DD208795A5

DD208795A5 - Verfahren zur verbesserung des wirkungsgrades bei der in vitro vermehrung von kulturpflanzen

Info

Publication number: DD208795A5
Application number: DD82246174A
Authority: DD
Inventors: Tibor Farkas; Ferenc Foeglein; Ibolya Horvath; Janos Nagy; Laszlo Vigh; Annamaria Meszaros; Istvan Toth
Original assignee: Eszakmagyar Vegyimuevek
Priority date: 1981-12-18
Filing date: 1982-12-17
Publication date: 1984-04-11
Also published as: CS239936B2; PL132926B1; BE895365A; AU9170882A; NL8204874A; CA1179858A; GB2112413B; FR2518531A1; DE3246864A1; GB2112413A; BR8207370A; AU555018B2; JPS58165714A; US4554252A; IL67506A0; IL67506A; SU1417787A3; HU187396B; BG37679A3; PL239589A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung des Wirkungsgrades bei der in vitro Vermehrung von Kulturpflanzen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass bei der Mikrovermehrung und/oder darauffolgenden Aussetzen der fluessigeNaehrboden oder die Pflanzen oder der Boden, in welchen die Pflanzen gepflanzt werden, mit der waessrigen Loesung einer Verbindung mehrerer Verbindungen der allgemeinen Formel&, worin R kann fuer ein Methyl -, Chlormethyl -, Dichlormethyl - oder Trichlormethylradikal stehen : R tief 1 und R 2 koennen gleich oder verschieden sein und ein Alkylradikal mit 1-10 Kohlenstoffatomen, ein Alkenylradikal mit 2 -10 Kohlenstoffatomen, EIN Cycloalkylradikal mit 3 - 9 Kohlenstoffatomen, Phenylradikal oder Benzylradikal oder aber Wasserstoff bedeuten mit der Bedingung , dass R tief 1 und Rtief R 2 nicht gleichzeitig Wasserstoff sein koennen; oder R 1 u.R tief 2 zusammen mit dem benachbarten Stickstoffatomeinen 5 - bis 8 gliedrigen gestaettigen heterozyklischen Ring bliden , der ein , zwei oder drei gleiche oder verschiedene weitere Heteroatome, vorzugsweise Stickstoff- oder Sauerstoffatome enthalten kann, oder der allgemeinen Formel &&, worin die Bedeutung von R die gleiche wie bei der allgemeinen Formel (&) und n eine ganze Zahl zwischen 1 und 8ist, oder Gemischen beider behandelt oder werden.

Description

2.4-6 17

VERFAHREN ZUR VERBESSERUNG DES WIRKUNGSGRADES BEI DER DT VITRO VERIiIEHRUNG VON KULTURPFLANZEN

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung des Wirkungsgrades bei der i£ vitro Vermehrung von Kulturpflanzen, wobei gemäss der Erfindung die Verbesserung des Wirkungsgrades durch eine Behandlung mit wässerigen Lösungen von Verbindungen der allgemeinen Formel

O R₁

R—C—H . (I)

oder

OH HO

H I II

R C N (CH₂)^ N C R (II)

erzielt wird. In der allgemeinen Formel (I) haben die Substituenten folgende Bedeutung: R kann für ein Methyl-, ,Chlormethyl-, Di chlorine thy 1- oder Trichlormethylradikal stehen; R^ und Rp können gleich oder verschieden sein und

24617 4 k -^-

ein Alkiylradikal rait 1-10 Kohlenstoff atomen, ein Alkeaylradikal mit 2-10 Kohlenstoffatomen, ein Cycloalkylradikal mit 3-9 Kohlenstoff atomen, Phenrylradikal oder Benzylradikal oder aber Wasserstoff bedeuten mit der Bedingung, dass R^ und R₂ nicht gleichzeitig Wasserstoff sein können; oder R, und R₂ zusammen mit dem benachbarten Stickstoffatom einen 5- bis 8-gliedrigen gesättigten heterozyklischen Ring bilden, der ein, zwei oder drei gleiche oder verschiedene weitere Heteroatome, vorzugsweise Stickstoff- oder Sauerstoffatome enthalten kann. In der allgemeinen Formel (il) ist die Bedeutung von R die gleiche wie bei der allgemeinen Formel (I) und η ist eine ganze Zahl zwischen 1 und 8.

Die unter _in_ vitro Bedingungen durchgeführten Verfahren zur Gewebezucht-Pflanzenvermehrung fanden in den letzten zwei Jahrsehnteη in der Praxis weite Verbreitung· In den Vereinigten Staaten von Amerika wurden mehr als zwanzig Laboratoriumsgrossbetriebe zur Vermehrung errichtet und auch in Westeuropa gibt es zahlreiche Laboratorien, wo 100-200000 Pflanzen monatlich durch Gewebezucht-MikroVermehrung hergestellt werden.

Praktisch gesehen besteht daa Wesen der Vermehrung durch Gewebezucht darin, dass aus Meristemgeweben von pflanzlichen Triebspitzen und Wurselspitzen unter sterilen Bedingungen von jeglichen pflanzlichen Schädlingen freie Pflanzen mit einer die Geschwindigkeit von üblicher Vermehrungsstoffproduktion um mehrere Grössenordnungen übertreffenden Geschwindigkeit, wesentlich weniger Flächenbedarf und folglich wirtschaftlicher vermehrt werden können.

