DD207928A1 - Verfahren zur enzymtrennung - Google Patents

Abstract

ES IST DAS ZIEL, AUF DER BASIS DER HYDROPHOBEN CHROMATOGRAPHIE EINE VERFAHRENSWEISE ZU ENTWICKELN, DIE DIE HOHEN TRENNEFFEKTE DER AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE AUFWEIST UND DABEI MIT EINEM EINZIGEN TRAEGERMATERIAL FUER UNTERSCHIEDLICHE ENZYME AUSKOMMT. ES IST DIE AUFGABE DER ERFINDUNG, EIN LEICHT BEHERRSCHBARES TRENNVERFAHREN ZU ENTWICKELN, DAS DEN EINSATZ HOHER KONZENTRATIONEN STRUKTURFORMIERENDER IONEN GESTATTET. DIE AUFGABE WIRD GELOEST DURCH DEN EINSATZ VON 10-CARBOXYLDECYL-SEPHAROSE ALS TRAEGERMATERIAL.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Enzymtrennung und zur Gewinnung angereicherter Enzympräparate bzw. reiner Enzyme. Die betreffenden Enzyme werden vornehmlich in der klinisch-chemischen Diagnostik sowie in der Lebensmittelanalytik verwendet·

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es sind bereits eine Vielzahl von Verfahren zur Enzymtrennung bekannt. Häufig angewendet und seit Jahren praktiziert sind die Salz- und die Lösungsmittelfällung, die Ionenaustausch- und die Msorptionschromatografie, die Gelfiltration· In neuerer Zeit werden in zunehmendem MaBe Affinitätstechniken eingesetzt« Diese sind wegen ihrer hohen Effektivität, die sich in guten Anreicherungsfaktoren; geringem Zeitaufwand; kleinen Operationsvolumina äußert, den erstgenannten überlegen. Nachteile ergeben sich aus den beträchtlichen Kosten für die Herstel-

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lung der Trennmaterial!en und dem Umstand, daß für jedes "Enzym, (zumindest aber für eine Enzymgruppe) die Träger speziell synthetisiert werden müssen* Als ungünstig erweist sich häufig mangelhafte Stabilität der Träger. Solehe Gesichtspunkte besitzen aber bei Einsatz dieser Technik in der industriellen Enzymproduktion Bedeutung und schränken eine umfassende Anwendung beträchtlich ein.

Eine besondere Position nimmt die hydrophobe Chromatographie ein, die in. gewisser Weise ein Bindeglied zwischen Ionenaustausch- und Affinitätschromatographie darstellt und deren Entwicklung eng /verknüpft ist mit der Entwicklung der Affinitätschromatographie. Obwohl der Gedanke, Enzymtreniiungen an hydrophoben Trägermaterialien durchzuführen, nicht neu ist, ist das Interesse besonders nach Einführen von Spacern bei der Affinitätschromatographie sprunghaft angestiegen (Er-El. Ζ», Zaidenzaig, Y. und Shaltielj S. (1972) Biochenu Biophys. Res« Commun. 49, 383 - 390)« Bis auf wenige Ausnahmen (Weiss, H., und Bucher, T. (197O)_Eur_e J. Bloohem. YJ_, 561 - 567, Schöpp, W.,-Meinert, S., Thyfronitou, J* und Aurich, H. (1975) J. Chromat. JjÖ4, 99 - 104) werden für die hydrophobe Chromatographie substituierte Sepharose-Derivate verwendet, die nach BrCN-Aktivierung der Matrix durch Kopplung von Substanzen mit primären Aminogruppen gewonnen werden. Solche Trägermaterialien sind substituierte Isoharnstoffderivate, die pK -Werte von 9,5 aufweisen (Yon, R.J. und Simmonds, R.J» (1975) Biochem« J. 151, 281 - 290). Da Proteintrennungen in der Regel bei pH-Werten durchgeführt werden, die deutlich darunter liegen, besitzen die Präparate neben der hydrophoben Gruppierung stets auch eine positive Ladung, so daß sie auch die Eigenschaften von Ionenaustauschern haben« Darüber hinaus kann bei Kopplung von Diaminen, Aminosäuren u, a. eine weitere geladene Gruppe eingeführt werden (Yon, R.J. (1977) Biochem« J. 161, 231 - 237, Rimerman, R.A. und Hatfield, G.'W. (1973) Science 182, 1268 - 1270, Doellgast, G.J. und Fishraan, W.H. (1974) .

