei man anstelle von Hindlll Restriktionsenzym hier jedoch das BamHI Restriktionsenzym verwendet. Das gewünschte Chimäre Plasmid DNA wird durch Zentrifugieren gesammelt, mit 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und dann in 50 μΐ TE-Puffer suspendiert. Bei obigem Verfahren werden zusätzlich auch noch die Insertionsisomeren der Plasmide pEL121 und pEL122 gebildet, weil das Plasmid pEL107 über zwei BamHI Restriktionsstellen für die Insertion des restriktierten Plasmids pBR322 verfügt. Ferner ergeben sich auch rekombinante Plasmide mit zwei Orientierungen, da das restriktierte Plasmid pBR322 in eine von zwei Richtungen orientiert sein kann. Die Restriktionsstellenpläne und die Funktionspläne für die Plasmide pELl21 und pELl22 gehen aus Fig. 13 der Zeichnung hervor.
Beispiel 19
Konstruktion von E. coli K12 HBl01/pELl21 und E. coli K12
HB/pELl22 35
Die gewünschten Konstruktionen werden praktisch wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß man anstelle des Plasmids pLR2 für die Transformation hier
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die Plasmide pELl21 und pELl22 verwendet. Die überlebenden Kolonien werden zuerst selektiert und hinsichtlich des er-
R S warteten Phenotype (Amp , Tet ) untersucht, worauf man die
. gewünschten Transformanten von E. coli K12 HBl01/pELl21 und E. coli K12 HBl01/pELl22 in üblicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse sowie Gelelektrophorese identifi-. ziert.
Beispiel 20 10
Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pELl21 und S. ambofaciens/pELl2 2
Die gewünschten Konstruktionen werden praktisch wie in Beispiel 9 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß man anstelle der Plasmide pEL107, pELlOS, pELlO8 und pELlO4 für die Transformation hier die Plasmide pELl21 und pELl22 verwendet. Die erhaltenen Transformanten werden bezüglich ihrer Thiostreptonresistenz nach dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren selektiert. Die hierdurch konstruierten thiostreptonresistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pELl21 und S. ambofaciens/pELl22 werden nach bekannten Methoden isoliert und in herkömmlicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse sowie.Gelelektrophorese* identifiziert.
Beispiel 21
Konstruktion des Plasmids pFJl24 30
A. BamHI (Partialdigestion) und Bell Digestion des Plasmids pEL105
Man inkubiert etwa 20 μg Plasmid pEL105 DNA, 10 μΐ Reaktionsmischung, 10 μΐ BSA (1 mg/ml), 39 μΐ Wasser und 1 μΐ BamHI Restriktionsenzym (hergestellt durch Verdünnung von 2 μΐ Enzym in 8 μΐ Wasser) etwa 15 Minuten bei Umgebungstemperatur. Das Reaktionsgemisch wird mit einem gleichen
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Volumen an 4 molarem Ammoniumacetat und mit 2 Volumina an 95 %-igem Ethanol versetzt und dann zur Ausfällung der DNA etwa 18 Stunden auf -200C gekühlt. Der Niederschlag an DNA wird abzentrifugiert, in 70 %-igem Ethanol gespült, unter Vakuum getrocknet und dann in etwa 20 μΐ TE-Puffer suspendiert. Das nach Zugabe von 5 μΐ Bell Reaktionsmischung*, 10 μΐ BSA (1 mg/ml), 39 μΐ Wasser und 1 μΐ Bell Restriktionsenzym (das einen Überschuß an New England Bio Lab-Einheiten enthält) erhaltene Reaktionsgemisch wird etwa 60 Minuten bei 500C bebrütet. Hierauf wird das Reaktionsgemisch mit einem gleichen Volumen an 4 molarem Ammoniumacetat und mit 5 Volumina an 95 %-igem Ethanol versetzt und dann zur Ausfällung der DNA etwa 18 Stunden auf -200C gekühlt. Der Niederschlag an DNA wird abzentrifugiert, in 70 %-igem Ethanol gespült, unter Vakuum getrocknet und dann in etwa 50 μΐ TE-Puffer suspendiert.