' In Ungarn findet das Verfahren zur Pflanzenvermehrung durch

Gewebezucht in Grossbetrieben heutzutage Verbreitung. 35

Obwohl die Vermehrung durch Gewebezucht wirtschaftlicher

246 17 4 U-

als die üblichen Vennehrungsmethoden ist* konnten die darin verborgenen Möglichkeiten wegen den unterschiedlichen Mängeln der bisherigen Verfahren doch nicht genutzt werden»

Der grösste Mangel der bisher bekannt gewordenen Verfahren besteht darin, dass während sich die Pflanzen unter In vitro Bedingungen unbegrenzt vermehren, bisher beim Umpflanzen in den Boden - je nach der Pflanzenkultur - 20-60 % der unter sterilen Bedingungen gezüchteten Pflanzen, die nachteiliger als die früheren sind, zugrunde gehen ASroome, Zimmermann; Hort.Science, 1^, 151-153 (1978); Earle; Langhans; Hort.Science, K)» 608-610 (1975); Sutter, Langhans; J.Arn.Soc. Hort.Science, ICH, 494-496 (1979

Obwohl die sich mit dem Thema beschäftigenden Forscher bestrebt waren, durch eine Verbesserung der technischen Bedingungen der in, vivo Zucht (niedrigere TemperatürSchwankungen, hohe relative Luftfeuchtigkeit usw.) die Wirksamkeit der Vermehrung zu verbessern, führten diese Massnahrnen · .nicht zum gewünschten Erfolg.

Das Ziel unserer Forschungen zur Untersuchung des Vermehrungsverfahrens mit Gewebezucht bestand darin zu klären, was die schlechte Anpassungsfähigkeit der in, vitro vermehrten Pflanzen und das starke Zugrundegehen der umgepflanzten Pflanzen verursacht.

Ein weiteres Ziel unserer Forschungen war, ein Verfahren zu erarbeiten, mit dessen Hilfe die Wirksamkeit der Vermehrung wesentlich verbessert werden kann und der überwiegende Teil der unter ±_n vitro Bedingungen vermehrten Pflanzen auch un ter ^n vivo Bedingungen lebensfähig und sich schnell entwickelnd ist.

Bei unseren Forschungen wurden in Treibhaus- und Freilandversuchen die Zusammensetzung der Wachse und der Membran-

17

lipide mehrerer Kulturpflanzen (Welke, Gerbera» Reben, Farn) sowie der Prozess der Biosynthese dieser Zellbestandteile studiert· Als Ergebnis dieser Versuche wurde festgestellt, dass bei den durch Gewebezucht vermehrten Pflanzen in der Struktur der erwähnten Zellbestandteile bedeutende Veränderungen nachgewiesen werden können.

Ea stellte sich heraus, dass die Synthese der die Oberfläche der Pflanzenblätter beziehenden Wachse gehemmt ist. Eb wurde festgestellt, dass während bei den wie üblich gezüchteten Pflanzen in den lipophilen Bestandteilen der Zellmembran die starker ungesättigten Fettsäuren synthetisiert wurden, bei den durch Gewebezucht vermehrten Pflanzen die Synthese der starker ungesättigten Fettsäuren gehemmt ist. Das führt dazu, dass die Zellmembranen brüchig werden und die unterschiedlichen Membranfunktionen nicht entsprechend erfüllen können.

In einer Versuchsreihe wurde die Zusammensetzung der Wachskomponenten der mit dein üblichen Zuchtverfahreη und mit dem in vitro Vermehrungsverfahren gezüchteten Pflanzen durch Isotoptechnik untersucht. Die Pflanzen wurden mit einer 1-14C- Acetatlösung mit einer Aktivität von 10

/uCiAuMol

bei einer Temperatur von 25 °G durch 4 Stunden Inkubation behandelt, dann wurden die Wachskomponenten durch Dünnschichtchromatographie getrennt und ihre Verhältnisse auf Grund der spezifischen Aktivität bestimmt.

Die Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammen· gefasst:

	Verteilung der Wachskomponenten in	Primär Alkohol	Sekundär Alkohol	Pro ze	nt	Kohlen hydrat
	Hydroxy- Siiure diketon	19,44	1,53	Alde hyd	Ester	24,84
Kontrolle	31,13 3,32-	3,24	2,04	14,33	5,40	28,48
in vitro	42,56 in Spuren	20,95	2,71

246 174

Aus diesen Messergebnissen kann festgestellt werden, dass in den Wachsen der unter in vitro Bedingungen vermehrten Pflanzen die Verteilung der Komponenten deutlich von der der Kontrollpflanzen abweicht. Das Anhäufen der Säuren erhöht die Durchlässigkeit der Oberfläche der Blätter und das Senken der Menge der primären Alkohole wirkt ähnlich«

Diese beiden Erscheinungen spielen sich gleichseitig ab und auf ihre Wirkung hin können die unter in, vitro Bedingungen .ge suchte te η Pflanzen ins Freie (in. vivo) umgepflanzt den Wassergehalt der Zellen nicht aufrechterhalten.

Ebenfalls wurde bei den Versuchen die Pettsilurezusammen— Setzung der aus den auf zwei verschiedene V/eisen gezüchte-. ten Pflanzen isolierten totalen Lipiden untersuchte Die 'Untersuchungsergebnisse sind in der folgenden Tabelle'zusammengefasst.