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Biochem. J. 141» 103 - 112)_β Handelt es sich um^-Aminocarbonsäuren, besitzen die Sepharose-Derivate sowohl die Eigenschaften von Unionen- und Kationenaustauschern als auch - bei entsprechender Kettenlänge - hydrophobe Natur ("amphiphatische Ampholyte^M), An einem solchen Präparat konnten Alkoholdehydrogenasen außerordentlich effektiv gereinigt werden, wobei als Ursache eine spezifische Wechselwirkung mit der für diese Enzyme typischen hydrophoben Substratbindungsregion angenommen wird (Schöpp, W., Grunow, M·, Tauchert, H. und Aurich, H. (1976) PEBS, Lett· 68, 198 - 202). ,

Der Einsatz von hydrophoben Trägermaterialien erfolgte bisher stets dann, wenn von den abzutrennenden Enzymen bzw. Proteinen bekannt war, daß sie eine ausgeprägt hydrophobe Region aufweisen. Ein Einsatz auch in den Fällen, in denen das Vorhandensein einer solchen Region nicht von vornherein zu erwarten ist, wurde nicht in Erwägung gezogen. Ein immobilisierter amphiphatischer Ampholyt, der die Trennung von Enzymen unterschiedlicher Struktur und Punktion gestattet, ist bisher nicht bekannt. - Handelsübliche Präparate zur hydrophoben Chromatographie sind z. B. Hexyl-, Octyl-, Phenyl-, Aminohexyl-, Carboxypentyl-Sepharose o. dgl.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein allgemein anwendbares Verfahren zur Enzymtrennung auf der Basis der hydrophoben Chromatographie zu entwickeln, das sowohl die hohen Trenneffekte der Affinitätschromatographie aufweist als auch Trennungen an einem einzigen Trägermaterial ermöglicht. Dadurch sollen kostengünstig angereicherte Enzympräparate zur Verfügung gestellt werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung'

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Die Erfindung hat die Aufgabe, die "Vorteile von Verfahren der Affinität sehr omatogrephie und der hydrophoben Chromatographie zu verknüpfen und ein Trennverfahren zu schaffen, das neben hoher Effektivität auch den Vorteil aufweist , leicht beherrschbar zu sein« Das zu entwickelnde Verfahren soll den Einsatz hoher Konzentrationen strukturformierender Ionen wie Citrat, Phosphat, Sulfat, Acetat ο. dgla gestatten*

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß für Enzymtrennungen ein Trägermaterial eingesetzt wird, das sowohl hydrophobe Strukturelemente als auch ionische Gruppen enthält® Besonders geeignet ist überraschenderweise Carboxydecylsepharose, An diesem Trägermaterial ist sowohl eine quantitative Adsorption als auch eine komplette Ablösung von Enzymen möglich· Aus Proteinrohextrakten bzw«, angereicherten Enzympräparaten können z. B. folgende Enzyme spezifisch abgetrennt werden: Alkoholdehydrogenase, Malatdehydrogenase, Lactatdehydrogenase, Hydroxybutyratdehydrogenase, Isocitratdehydrogenase, Caraitindehydrogenase, Malatenzym, Superoxiddismutase, Fumarase, Glucose-ö-phosphatdehydrogenase, Peroxidase, Chymotrypsin, alkalische Phosphatase·

In allen Fällen wird gemäß der Erfindung aus den jeweiligen zellfreien Proteinrohexirakten das Gesamtprotein durch Zugabe von (HH^)₂SO, bis zu 70 % Sättigung ausgefällt. Nach Zentrifugieren bei 15 000 χ g wird das Sediment mit Ammoniumsulfatlösung geringerer Konsentration behandelt, wobei sich die Enzyme nacheinander wieder lösen« Diese Lösungen werden direkt auf Säulen mit 1O-Carboxydecyl-Sepharose gegeben. Das aufgegebene Enzym wird unter diesen Bedingungen vollständig adsorbiert., Die Elution erfolgt bei abnehmender Ammoniumsulfatkonzentration«

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Auf diese Weise können Anreicherungen um den Paktor größer 100 erzielt werden. Der Reinigungseffekt ist weitgehend durch die Konzentrationsänderung des (HH. ^SO. bestimmt·

Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.