*} Die Reaktionsmischung für das Bell Restriktionsenzym wird unter Verwendung folgender Zusammensetzung hergestellt:
750 mM KCl
60 mM Tris-HCl, pH 7,4 100 mM MgCl2
10 mM Dithiothreit 25
B. Ligation .
Ein Gemisch von etwa 20 μg teildigestiertem Plasmid pLlO5 DNA, 5 μΐ Ligationsmischung, 5 μΐ BSA (1 mg/ml), 10 μΐ Wasser und 1 μΐ T4 DNA Ligase wird etwa 4 Stunden bei etwa 16°C bebrütet. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird mit 40 μΐ 4 molarem Ammoniumacetat und 200 μΐ kaltem Ethanol versetzt und dann zur Ausfällung der DNA etwa 18 Stunden auf -20°C gekühlt. Die ausgefallene DNA wird abzentrifugiert, mit 70 %-igem Ethanol gewaschen, erneut gesammelt und dann zur nachfolgenden Transformation in 50 μΐ Medium P suspendiert.
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Durch BamHI und Bell Teildigestion des Plasmids pELlOS entsteht selbstverständlich ein Gemisch aus Fragmenten, die selbst ligiert oder aneinander ligiert sein können, so daß mehrere weitere Plasmide gebildet werden. Das gewünschte Plasmid pFJl24 kann zusammen mit den erwähnten weiteren Plasmiden in geeignete Wirtszellen transformiert werden, und es läßt sich durch herkömmliche Restriktionsenzymanalyse sowie Gelelektrophorese identifizieren.
10 Beispiel 22
Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pFJl24
Die gewünschte Konstruktion wird praktisch wie in Beispiel 9 beschrieben durchgeführt, wobei statt der DNA von Beispiel 21 hier jedoch die DNA von Beispiel 8C verwendet wird. Die erhaltenen thiostreptonresistenten Transformantenkolonien werden in bekannter Weise isoliert, gezüchtet und dann durch übliche Restriktionsenzymanalyse sowie Gelelektrophorese identifiziert. Die gewünschten Transformanten von Streptomyces ambofaciens/pFJl24 werden hierauf zur Bildung und Isolierung des Plasmids pFJl24 bekannten Verfahren unterzogen. Der Restriktionsstellenplan für das ~4.0 kb .Plasmid pFJl24 geht aus Fig. 14 der Zeichnung hervor.
Beispiel 23
Konstruktion der Plasmide pFJ144 und pFJl45 30
A. BamHI Digestion des Plasmids pFJ124
Die Digestion wird praktisch wie in Beispiel 8A beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle des Plasmids pLR2 hier jedoch das Plasmid pFJl24 verwendet. Der erhaltene Niederschlag an DNA wird in etwa 50 μΐ TE-Puffer suspendiert und stellt das gewünschte BamHI Verdauungsprodukt dar.
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- 37 1 B. Ligation
Das für die Neomycinresistenz verantwortliche 3.4 kb BamHI Restriktionsfragment (hergestellt gemäß Beispiel 10A) wird u-nter Anwendung des in Beispiel 8C beschriebenen Verfahrens an das mit BamHI digestierte Plasmid pFJl24 ligiert. Hierbei ergeben sich rekombinante Plasmide mit zwei Orientierungen, weil das Resistenz übertragende 3.4 kb BamHI Fragment in eine von zwei Richtungen orientiert sein kann. Die Plasmide pFJl44 und pFJl45 lassen sich in üblicher Weise in entsprechende Wirtszellen transformieren, und sie können durch bekannte Restriktionsenzymanalyse sowie Gelelektrophorese identifiziert werden.