Fettsäurezusammensetsung der Lipide in %

Palnitin- Palmito- Stearin- Öl- Linol- Lino-

säure leilsäu- säure sau- säure len-

re re säure

25	Zahl der Koh lenstoff atome		16	,72	16	,79	18	,59	18	•	»53	18	29	18	,07
	Zahl der ungesättigten Bindungen	0	,82	1	,52	0	,11	1		,97	2	18	3	,04
30	Kontrolle	14	0	0	5	30,	48
	in vitro	25		7	27	17,	18

Die Änderung der Fettsäurezusammensetzung zeigt an, dass sich im Lipicl dor in vitro gezüchteten Pflanze die Ölsäure in hohem

246 17 A 4 -J--

Mass ansammelt· Vermutlich sind die von der Ölsäure zu Linolensäure erfolgenden Desaturationsschritte aus irgendeinem Grund gehemmt. Die mehrfach ungesättigten Fettsäuren (so die Linol- und Linolensäure) spielen bei der Flexibilität der Zellmembranen und dadurch bei der Anpassungsfähigkeit der Pflanzen eine bedeiitende Rolle. Fehlen die ungesättigten , Fettsäuren in den Zellmembranen, so führt das dazu, dass die Anpassungsfähigkeit der Pflanzen bedeutend abnimmt.

Diese Versuche bestätigten, dass bei den in_ vitro vermehrten Pflanzen die Biosynthese der Wachse der Blattoberfläche und in erster Linie der in den Zellmembranen vorhandenen Fettsäuren Schaden nimmt, weshalb die aus dem Kolben ausgepflanzten Pflanzen nicht in der Lage sind, selbst geringe Temperatxirschwankungen zu ertragen, und wegen den Membranschäden selbst in einer Umgebung mit hohem Luftfeuchtigkeitsgehalt austrocknen und zu einem bedeutenden Teil zugrunde gehen. In Kenntnis dieser Tatsachen waren die Forschungsarbeiten darauf gerichtet herauszufinden, wie die Zusammen-Setzung der Wachskomponente sowie das Verhältnis der Fettsäuren der Lipide und ihre Biosynthese bei der in_ vitro Vermehrung beeinflusst werden können.

Ziel unserer Forschungen war es, ein Verfahren auszuarbeiten, mit dem die Schädigung der in vitro gezüchteten Pflanzen nach dem Auspflanzen bedeutend gesenkt und die Anpassungsfähigkeit der Pflanzen verbessert werden kann.

Im Laufe der weitreichend durchgeführten Forschungen wurde gefunden, dass wenn bei ansonst in an sich bekannter Weise durchgeführten Vermehrungsverfahren mit Gewebezucht die sich vermehrenden Pflanzen mit der wässrigen Lösung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) odev (II) oder aber mit der wässrigen Lösung von zwei oder mehreren Verbindungen der allgemeinen Formel (l) oder (II) oder mit der wässrigen Lösung

246 17 4

einer Mischung beider behandelt werden, nach dem Pflanzen der iji vitro gezüchteten Pflanzen das Pflanzensterben unter in yiyo Bedingungen bedeutend abnimmt.und wesentlich mehr Pflanzen das Auspflanzen überleben und auch die Entwicklung der überlebenden Pflanzen stärker wird.

Die Behandlung mit der wässrigen Lösung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder (II) kann so erfolgen, dass die Verbindung in einer Konzentration von 1-20 mg/1 im wurzelnden Nährboden gelöst wird, aber auch so erfolgen, dass die auf dem wurzelnden Nährboden gezüchteten Pflänzchen vor dem Auspflanzen (d.h.· das V/urzelwerk der Pflänzchen) in die wässrige Lösung (Konzentration 1-20 mg/l) der Verbindung der allgemeinen Formel· (I) oder (II) getaucht werden. - Die Behandlung kann auch so durchgeführt werden, dass die in vitro gezüchteten Pflänzchen in ein mit der wässrigen Lösung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder (II) durchtränktes Erdgemisch gepflanzt werden. Man kann auch so vorgehen, dass die in_ vitro gezüchteten Pflänzchen nach ' dem Auspflanzen gegebenenfalls auch mehrmals mit der wässrigen Lösung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder (II) in einer Konzentration von 5-15 mg/1 besprüht werden.

In der allgemeinen Formel (I) können die Substituenten folgende Bedeutungen haben: R kann für ein Methyl-, Chlormethyl-Dichlorinethy1- oder Trichlorrnethy !radikal stehen; R, und R₂ können gleich oder verschieden sein und ein Alky!radikal mit 1-10 Kohlenstoffatomen, ein Alkeny!radikal mit 2-10 Kohlenstoffatomen, ein Cycloalky!radikal mit 3-9 Kohlenstoffatomen, Pheny!radikal oder Benzylradikal oder aber Wasserstoff bedeuten mit der Bedingung, dass R₁ und R₂ nicht gleichzeitig Wasserstoff sein können; oder R, und R_? zusammen mit dem benachbarten Stickstoff einen 5- bis 8-gliedrigen gesättigten heterozyklischen Ring bilden, der ein, zwei oder drei gleiche oder verschiedene weitere Heteroatome, vorzugsweise Stickstoff- oder Gauerstofxatome enthalten kann.