Anreicherung verschiedener Enzyme aus Proteinrohextrakten bzw. aus vorgereinigten Enzympräparaten an 10-Carboxydecyl-»S epharos e ,

Die in (NH-^SO.-Lösungen unterschiedlicher Konzentration gelösten Proteine werden auf Säulen, die vorher mit der entsprechenden Ammoniumsulfatkonzentration äquilibriert wurden, aufgetragen. Anschließend wird mit der gleichen (NH.)₂SO,-Lösung so lange gewaschen, bis im Eluat kein Protein mehr nachweisbar ist. Die Elution der Enzyme erfolgt mit (UH)₂SO.-Lösungen geringerer Konzentration bei 22 ⁰C und einer Flußgeschwindigkeit von 0,5 ml/min. Das Fraktionsvolumen liegt zwischen 4 und 10 ml. Unter diesen Bedingungen sind pro Fraktionsvolumen jeweils ca. 5 - 10 f der eluierbaren Enzymmenge enthalten. Die Regenerierung der Säulen erfolgt durch gründliches Waschen mit Wasser.

Es sind u.^ a. die in der Tabelle aufgeführten Enzyme behandelt worden

Dabei bedeuten die Ziffern in der 1. Spalte:

1 = Rohextrakte aus Ps.putida nach Wachstum auf n-Hexan

2 = Rohextrakte aus Ps.putida nach Wachstum auf Carnitin ¹3 = Enzympräparate von VEB Arzneimittelwerk Dresden

4 = Enzympräparat von Leidholdt, Kleinmachnow

5 = Enzympräparat von Boehringer, Mannheim

V_- ηο

Enzym	Säulen volumen	Protein (mg)	Volumen (ml)	Adsorp tion	Slution	Ausgangs extrakt	gereinigtes Ausbeute Reinigung Produkt (#) (-fach)	38 40	420 12
Hydroxybutyrat- dehydrogenase1	80 20 .	400 2000	45 300	25 30	20 25	0,3 1,7	125 20	39 91	96
Isocitrat- , dehydrogenase	80 20	130 800	15 260	'45- 55	40 45	0,5. 0,9	48 10 ' . ·	90	5S5
Malatenzym	3.	3,6	'.· 1	40	30 ,	0,2 .		33 80	30 7
Carnitinde- hydrogenase^	17 .· 20	80 4450	190	35 . 45	30 35	0,4 0,9	12 6,5 -	15	14
Superoxid- dismutase^		85	8	. 55	45' '	80 *	1100	75	3,5
Malat- ο dehydrogenase	5	1	1	' 55	50	80 ..	280	68	1,9
Laktat-	5	1	1	50	30	102	. 195	42	5,7.
Peroxydase	5	• 10	1-15	50	50	23	130	80	3,7
Chymotrypsin2!-		20	1.	60	.50	3500**	13000	50 '	1,8
Glucose-6-p ^ hehydrogenase	5	1	1	50	40 '	135	245

Enzymeinheiten: Nitrotetrazoliumblau als Substrat o.D,-Einheiten; Acetyltyrosinäthylestei* als Substrat

Claims (2)

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   Erfindungsansprüche

   1· Verfahren zur Enzymtrennung durch Ausfällen des Gesamtproteins aus zellfreiem Proteinrohextrakt durch Zugabe von (HEL)₂SO. bis zu 70 % Sättigung, Zentrifugieren des Sediments und dessen Behandlung mit (NH,)gSO. geringerer Konzentration, dadurch gekennzeichnet, daß die so erhaltene Lösung auf eine Säule gegeben wird, die 10-Carboxydecyl-Sepharose enthält und nach dem Durchlauf der gesamten
   Lösung das an der 10-Carboxydecyl-Sepharose adsorbierte
   Enzym mit (NI-L)₂SO.-Lösung abnehmender Konzentration elu-

   iert wird·
2. 2. Verfahren zur Enzymtrennung nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die folgenden Enzyme abgetrennt werden: Alkoholdehydrogenase, Malatdehydrogenase, Lactatdehydrogenase, Hydroxybutyratdehydrogenase, Isocitratdehydrogenase, Carnitindehydrogenase, Malatenzym, Superoxiddismutase, Pumarase, Glucose-6-phosphätdehydrogenase, Peroxidase, Chymotrypsin, alkalische Phosphatase«