15 Beispiel 24
Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pFJ144 und S. ambofaciens/pFJl45
Die gewünschten Konstruktionen werden praktisch wie in Beispiel 11 beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle der DNA von Beispiel 10 hier jedoch die DNA von Beispiel 23 verwendet. Die erhaltenen neomycinresistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pFJ144 und S.ambofaciens/ pFJ145 werden in bekannter Weise isoliert, gezüchtet und bezüglich ihrer Thiostreptonresistenz untersucht, wobei man sie dann durch herkömmliche Restriktionsenzymanalyse sowie Gelelektrophorese identifiziert. Die Transformanten werden dann in üblicher Weise gezüchtet, um hierdurch die
JW Plasmide pFJl44 und pFJl45 zu bilden und zu isolieren. Die Restriktionsstellenpläne für die ^7.4 kb Pläsmide pFJl44 und pFJl45 gehen aus Fig. 14 der Zeichnung hervor.
Beispiel 25 35
Konstruktion des Plasmids pFJl46
Die gewünschte Konstruktion wird praktisch wie in Beispiel
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ι 21 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß es sich bei beiden Digestionen um Partialdigestionen handelt, und daß man anstelle des Plasmids pELlO5 hier das Plasmid pFJl44 verwendet. Der erhaltene Niederschlag an DNA wird abzentrifugiert, mit 70 %-igem Ethanol gewaschen, erneut gesammelt und dann für die anschließende Transformation in 50 μΐ Medium P suspendiert. Der Restriktionsstellenplan für das Plasmid pFJl46 geht aus Fig. 15 der Zeichnung hervor
10
Beispiel 26
Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pFJl46
Die gewünschte Konstruktion wird praktisch wie in Beispiel 11 beschrieben durchgeführt, wobei statt der DNA von Beispiel 10 hier, jedoch das Plasmid pFJl46 verwendet wird.
Beispiel 27 20
Konstruktion des Plasmids pFJl47
A, Züchtung von E. coli 803/pIJ43 und Isolierung des
Plasmids pIJ43 25
Die gewünschte Züchtung von E. coli 803/pIJ43 (ATCC 39156) und die anschließende Isolierung des Plasrnids pIJ43 führt man jeweils unter Anwendung des von R.W. Davis in A Manual For Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics, Cold °^ Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York
(1980) beschriebenen Verfahrens durch. Die erhaltene pIJ43 DNA wird in üblicher Weise in TE-Puffer suspendiert und zur Aufbewahrung dann bei -200C gekühlt.
B. Digestion und Isolierung des ~2.7 kb SaJLJ-Bc[IJI Fragments des Plasmids pIJ43
Die gewünschte Digestion wird praktisch wie in Beispiel 21
24 4 0 3 7 0
beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon jedoch das Plasrnid pIJ43, das Sail Restriktionsenzym und die Reaktionsmischung*, und das BgIII Restriktionsenzym sowie das Restriktionsgemisch** verwendet und nicht das Plasmid pEL105, das BamHI Restriktionsenzym und die dort genannte Reaktionsmischung oder das Bell Restriktionsenzym und die dort erwähnte Reaktionsmischung. Die Sail Digestion ist hierbei zudem eine Partialdigestion. Die erhaltenen SaII-BgIII Fragmente werden abgetrennt und durch übliche Gelelektrophorese (gemäß R.W. Davis in A Manual For Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1980) isoliert.