246174

In der allgemeinen Formel (II) ist die Bedeutung von R die gleiche wie bei der allgemeinen Formel (I) und η ist eine ranze Zahl zwischen 1 und 8.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und (II) sind aus den folgenden Literaturstellen bekannt beziehungsweise können gemäss den in diesen Literaturstellen beschriebenen Methoden hergestellt werden: Res. Disci. (197G) 143 - 140; J. Agric. Food. Chem. (1978), 26, 1, 137 - 140; J. Agric. Food. Chem. (1979), 27, 3, 543 - 547; und Houben-Weil: "Methoden der organischen Chemie", Band XI/2,0, 3 - 37 (1958).

Weiterhin wurde bei unseren Forschungen·untersucht, wie sich die wichtigsten Wachskomponenteη der mit der wässrigen Lösung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) öder (II) behandelten und mit i_n vitro Gewebezuchttechnik: vermehrten Pflanzen im Vergleich zu unbehandelten Pflanzen ändern sowie welchen Einfluss die Behandlung auf die Fettsäurezusammensetaung der totalen Lipide der Pflanze ausüben.

Bei den Versuchen wurde Nährboden mit folgender Zusammensetzung zur i_n vitro Zucht der Pflanzen verwendet I/iurashige, T. Skoog, 1\ : Physiol. Plant. 1£, 473-497 (1962) :

GaCl CoCl,

2 ·

"2 * ^rl

FeNaEDl¹A

CuSO₄ . 5H₂O

KJ KlIO.

439,300 mg/1 0,025 mg/1 0,025 ml/1

336,600 mg/1 6,200 mg/1

170,000 mg/1

0,830 mg/1 1900,000 rag/l

Zn₂SO₄ κ Zucker I-nozit Nikotinsäure

salzsaures Salz von Thiamin

salζsaures Salz von Pyridoxin Adeninsulfat

8,600

3-45,000

100,000

10,000

30,000

mg/1

g/i

mg/1 mg/1 mg/1

10,000 mg/1

Indolessigsäure

0-80,000 0-10,000

mg/1 mg/1

24 6 1 7 Λ 4

MgSO. . 7Η0 370,000 mg/1 Kinetin 0-30,000 mg/1

MnSO . 4H₂O 22,300 mg/1 Agar-agar 7-10,000 g/1

NaH₂PO₄ . 2H₂O 96,000 mg/1

Na₂MoO₄ . 2H₂O 0,250 mg/1

NH NO₃ 1650,000 mg/1.

Die aufgezählten Stoffe werden in destilliertem Wasser gelöst, der pH-Wert der Lösung wird auf 5,8 eingestellt, dann wird der Agar-ager zugesetzt und der Nährboden wurde bis zum Abklären gekocht, dann unter sterilen Bedingungen in die Kolben gefüllt, deren Öffnung mit einem Papierstöpsel verschlossen wurde. Die Kolben wurden dann in einen Autoklav gelegt und der Nährboden wurde bei einer Temperatur von 121 ⁰C sterilisiert. In der ersten Versuchsreihe wurde von den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) die Wirkung von Dichloracety!-hexamethylenimin auf die Synthese der wichtigsten Wachskomponenten der Nelkenpflanze untersucht. Parallel wurden mit traditioneller Technik die Pflanzen sowie mit in vitro Gewebezuchttechnik auf einem Nährboden mit der vorigen Zusammensetzung bzw, auf einem Nährboden, dem 6 mg/1 Dichloracetat-hexarnethylenimin vor der Sterilisation des Nährbodens zugesetzt wurden, gezüchtet. Beim gleichen Entwicklungsabschnitt der Pflanzen wurde die prozentuale Menge der zwei wichtigsten Wachskomponenten mit der schon früher beschriebenen Methode bestimmt. Die gemessenen Werte sind in der folgenden Tabelle enthalten.

Zuchtmethode Wachskomponenten %

Säuren Primäre Alkohole

traditionell (Kpntrolle)	32,11	20,55
in vitro	45,21	3,05
	30,73	22,18
erfindurigfife- mäs3 in vitro

2Λ 6 17 4 4 -&-

Die Versuchsergebnisse zeigen deutlich, dass sich auf die Wirkung von Dichloracety!-hexamethylenimin in der iD. vitro gezüchteten Nelkenpflanze die Zugammensetzung der Wachskomponenten auf ein Niveau einstellt, das dem der traditionell gezüchteten Pflanzen ähnelt.

In einer folgenden Versuchsreihe wurde untersucht, wie unter den Verbindungen der allgemeinen Formel (i) die Anwendung von Dichloracetyl-hexamethylenimin in unterschiedlichen Konzentrationen die Pettsäurezusammensetzung der totalen Lipide der in vitro gezüchteten Nelkenpflanze beeinflusst. Bei den Versuchen wurden auf dem schon beschriebenen Nährboden sowie auf einer Menge von jeweils 250 ml davon, der unterschiedliche Mengen von Dichloracety!-hexamethylenimin eingewogen wurden, jLn.

Nelkenpflanzen gezüchtet, in denen bei gleichem Entwicklungsstadium mit der schon früher beschriebenen Methode die Pettsäurezusammensetzung der totalen Lipide untersucht wurde

20

Die Messergebnisse sind in der folgenden Tabelle enthalten,

Behandlungs- Fett.säure %

konzentra- .

tion Og/l] Palmitin- Palmito- Stea- öl- Linol- Linolensäure leil- rin- säure säure säure säure säure

	0,00	25,82	3,89	7,11	27,97	17,18	18,04
30	15,60	25,16	-	3,09	18,94	32,85	23,96
	30,80	23,08	-	4,37	18,53	25,18	28,85
	61,60	24,61		2,50	16,68	32,85	23,26
	154,00	21,13	—	3,38	19,15	29,20	27,04
	30,00	26,57	mm	4,00	25,71	25,29	18,43

246 17 4 A.

