DD208822A5 - Verfahren zur herstellung eines polypeptids, das im wesentlichen aus der aminosaeuresequenz von reifem human-immuninterferon besteht - Google Patents

Abstract

Es wird die Herstellung eines neuen, im wesentlichen reinen Polypeptids mittels rekombinanter DNA-Technik unter Verwendung einer Reihe von Expressionstraegern und Wirtskulturen beschrieben. Das Polypeptid, naemlich Human-Immun-(gamma)-interferon (IFN-y) wird in im wesentlichen einer Form isoliert. Es wird mittels der DNA- und Aminosaeuresequenzen, seiner physikalischen Eigenschaften und seiner biologischen Aktivitaet charakterisiert.

Description

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Anwendungsgebiet der Srfindung ^;

Die Erfindung betrifft das Gebiet der rekombinanten DNA- tec.hnik, Mittel und Verfahren zur Anwendung dieser-Technik bei der Ermittlung der DNA-Sequenz und der abgeleiteten Aminosäuresequenz von Human-Immuninterferon sowie dessen Herstellung und verschiedene Produkte dieses Herstellungsverfahrens und die Verwendung dieser Produkte.

Insbesondere betrifft die Erfindung die Isolierung und Identifizierung von Human-Immuninterferon kodierenden DBA-Sequenzen und den Aufbau von rekombinanten DEil-Expressionstragern, die DNA-Sequenzen enthalten, die funktionell mit expressionsbewirkenden Promotors equenz en und mit den so aufgebauten Sxpressionsträgern verknüpft sind· Ferner betrifft die Erfindung Y/irtskültursysteme, wie verschiedene Mikroorganismen und Wirbeltier-Zeilkulturen,, die mit diesen Expressionsträgern transformiert sind und somit auf die Expression der vorgenannten DIiA-S equenz en gerichtet sind· V/ei t er betrifft die Erfindung Mittel und Verfahren zur Umwandlung der Endprodukte einer derartigen Expression zu neuen Produkten, wie Arznei-/ Präparaten, die sich zur Prophylaxe oder Therapie beim-Hen-· sehen eignenο Gemäß einer bevorzugten Aüsführungsform der Erfindung werden spezielle Expressionsträger zur Verfugung gestellt, deren Sequenz so' beschaffen, ist, daß von der V'/irt3zeile Human-Immuninterferon gebildet und in reifer Form ausgeschieden wird. Schließlich betrifft die .Erfindung verschiedene Verfahren, die sich zur Herstellung der-genannten DM-Sequenzen, Expressionsträger, Wirtskultursysteme und deren

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Endprodukten eignen

Die Erfindung beruht zum Teil auf der Human-Interferon kodierenden DHA-Sequenz und abgeleiteten Aminosäuresequenz· Perner v/erden erfindungsgemäße Sequenzinformationen über die 3¹- und 5 ' -f lanki er end en 3 eqiiens en des Human-Immunint erferon-G ens aur Verfügung gestellt, wodurch dessen in vitro-Verknüpfung an Expressionsträger erleichtert wird. Insbesondere wird das 5'-DKA-Segment, das das mutmaßliche endogene SignalpolypeptId kodiert, welches unmittelbar der Aniino3äure3equenz| von mutmaßlichem reifem Human-Immuninterferon vorhergeht,; bereitgestellt. Diese Befunde ermöglichten wiederum die Entwicklung von lsittein und Vorrichtungen zur Herstellung von ausreichenden Mengen an Human-Immuninterferon-mittels rekombinanter .DHA-Technik^ so daß die Bestimmung von dessen biochemischen Eigenschaften und biologischen Aktivitäten möglich'wird· .

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen .

DruckschriftIiehe Veröffentlichungen und andere Materialien, die den technischen Hintergrund der Erfindung erläutern und in speziellen Fällen auch zusätzliche Einzelheiten bezüglich der praktischen Durchführung der Erfindung liefern, sind am Ende der Beschreibung gesondert angegeben· In der Beschreibung selbst wird auf die Nummern dieser Druckschriftenliste verwiesen« .

A. Human-Immuninterferon

Human-Interferone können auf der Basis Ihrer unterschiedlichen Antigenität sowie ihrer unterschiedlichen biologischen und biochemischen Eigenschaften in 3 Gruppen eingeteilt werden.

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Die erste Gruppe umfasst eine Familie von Leukozyten-Interferonen (<*-Interferon, LeIF oder IFN-tf), die normalerweise vorwiegend von menschlichen Blutzellen nach viralör Induktion gebildet werden. Diese Interferone konnten auf mikrobiologischem Wege hergestellt werden, wobei biologisch aktive Produkte erhalten wurden (1,2, 3)· Aufgrund ihrer biologischen Eigenschaften boten sie sich in der Klinik als therapeutische Wirkstoffe zur Behandlung von viralen Infektionen und malignen Zuständen an (U). Zur zweiten Gruppe gehört Human-Fibroblasteninterferon (ß-Interferon, FIF oder IFN-ß), das normalerweise nach viraler Induktion durch Fibroblasten gebildet wird. Es wurde ebenfalls auf mikrobiologischem Wege hergestellt und weist verschiedenste biologische Aktivitäten auf (5). Klinische Versuche lassen einen möglichen; therapeutischen Wert erkennen. Die Leukozyten- und Fibroblasten-Interferone weisen in ihren biologischen Eigenschaften sehr klare Ähnlichkeiten auf, obwohl der Grad der Homologie in bezug auf die Aminosäuren relativ gering ist. Ferner enthalten beide Gruppen von Interferonen 165 bis 166 Aminosäuren und stellen säurestabile Proteine dar. Das Human-Immuninterferon (iFN-y oder Human-/-interferon), (fesGegenstand der Erfindung ist, ist im Gegensatz zu den,o(- und ß-Interferonen beim pH-Wert 2 labil, wird vorwiegend nach mitogener Lymphozyteninduktion gebildet und unterscheidet sich auch klar im Hinblick auf die Antigeni.tät. Bis vor kurzem konnte Human-Immuriinterferon nur in sehr untergeordneten Mengen nachgewiesen werden, was offensichtlich seine Charakterisierung behinderte. In letzter Zeit wurde über eine recht weitgehende, aber immer noch partielle Reinigung von Human-Immuninterferon berichtet (6). Demnach wird diese Verbindung von durch eine Kombination aus Phytohämagglutin und einen Phorbolester stimulierte Lymphozytenkulturen gebildet und durch sequentielle chromatographische Trennvorgänge gereinigt. Dieses Verfahren führte zu einem Produkt mit einem Molekulargewicht von 58 000.