C. BamHI Digestion und Sail Partialdigestion des Plasmids PFJ124
Man inkubiert etwa 20 μg Plasmid pFJl24 DNA, 10 μΐ BSA (1 mg/ml), 39 μΐ Wasser, 1 μΐ BamHI Restriktionsenzym (mit einem Gehalt an überschüssigen New England Bio Lab Einheiten) und 10 μΐ Reaktionsmischung 60 Stunden bei 37°C. Das Reaktionsgemisch wird dann 10 Minuten bei 650C bebrütet, auf 40C abgekühlt, mit 10 μΐ Sail Reaktionsmischung * sowie mit 1 μΐ Sail Restriktionsenzym (mit einem Gehalt an überschüssigen New England Bio Lab-Einheiten) ergänzt und dann wiederum etwa 60 Minuten bei 370C inkubiert. Hierauf wird das Reaktionsgemisch mit einem gleichen Volumen an 4 molarem Ammoniumacetat und mit 2 Volumina an 95 %-igem Ethanol versetzt und zur Ausfällung der DNA etwa 18 Stunden auf -200C gekühlt. Die ausgefallene DNA wird abzentrifugiert, in 70 %-igem Ethanol gespült, unter Vakuum getrocknet und dann in etwa 50 μΐ TE-Puffer suspendiert,
*) Die Reaktionsmischung für das Sail Restriktionsenzym wird ausgehend von folgender Zusammensetzung hergestellt: 1,5 M NaCl
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60 mM Tris-HCl, pH 7,9
60 mM MgCl-
60 mM ß-Mercaptoethanol 1 mg/ml BSA 5
**) Die Reaktionsraischung für das BglII Restriktionsenzym wird ausgehend von folgender Zusammensetzung hergestellt: 0,6 M NaCl
100 mM Tris-HCl, pH 7,4 100 mM MgCl2
100 mM ß-Mercaptoethanol 1 mg/ml BSA
15 D. Ligation
Das 2.7 kb Sail-BgIII Fragment des Plasmids pIJ43 wird unter Anwendung des in Beispiel 8C beschriebenen Verfahrens an das BamHI Partial-SaII-Digestionsprodukt des Plasmids
pFJl24 ligiert. Der erhaltene Niederschlag an DNA wird abzentrifugiert, mit 70 %-igem Ethanol gewaschen, erneut gesammelt und dann zur anschließenden Transformation in 50 μΐ Medium P suspendiert. Der Restriktionsstellenplan für das Plasmid pFJ147 geht aus Fig. 15 der Zeichnung her-
25 vor.
Beispiel 28
Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pFJl47 30
Die gewünschte Konstruktion wird praktisch wie in Beispiel 9 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß man anstelle der DNA von Beispiel 8C hier das Plasmid pFJl47 (hergestellt gemäß Beispiel 27) verwendet. Die gewünschten ··" Transformanten werden hinsichtlich ihrer Erythromycinresistenz selektiert, indem man die regenerierten Protoplasten mit R2 Medium Deckagar überschichtet, der so viel Erythromycin enthält, daß die Platte eine Konzentration von 50 j..ig
2U037 O
pro ml aufweist. Die erhaltenen erythromycinresistenten Kolonien werden bezüglich ihrer Thiostreptonresistenz untersucht und bilden die gewünschten Transformanten von Streptomyces ambofaciens/pFJl47. Ihre Identität wird durch herkömmliche Restriktionsenzymanalyse sowie Gelelektrophorese weiter bestätigt.
Beispiel 29 Konstruktion der Plasmide pFJ148 und pFJl49
A. Teil-SalI-Digestion des Plasmids pIJ43
Die gewünschte Digestion wird praktisch wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß man hierzu das Plasmid pIJ43, das Sail Restriktionsenzym und die Reaktionsmischung verwendet, anstelle des Plasmids pLRl, des BamHI Restriktionsenzyms und der Reaktionsmischung. Die dabei erhaltenen Sail Teilfragmente werden abgetrennt und durch übliche Gelelektrophorese mittels Agar isoliert. Das gewünschte Sail Fragment hat eine Größe von ~2.8 kb.
B. Teil-SaII-Digestion des Plasmids pFJl24
Die gewünschte Digestion wird praktisch wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß man hier das Plasmid pFJl24, das Sail Restriktionsenzym und die Reaktionsmischung verwendet, und nicht das dortige Plasmid pLRl, das BamHI Restriktionsenzym und die Reaktionsmischung. Der erhaltene Niederschlag an DNA wird ab'zentrifugiert, in 70 %-igem Ethanol gespült,unter Vakuum getrocknet und dann in etwa 50 μΐ TE-Puffer suspendiert.