<tf

Die Messergebnisse veranschaulichen gut, dass sich auf die Wirkung des in unterschiedlichen Konzentrationen angewendeten Dichloracetyl-hexamethylenimins die Fettsäurezusammensetzung in Richtung' der ungesättigten Fettsäuren verschob. 5

Das erfindungsgemässe Verfahren wird anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht, ohne den Schutzumfang auf diese Beispiele einzuschränken.

Beispiel 1

Herstellung von Nelkenvermehrungsstoff durch Gewebezucht.

Die Meristemgewebe von nach einem an sich bekannten Verfahren im Treibhaus gezüchteten Nelkenstecklingen wurden unter sterilen Bedingungen vorbereitet und auf dem schon beschriebenen Murashige-Skoog-Nährboden vermehrt. Die Nelkenmeristeme begannen zuerst zu wachsen, dann sich zu teilen. Aus jeder Triebspitze wuchsen 6 Wochen nach dem Einbringen in den Nährboden 10-15 Triebe, die - wenn sie getrennt auf neuen frischen Nährboden gesetzt werden - für Weitervermehrung geeignet sind. Die Vermehrungsgeschwindigkeit der Triebe betrug monatlich 10-15 Triebe.

Nach der Teilungsphase der Nelkentriebe erfolgte auf gesondertem Nährboden die Induktion der Wurzelbildung, wozu Grundnährboden mit einer auf das Fünffache verdünnten Konzentration verwendet wurde mit dem Unterschied, dass dem Nährboden in einer Konzentration von 0,1 mg/1 Indolessigsäure zugesetzt wurde.

Aus dem Nährboden wurde durch das Zusetzen von unterschiedlichen Mengen Dichloracetyl-hexamethylenirnins eine .Konzentrationsreihe hergestellt, und die Zucht erfolgte auf diesen Nährböden. 35

Als die Wurzelbildung das gewünschte Mass erreicht hatte, wur-

46174

den die Nelkenpflanzchen zur Setzlingszucht unter jji viVO Bedingungen in ein Treibhaus umgesetzt·

Die ungesetzten Pflanzchen passten sich in unterschiedlichem Mass den Bedingungen der iji vivo Zucht an, es gab Pflanzen, die zugrunde gingen, und Pflanzen, die sich anpassten,, das Umpflanzen überlebten und sich entwickelten.

Bei der :in vivo Vermehrung wurden von den auf unterschiedliehen Nährböden gezüchteten Pflänzchen die Anzahl der zugrundegegangenen bzw. überlebenden gezählt, die prozentual in der folgenden Tabelle zusammengefasst sind;

Dichloracetyl- -hexamethyIe nirain- -Gehalt dea Nähr bodens [mg/i]	Überleben in (*)
1	45
2	48
4	64
(S	96
8	87
10	75
12	70
14	50
20	43
O (Kontrolle)	46

Au3 den Messangaben geht hervor, dass bei Heiken durch das Zusetzen von Dichloracetyl-hexametlLvlenimin zürn Nährboden das Treibhausuberleben der Nelkensetzlinge bei einer Konzentration von 6 mg/1 auf 96 % erhöht werden kann, also

2Λ617h U -

die Wirkung der Vermehrungstechnik um mehr als 100 % (um das Doppelte) gesteigert werden kann, was die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens stark verbessert.

Es konnte beobachtet werden, das3 die grüne Farbe der mit dem erfindungsgemässen Verfahren gezüchteten Pflanzen einen dunkleren Ton aufwies und ihre Stiele und Blätter stärker als die der Kontrollpflanzchen waren und ausserdem eine dickere Wachsschicht die Oberfläche ihrer Blätter bedeckte,

Beispiel 2

Ahnlich wie im vorherigen Beispiel wurde Nelkenvermehrungsstoff hergestellt, wobei die Meristeragewebe ebenfalls auf dem beschriebenen Murashige-Skoog-Nährboden vermehrt wurden und dann zur Induktion der Wurzelbildung auf auf das Fünffache verdünnten, 0,1 mg/1 Indolessigsäure enthaltenden Nährboden umgepflanzt wurden. Die so iin vitro gezüchteten Pflänzchen wurden in ein solches Erdgemisch in einem Treibhaus umgepflanzt, das von den erfindungegemässen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) mit einer Lösung von Dichloracety!-hexamethylenimin wie folgt durchtränkt wurde. 5 g Dichloracetyl-hexamethylenimin wurden in 500 ml 70 %igem 0»

Äthylalkohol gelöst, dann in 19,5 1 V/asser gerührt. Die so hergestellten 20 1 Lösung wurden unter mehrfachem Umschaufeln 1 m~* Erdgemisch zugesetzt. - In den so hergestellten Boden sowie in die genannte Verbindung der allgemeinen Formel (i) nicht enthaltenden Boden wurden die jjn vitro gezüchteten Pflänzchen gesetzt und im Treibhaus wurde ihr in vivo Wachsen beobachtet.

Es wurde festgestellt, dass während auf dem unbehandelten Boden 58 % der Pflänzchen zugrunde gingen (also 42 % das Umpflanzen überlebten), auf dem Dichloracetyl-hexamethyleniminenthaltenden Boden nur 8 % der Pflänzchen zugrunde

246174 A-#-

gingen, 92 % entwickelten sich kräftig weiter. Beispiel 3

Ähnlich wie im vorigen Beispiel wurde Nelkenvermehrungastoff hergestellt, und die Pflanzen wurden nach Entwicklung der Wurzeln in ein Treibhaus zur iji vivo Zucht in unbehandelten Boden gesetzt.

Dann wurde die Hälfte der Pflanzen nach dem Auspflanzen mit von den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) Dichloracety!-hexamethylenimin enthaltendem Sprühmittel behandelt, dann noch dreimal mit Pausen von 3-4 Tagen.

Ein Liter des Sprühmittels enthielt 10 mg Dichloracetyl-.-hexamethylenimin, 0,1 ml Emulgator der Marke Tween 80 und 0,05 M Tris HCl-Puffer, sein pH-Wert betrug 6,5. Bei seiner Herstellung wurde so verfahren, dass das Dichloracety!-hexamethylenimin in einigen Tropfen 70 i&igem Alkohol gelöst, dann dem den Puffer enthaltenden Wasser zugesetzt und der Emulgator der Mischung beigerührt wurde.

Die Versuche zeigten, dass 88 % der durch Besprühen behandelten Pflanzen das Umpflanzen überlebten, während nur 42 % von den nichtbehandelten überlebten.

Beispiel 4

Herstellung von Gerbera-Vermehrungsstoff durch Gewebezucht· 30

Die Gerberapflanzen wurden in, vitro nach der schon bekannten, von Murashige et al. (j. Hort. Sei. <J, 175-180 (1974)] ausgearbeiteten Methode zur Vermehrung und Wurzelbildung vermehrt. Einem Teil des wurzelnden Nährbodens wurde in

17 4 U -£-

einer Konzentration von 10 mg/1 Dichloracet.vl-hexamethylenimin zugesetzt, und die Hälfte der Pflanzen fasste auf diesem Nährboden Wurzeln. Die iri vitro gezüchteten Pflanzen wurden dann in ein Treibhaus gesetzt, und bei den unter iji vivo Bedingungen weitergezüchteten Pflanzen wurden die zugrundegegangenen bzw. überlebenden Pflänzlinge gezählt. Es wurde festgestellt, dass 98-100 % der auf dem Dichloracety!-hexamethylenimin in einer Konzentration von 10 mg/1 enthaltenden Nährboden Wurzel fassenden Pflanzen das Umsetzen überlebten, während 30-35 % der auf dem unbehandelten Kontrollnährboden Wurzel fassenden Pflanzen zugrunde gingen.

Das Verhalten der Gerbera-Kolbenpflanze wies auch eine bedeutende Änderung auf, die behandelten Pflanzen waren gedrungener, ihre Blätter härter und entwickelter.

Beispiel 5

Wie in Beispiel 1 wurde Nelkenvermehrungsstoff durch Gewebezucht hergestellt, mit dem Unterschied, dass dem auf das Fünffache verdünnten Grundnährboden zur Anregung der Wurzelbildung statt Indolessigsäure mit einer Konzentration von 0,1 mg/1 p-Chlorphenox.y essigsäure in einer Konzentration von 0,1 mg/1 zugesetzt wurde.

Dann wurden die unterschiedlichen Verbindungen der allgemeinen Formel (i) oder (II) in verschiedenen Konzentrationen (2, 5, 10, oder 20 mg/l) dem Nährboden beigemischt und die Pflanzen bis zur Entwicklung der Wurzeln auf dem ν Nährboden gezüchtet.

Als die Wurzeln gross genug zum Auspflanzen waren, wurden die Pflanzen in ein Treibhaus gesetzt und gezüchtet. 35

Die Pflanzen passten sich unterschiedlich den in vivo

24617 4 k -&-

'- Bedingungen an.

Nach der gleichmässigen und sicheren Entwicklung wurde die Zahl bzw, das Verhältnis der zugrundegegangenen und überlebenden Pflanzen untersucht und gezählt.

Die Ergebnisse aind in der folgenden Tabelle zusammengefasst:

Chemioche Bezeichnung Anteil der entsprechend Wurzel fassender Verbindung der den bzw, überlebenden Pflanzen in % allgemeinen Formel (I) oder (II) wenn die Konzentration der Verbindung

der Formel"(I) oder (II) wie folgt ist:

2 rag/l 5 mg/1 10 mg/1 20 mg/1 15

unbehandelte Kontrolle	61	61	61	61
IT-Ac e ty 1-hexame thy 1 e n- imin	80	81	80	81
N- Chloracetyl -hexa methylenimin	76	76	76	70
N- Dichloracetyl -hexa methylenimin	100	100	100	100
N- Trichloracetyl -hexa methylenimin	65	65	63	63
N- Dichloracetyl -di- isobutylamid	68	66	77	61
IT- Dichloracetyl -iso- propylamid	72	71	71	71
IT- Dichloracetyl -tert- butyl-amid	71	72	72	72
IT^N*Lbis(Dichlo^race- tyl )-hexamethyMl'amißU	95	100	100	100
IT— Dichloracetyl — hex»£-	94	95	98	100
,^lUyW-amid

Aus den Tabellenangaben ist gut ersichtlich, dass die statt Indolessigsäure angewendete p-Chlorphenoxyessigsäure den Anteil

17 A 4 -

der überlebenden Nelkenpflänzlinge von 46 auf 61 % erhöhte, andererseits, dass die Anwendung der Lösungen der erfindungsgeriLlssen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder (II) die Lebensfähigkeit nach dem Auspflanzen weiter steigerte.