C. Ligation 35
Das /-2.8 kb Sal I Fragment des Plasmids pIJ43 wird praktisch nach dem in Beispiel 8C beschriebenen Verfahren an das Sail Partialdigestionsprodukt des Plasmids pFJl24 Ii-
2.4 4 03 7 0
] giert. Der erhaltene Niederschlag an DNA wird abzentrifugiert, mit 70 %-igem Ethanol gewaschen, erneut gesammelt und dann zur anschließenden Transformation in 50 μΐ Medium P suspendiert.
Die sich ergebenden rekombinierenden Plasmide -haben' zwei Orientierungen, weil das —2.8 kb Sail Fragment in eine von zwei Richtungen orientiert sein kann. Die Plasrnide pFJl48 und pFJ149 lassen sich in üblicher Weise in geeignete Wirtszellen transformieren und können dann durch Restriktionsenzymanalyse sowie Gelelektrophorese identifiziert werden.
Beispiel 30 15
Kontruktion von Streptomyces ambofaciens/pPJl4 8 und S. ambofaciens/pFJl4 9
Die gewünschten Konstruktionen werden praktisch wie in Beispiel 9 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß man anstelle der DNA von Beispiel BC hier die DNA von Beispiel 29C verwendet. Die gewünschten Transformanten werden bezüglich ihrer Erythromycinresistenz selektiert, indem man die regenerierenden Protoplasten mit R2 Medium Deckagar überschichtet, der so viel Erythromycin enthält, daß sich auf der Platte eine Konzentration von 50 pg/rni ergibt. Die erhaltenen erythromycinresistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pFJ148 und S. ambofaciens/ pFJl49 werden nach bekannten Verfahren isoliert, gezüchtet und bezüglich ihrer Thiostreptonresistenz untersucht, worauf man sie durch übliche Restriktionsenzymana]yse sowie Gelelektrophorese identifiziert. Die gewünschten Transformanten werden dann in herkömmlicher Weise gezüchtet, wodurch man nach entsprechender Isolierung zu den Plasmiden pFJl48 und pFJ149 gelangt. Die Restriktionsstellenpläne dieser Plasmide pFJl4 8 und pFJl4 9 gehen aus Fig. der Zeichnung hervor.
244037 0 _43_ lBeispiel31
Konstruktion der Plasmide pFJl50 und pFJl51 A. BamHI Digestion der Plasmide pBR322 und pFJl47
•Die gewünschten Digestionen werden praktisch wie in Beispiel 2B beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon jedoch das BamHI Restriktionsenzym und die Reaktionsmischung verwendet, und nicht das Hi.n_dIII Restriktionsenzym und die Reaktionsmischung.
B. Ligation
Die Ligation der mit BamHI digestierten Plasmide pBR322 und pFJl47 wird praktisch wie in Beispiel 8C beschrieben durchgeführt. Das gewünschte Chimäre Plasmid DNA wird abzentrifugiert, mit 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und dann in 50 μΐ TE-Puffer suspendiert, Hierbei ergeben sich rekombinante Plasmide mit zwei Orientierungen, da das restriktierte Plasmid pBR322 in eine von zwei Richtungen orientiert sein kann. Die Plasmide pFJl50 und pFJl51 lassen sich in üblicher Weise in geeignete Wirtszellen transformieren und dann durch Restriktionsenzymanalyse sowie Gelelektrophorese identifizieren.
Beispiel 32
Konstruktion von E. coli K12 HBl01/pFJl50 und E. coli K12 HB101/pFJ151
Die gewünschten Konstruktionen werden praktisch wie in Beispiel 19 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß man hier die Plasmide pFJl50 und pFJ151 verwendet, und nicht die Plasmide pEL121 und pELl22. Die überlebenden Kolonien werden zuerst selektiert, bezüglich des er-
R S warteten Phenotyps (Amp , Tet ) untersucht und dann in üblicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse sowie Gel-
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_ 44 -
elektrophorese als die gewünschten Transformant'en von E. coli K12 HBl01/pFJl50 und E. coli K12 HBl01/pFJl51 identifiziert. Die Restriktionsstellenpläne für die Plasmide pFJ150 und pFJl51 gehen aus Fig. 16 der Zeich-
5 nung hervor.
Beispiel 33 Konstruktion von Streptoinyces ambofaciens/pFJl50
Die gewünschte Konstruktion wird praktisch wie in Beispiel 9 beschrieben durchgeführt, wobei man hier jedoch das Plasmid pFJl50 (in üblicher Weise isoliert aus E. coli Kl2 HBlOl/pFJISO von Beispiel 32) verwendet, und
15 "nicht die DNA von Beispiel 8C.
Beispiel 34 Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pFJl51
Die gewünschte Konstruktion wird praktisch wie in Beispiel 9 beschrieben durchgeführt, wobei man hier jedoch das Plasmid pFJl51 (in üblicher Weise isoliert aus E. coli K12 HBl01/pFJl51 von Beispiel 32) verwendet, und
25 nicht die DNA von Beispiel 8C.
Beispiele für Plasmide und Transformanten, die sich unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahren konstruieren lassen, gehen aus den folgenden Tabelle I und II hervor.
Beispiele entsprechender Plasmide
| Beispiel Nr. | Bezeichnung d. Plasmids | Ungefähre Größe in kb | Konstruktion | in | in | mit BamHI |
| 35 | PFJ152 | 6,9 | Bc^I-BamHI Eliminierung von pFJl45 | in | mit BamHI | |
| 36* | PFJ153 | 8,3 | Ligation von pBR322 BarnHI Fragment digestiertes pFJl24 | in | in | mit BamHI |
| 37* | PFJ154** | 11,7 | Ligation von pBR322 BamHI Fragment partialdigestiertes pFJl44 | |||
| 38* | PFJ155** | 11,7 | Ligation von pBR322 BamHI Fragment partialdigestiertes pFJ14 5 | |||
| 39 | PFJ156 | 8,3 | Umgekehrte Orientierung von pFJl53 | |||
| 4 0 | Ι>!·\ΠΓ:>7 | 11 ,1 | UiTicjοkcIi rto Oriont iorunq von pFJl 54 | Ligation von -2.7 kb pIJ43 SaII-BgIlI :nit Sall-Bcll digestiertes pFJl24 | Fragment in | |
| 41 | pFJl58 | 11,7 | Umgekehrte Orientierung von pFJl55 | Ligation von pBR322 BamHI Fragment partialdigestiertes pFJl59 | mit BamHI | |
| 42 | PFJ159 | 6,5 | Umgekehrte Orientierung von pFJl60 | |||
| 43* | FFJ160*** | 11,0 | Ligation von pBR322 BamHI Fragment partialdigestiertes pFJl48 | mit BamHI | ||
| 44 | pFJl61 | 11,0 | Umgekehrte Orientierung von pFJl62 | |||
| 4 5* . | pFJl62*** | 11,3 | ||||
| 4 6 | pFJl63 | 11,3 |
TABELLE I (Fortsetzung)
| Beispiel Nr. | Bezeichnung d. Plasmids | Ungefähre Größe in kb | Konstruktion |
| 47* | PFJ177*** | 11,3 | Ligation von pBR322 BamHI Fragment in mit BamHI partialdigestiertes pFJl49 |
| 48 | PFJ178 | 11,3 | Umgekehrte Orientierung von pFJl77 |
| 49* | PFJ179 | 7,1 | Ligation von pBR322 BamHI Fragment in mit ^2.8 kb BamHI Fragment von pELlO5 |
| 50 | PFJ180 | 7,1 | Umgekehrte Orientierung von pFJl79 |
| 51 | pi·1 J 191 | 3,5 | Bcll-Bamlll Eliminierung von pFJ124 |
* Die Orientierung der pBR DNA ist die gleiche wie bei Fig. 16 für pFJ 150
** Die Insertion an der BamHI Stelle ist so, daß sich die pBR DNA zwischen dem neoinycinres.i stenten Gen und der BcJLI Stelle des thiostreptonresistenten Gens befindet.