Weiterhin würde beobachtet, dass die Stiele und Blätter der mit dem erfindung3gemassen Verfahren gezüchteten Heiken stürker waren und ihre grüne Farbe einen dunkleren Ton aufwies als bei den unbehandelten Kontrollpflanzen. 10

Beispiel 6

Gerberavermehrungsstoff wurde durch Gewebezucht wie in Beispiel 5 hergestellt. Die Bezeichnung der angewendeten Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder (II), ihre angewendete Konzentration und der Prozentsatz; der das Umpflanzen überlebenden Pflanzen wurden in der folgenden Tabelle zusammengefasst:

Chemische Bezeichnung Anteil der entsprechend Wurzel fasder Verbindung der senden bzw. überlebenden Pflanzen in allgemeinen Formel (l) oder (II) , wenn die Konzentration der Verbindung

der allgemeinen Formel (I) oder (II) ' wie folgt ist:

2 mg/1 5mg/l 10 mg/1 20 mg/1

Unbehandelte Kontrolle	63	63	63	63
IT-Ac e ty 1-hexame thy len- ini η	83	84	83	82
IT- Chloracetyl -hexame thylenimin	78	82	79	80
IT- Dichloracetyl -hexa methylenimin	100	100	100	100
IT- Trichloracetyl -hexa methylenimin	70	69	68	68
IT- Dichloracetyl -diiso- butylamid	73	72	70	70

z4bl/4 4 -•^ar-

Fortsetzung von Seite 20:

IT- Dichloracetyl -isopropylamid 75

N- Dichloracet.yl -tert. ^utylamid 75

N»N'l.bis(Diehloracetyl)- -hexamethyimaraiflU* 100 N- Dichloracet.yl -^

Q 100

73	74	73
75	75	72
100	100	100
100	100	100

Beispiel 7

Das Verfahren nach Beispiel 5 wurde für stachellose Brom-

beeren verwendet. Die Messergebnisse sind in der folgenden

Tabelle zusammengefasst:

2Q Chemische Bezeichnung Anteil der entsprechend Wurzel fas-

der Verbindung der senden bzw. überlebenden Pflanzen in %, allgemeinen Formel (l) wenn die Konzentration der Verbindung oder (II) der allgemeinen Formel (i) oder (il)

wie folgt ist:

2 mg/1 5 mg/1 10 mg/1. 20 mg/1

Unbehandelte Kontrolle 65 65 65 65

IT-Acetyl-hexamethylen-

imin 85 86 86 86

IT- Ghloracetyl -hexamethylenimin 80 82 81 80

N- Dichloracetyl -hexaraethylenimin 100 100 100 100

N- Trichioracetyl -hexa-

methylen-imin 70 70 70 70

, N- Dichloracetyl -diisobutylamid 70 6C 65 65

N- Dichloracetyl -iso propyl-amid 75 76 75 74

174

Fortsetzung von Seite 21:

N- Dichloracetyl -tert.

butyl-amid 76 78 76

Η'ϊί»'-bis (Dichloracetyl )-

*r .,...,«Λ...,.« - _{100 100 100}

IT- Dichloracetyl —1

tamid /J 100 100 100

Beispiel 8

\7ie in Beispiel 5 wurde Traubenvermehrungsstoff durch Gewebezucht hergestellt. Die angewendeten Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder (II), ihre Konzentrationen und der Prozentsatz der überlebenden Pflanzen sind der folgenden Tabelle zu entnehmen.

Chemische Bezeichnung Anteil der entsprechend Wurzel fassender Verbindung der den bzw. überlebenden Pflanzen in %, allgemeinen Formel (I) der Formel (I) odor (II) wie folgt ist

^{oder (I1}^ 2 mg/1 5 mg/1 10 mg/1 20 rag/l

Unbehandelte Kontrolle	62	62	62	62
!T-Acetyl-hexamethylen- irain	81	84	84	85
IT- Chloracetyl -hexa methylenimin	73	72	70	68
IT- Dichloracetyl -hexa methylenimin	100	100	100	100
IT- Trichloracetyl hexa methylenimin	65	65	63	63
IT- Dichloracetyl -diiso- butylamid	72	70	68	66
IT- Dichloracetyl -i3opro- pylamid	72	72	71	69
JT- Dichloracetyl -tert. butylamid ni.1T »'-bis (Dichloracetyl )- -hexarnotliylendiami^v	72 100	72 100	70 100	70 100
IT- Dicliloracetyl -hex£*&-
irreiftT^sUW^ii w	100	100	100	100

24.6 17 4. 4 .-&-

Beispiel· 9

Das Verfahren naoh Beispiel 5 wurde auch zur Vermehrung von virusfreien Apfel-Pfröpflingen verwendet. Die angewendeten Verbindungen, ihre Konzentrationen und der Prozentsatz der überlebenden Pflanzen sind der folgenden Tabelle zu entnehmen.