*** Die Insertion an der BamHI Stelle liegt so, daß sich die pBR DNA zwischen dem erythromycinresistenten Gen und der pFJ Pstl Stelle befindet.
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- 47 TABELLE II
Beispiele für typische Transformanten
1. Streptomyceten R/R , worin R für ambofaciens, aureofaciens, griseofuscus, fradiae, lividans, granuloruber, tenebrarius oder cinnamonensis steht und R unabhängig ein pFJ-Plasmid der in Tabelle I angegebenen Art bedeutet.
2 3 2
2. E. coli R /R , worin R für K12 oder K12 KBlOl steht und R unabhängig ein Plasmid pFJl53, pFJ154, pFJ155# pFJ156, pFJl57, pFJl58, pFJ160, pFJl61, pFJl62, pFJl63, PFJ177, pFJl78, pFJl79 oder pFJlSO bedeutet.
Claims (21)
- - 48 1 ErfindungsanSprüche:1. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA Klonierungsvektors, dadurch gekennzeichnet, daß man ein oder mehrere DNA-Segmente, die gegenüber wenigstens einem Antibiotikum nach übertragung in eine sensitive Wirtszelre eine Resistenz verleihen, an einen funktionalen Ursprung eines replikationshaltigen Restriktionsfragments des Plasmids pEL103 bindet und die erhaltene rekombinierende DNA durch Selbstbindung in einen Klonierungsvektor überführt.
- 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Restriktionsfragment des Plasmids pEL103 das15 2.8 kb BamHI Restriktionsfragment verwendet.
- 3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Restriktionsfragment des Plasmids pELl0'3 das 19.9 kb BamHI Restriktionsfragment verwendet.
- 4. Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als ein oder mehrere DNA-Segmente, die für eine Antibiotikaresistenz sorgen, Segmente verwendet, die eine Resistenz gegenüber einem oder mehreren der Antibiotika Thiostrepton, Neomycin oder Erythromycin ergeben.
- 5. Verfahren nach Punkt 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als DNA-Segment, das eine Resistenz gegenüber Thiostrepton ergibt, das 1.6 kb BamHI Restriktionsfragment30 des Plasmids pLR2 verwendet.
- 6. Verfahren nach Punkt 4, dadurch gekennzeichnet, ' daß man als DNA-Segment, das eine Resistenz gegenüber Neomycin ergibt, das 3.4 kb BamHI Restriktionsfragment des Plasmids pLRl verwendet.
- 7. Verfahren nach Punkt 2 und 5 zur Herstellung der Plasmide pEL105 oder pELl07, dadurch gekennzeichnet, dctß244037 0man das 1.6 kb BamHI Restriktionsfragment des Plasmids pLR2 an das 2.8 kb BamHI Restriktionsfragment des Plasmids pELlO3 bindet.
- 8. Verfahren nach Punkt 2 und 6 zur Herstellung der Plasmide pEL 109 oder pELllO, dadurch gekennzeichnet, daß man das 3.4 kb BamHI Restriktionsfragment des Plasmids pLRl oder pLR4 an das 2.8 kb BamHI Restriktionsfragment des Plasmids pELlO3 bindet.
10 - 9. Verfahren nach Punkt 2, 5 oder 6 zur Herstellung der Plasmide pEL113, pEL114, pELH5 oder pELl 16, dadurch gekennzeichnet, daß man das 1.6 kb BamHI Restriktionsf-ragment des Plasmids pLR2 und das 3.4 kb BamHI Restriktionsfragment des Plasmids pLRl an das 2.8 kb B_amIH Restriktionsfragment des Plasmids pEL103 bindet.
- 10. Verfahren nach Punkt 3 und 5 zur Herstellung der• Plasmide pELlO4 oder pELl08, dadurch gekennzeichnet, daß man das 1.6 kb BamHI Restriktionsfragment des Plasmids pLR2 an das 19.9 kb BamHI Restriktionsfragment des Plasmids pELlO3 bindet.
- 11. Verfahren nach Punkt 3 und 6 zur Herstellung der Plasmide pELlll oder pELll2, dadurch gekennzeichnet, daß man das 3.4 kb BamHI Restriktionsfragment des Plasmids pLRl an das 19.9 kb BamHI Restriktionsfragment des Plasmids pEL103 bindet.
- 12. Verfahren nach Punkt 3, 5 und 6 zur Herstellung der Plasmide pELll7, pELH8, pELH9 oder pEl20, dadurch gekennzeichnet, daß man das 1.6 kb BamHI Restriktionsfragment des Plasmids pLR2 und das 3.4 kb BamHI Restriktionsfragment des Plasmids pLRl an das 19.9 kb BamHI Re- striktionsfragment des Plasmids pEL103 bindet.
- 13. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4 zur Herstellung des Plasmids pFJl24, dadurch gekennzeichnet, daß244037 0man ein BamHI Partialdigestionsprodukt des Plasmids pEL105 an ein BcIJ Volldigestionsprodukt des Plasrnids pELlOS bindet .
- 14. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4 zur Herstellung der Plasmide pFJl.44 und pFJl45, dadurch gekennzeichnet, daß man ein BamHI Digestionsprodukt des Plasmids pFJl24 an das 3.4 kb BamHI Fragment des Plasmids pLRl bindet.
10 - 15. Verfahren nach Punkt 1 oder 4 zur Herstellung des Plasmids pFJl46, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Partialdigestionsprodukt des Plasmids pFJl44 mit BamHI und Bell selbst bindet.
- 16. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4 zur Herstellung des Plasmids pFJl47, dadurch gekennzeichnet, daß man das 2.7 kb SaII-BgIII Fragment des Plasmids pIJ43 an das BamHI-Partial-SaII-Digestionsprodukt des Plasmids pFJl24 bindet.
- 17. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4 zur Herstellung der Plasmide pFJl48 und pFJl49, dadurch gekennzeichnet, daß man das Partial-Sa_lJ-Digestionsprodukt des" Plasmids pIJ43 an das Partial-Sall-Digestionsprodukt des Plasmids pFJl24 bindet.
- 18. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung eines bifunktionellen rekombinanten DNA Klonierungsvektors, dadurchou gekennzeichnet, daß man(a) einen funktionalen Ursprung eines replikationshaltigen Restriktionsfragments des Plasmids pELl03,(b) ein oder mehrere DNA Segmente, die gegenüber wenigstens einem Antibiotikum nach Transformierung in eine sensitive Wirtszelle, welche suszeptibel ist für eine Transformation, Zellteilung und Züchtung, eine Antibiotikaresistenz verleihen, und(c) ein ein funktionales Replikon enthaltendes und eine2U037 0-51 -Antibiotikaresistenz verleihendes Restriktionsfragment eines Plasmids von E. colianeinander bindet und die dabei erhaltene rekombinierende DNA durch Selbstbindung in den gewünschten Klonierungsvektor überführt.
- 19. Verfahren nach Punkt 18, dadurch gekennzeichnet, daß man als Plasmid von E. coli das Plasmid pBR322 verwendet.
- 20. Verfahren nach Punkt 19 zur Herstellung der bifunktionellen Plasmide pELl21 oder pELl22, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Partial BamHI Digestionsprodukt des Plasmids pELlO7 an mit BarnHl digestiertes Plasmid pBR322 bindet.
- 21. Verfahren nach Punkt 18 oder 19 zur Herstellung der Plasmide pFJ150 oder pFJ151, dadurch gekennzeichnet, daß man das BamHI Digestionsprodukt des Plasmids pBR322 an das BamHI Digestionsprodukt des Plasmids pFJl47 bindet.Hierzu^_Seiten Zeichnungen
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