Chemische Bezeichnung Anteil der entsprechend Wurzel fas-

der Verbindung der senden bzw. überlebenden Pflanzen in %,

allgemeinen Formel (I) wenn die Konzentration der Verbindung

oder (II) der Formel (i) oder (II) wie folgt ist:

2 mg/1 5 mg/1 10 mg/1 20 mg/1

70 70

85 85

79 75

100 100

78 72

80 80

80 79

90 89

100 100

Unbehandelte Kontrolle	70	70
N-Acetyl-hexamethylen-
imin	83	85
N- Chloracetyl -hexame
thylenimin	83	79
N- Dichloracetyl -hexa
methylenimin	100	100
N- Trichloracetyl -hexa
methylenimin	74	78
N- Dichloracetyl -diiso-
butylaraid	80	82
N- Dichloracetyl -iso-
propylamid	80	81
N- Dichloracetyl -tert.
butylamid	90	91
NVN»Lbis(Dißhloracetyl)-
-hexamettxylOJLarniiV	100	100
N- Dichloracetyl -hexa>^-~
Weirhriarnid 0	100	100

Das erfindungsgeraässe Verfahren kann erfolgreich zur Verbeoserung des Wirkungsgrades bei der Vermehrung von sowohl Kulturpflanzen als auch Zierpflanzen durch Gewebezucht sowie <'j zur Erhöhung der Überlebensfähigkeit nach dem Aussetzen der

6 17 A U-A-

Pflänzchen eingesetzt werden·: Ausserdem sind die Stiele und Blätter der behandelten Pflänzchen stärker, sind weiter entwictce.lt, ihre Farbe ist stärker als die der unbehandelten Pflanzen und die Wachsschicht der Blätter ' ist dicker·

Das erfindungsgemässe Verfahren besitzt auch den Vorteil, dass die mit der Lösung der Verbindungen der allgemeinen Formel (l) oder (II) behandelten Pflanzen nach dem Aussetzen schneller begonnen zu wachsen und insgesamt zwei Wochen früher das für den Handel notwendige Mass erreichten.

Claims

17

VERFAHREN ZUR VERBESSERUNG DES WIRKUNGSGRADES BEI DER IN VITRO VERMEHRUNG VON KULTURPFLANZEN

PATENTANSPRÜCHE :

1. Verfahren zur Verbesserung des Wirkungsgrades bei der in vitro Vermehrung von Kulturpflanzen, dadurch gekennzeichnet , dass bei der Mikrovermehrung und/oder deu darauffolgenden Aussetzen der flüssige Nährboden oder die Pflanzen oder der Boden, in welchen die Pflanzen gepflanzt werden, mit der wässrigen Lösung einer Verbindung oder mehrerer Verbindungen der allgemeinen Formel

J /\

R C N (I),

worin R kann für ein Methyl-, Chlormethyl-, Dichlormethyl- oder Trichlormethy!radikal stehen; R, und R_? können gleich oder verschieden sein und ein Alkylradikal mit 1-10 Kohlenstoffatomen, ein Alkeny!radikal mit 2-10

A 2749-803AiR

UDEi 1982*055818

Λ 6 174 4 -χ-

Kohlenstoffatomen, ein Cycloalkylradikal mit 3-9 Kohlenstoffatomen, Phenylradikal, oder Benzylradikal oder aber Wasserstoff bedeuten mit der Bedingung, dass R^ und Rg nicht gleichzeitig Wasserstoff sein können; oder R^ und Rp zusammen mit dem benachbarten Stickstoffatom einen 5- bis 8-gliedrigen gesättigten heterozyklischen Ring bilden, der ein, zwei oder drei gleiche oder verschiedene weitere Heteroatome, vorzugsweise Stickstoff- oder Sauerstoffatome enthalten kann, oder der allgemeinen Formel

OH HO

H ! f «

R C—II (CH₂)--II—C R (II)

worin die Bedeutung von R die gleiche wie bei der allgemeinen Formel (I) und η eine ganze Zahl zwischen 1 und 8 ist, oder Gemischen beider behandelt wird oder werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung 1 - 100 mg/1 Wirkstoff enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 dadurch g e k e η η zeichnet, dass bei der Vermehrung auf flüssigem Nährboden der flüssige Währboden neben den bekannten Komponenten eine Verbindung oder mehrere Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder (II)-- worin die Substituenten wie oben definiert sind - oder Gemische beider in einer Konzentration von 1-20 mg/1 enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, da3s die Wurzeln der auf flüssigem Nährboden vermehrten Pflanzen vor dem Aussetzen in der wässrigen Lösung einer Verbindung oder mehreren Verbindungen

6 17 h U

der allgemeinen Formel (i) oder (II) - worin die Substituenten wie oben definiert sind - oder Geraischen beider mit einer Konzentration von 20-70 mg/1 getränkt werden·

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die i_n vitro vermehrten Pflanzen in einen Boden gepflanzt werden, der eine Verbindung oder mehrere Verbindungen der allgemeinen Formel (i) oder (II) - worin die Substituenten wie oben definiert sind - oder Gemische beider in einer Konzentration von 20-10 mg/1 enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e k e η η zeichnet, dass die i_n vitro vermehrten Pflanzen nach dem Ausetzen mit der Lösung einer Verbindung oder mehrerer Verbindungen der allgemeinen Formel (l) oder (II) - worin die Substituenten wie oben definiert sind oder Gemischen beider in einer Konzentration von 1-20 mg/1 besprüht werden.

7. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 6 gekennzeichnet dadurch, daß es aus dem im Anspruch 1 genannten Wirkstoff bzw. der genannten Wirkiitoffzusuminunsetzung besteht wobei es sich um eine wässrige Lösung mit 1 - 100 mg Wirkstoff pro Liter handelt.