Human-Immuninterferon wurde in sehr geringen Mengen durch Translation von mRNA in Oozyten gebildet, wobei eine für Human-Immuninterferon charakteristische Interferon-Aktivität gezeigt werden konnte und die Hoffnung genährt wurde, dass Human-Interferon-cDNA zu synthetisieren und zu klonieren ist (7).

Die bisher erhaltene Menge an Immuninterferon ist mit Sicherheit nicht ausreichend, um durch eindeutige Versuche die gereinigte Komponente zu charakterisieren und deren biologische Eigenschaften zu bestimmen. Jedoch lassen in vitro-Untersuchungen an rohen Präparaten sowie in vivo-Experimente mit Mäuse-/-Interferon-Präparaten darauf schliessen, dass es die primäre Aufgabe von Immuninterferon ist, als immunoregulatorisches Agens zu wirken (8, 9). Immuninterferon weist nicht nur wie alle Human-Interferone eine antivirale und antizelluläre Aktivität auf, sondern zeigt auch mit oi- und ß-Interferon eine potenzierende Wirkung auf diese Aktivitäten (10). Ferner soll die in vitro-antiproliferative Wirkung von ^-Interferon auf Tumorzellen etwa das 10- bis 100-fache der Wirkung der anderen Interferonklassen betragen (8, 11, 12). Dieser Befund lässt zusammen mit der ausgeprägten immunoregulatorischen Rolle (8, 9) darauf schliessen, dass IFN-/ eine wesentlich stärker ausgeprägte Antitumorwirkung besitzt als IFN-oi und IFN-ß. Tatsächlich zeigen in vivo-Versuche an Mäusen mit Mäuse-IFN-^-Präparaten eine klare Überlegenheit im Vergleich zu antiviral induzierten Interferonen in bezug auf die antitumorale Wirkung gegen osteogenes Sarkom (13).

Alle diese Untersuchungen wurden aufgrund der zur Verfugung stehenden, sehr geringen Substanzmengen mit relativ unreinen Präparaten durchgeführt. Jedoch lassen diese Untersuchungen sicher einen Schluss auf die sehr wichtigen biologischen Funktionen von Immuninterferon zu. Immuninterferon besitzt

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nicht nur eine starke antivirale Wirkung, sondern auch vermutlich eine starke immunoreigulatorische und antitumorale Wirkung, wodurch es zu einem vielversprechenden potentiellen Wirkstoff für klinische Zwecke wird.

Man nahm an, dass die Anwendung der rekombinanten DNA-Technik einen sehr wirksamen Weg zur Bereitstellung der erforderlichen grösseren Mengen an Human-Immuninterferon darstellt. Unabhängig davon, ob die auf diese Weise hergestellten Materialien die Glycosylierung, die als charakteristisch für natives Material menschlichen Ursprungs gilt, umfasst oder nicht,; ist anzunehmen, dass diese Materialien biologisch aktiv sind und klinisch bei der Behandlung verschiedenster viraler, neoplastischer und immunosuppressiver Zustände oder Krankheiten eingesetzt werden können.

B. Rekombinante DNA-Technik

Die rekombinante DNA-Technik hat in letzter Zeit eine erhebliche Verfeinerung erfahren. Die Molekularbiologen sind in der Lage verschiedene DNA-Frequenzen relativ leicht zu rekombinieren und. neue DNA-Einheiten zu schaffen, die zur Bildung von erheblichen Mengen an exogenen Proteinprodukten in transformierten Mikroben fähig sind. Es stehen allgemeine Mittel und Verfahren zur in vitro-Verknüpfung von verschiedenen DNA-Fragmenten mit stumpfen oder kohäsiven Enden zur Verfügung, die zur Bildung von leistungsfähigen Expressionsträgern führen, mit denen spezielle Organismen transformiert werden können, so dass deren Syntheseleistung auf das gewünschte exogene Produkt gerichtet wird. Bei einzelnen Produkten ist dieses Verfahren jedoch recht umständlich. Die Kenntnisse sind noch nicht so weit fortgeschritten, dass regelmässig Vorhersagen über die Erfolgsaussichten gemacht werden können. Versucht man, Erfolge ohne entsprechende experimentelle Basis vorherzusagen, so läuft man Gefahr zu scheitern.

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Plasmide, d.h. nicht-chromosomale Schleifen von döppelstrangiger DNA in Bakterien und anderen Mikroben, die häufig in mehreren Kopien pro Zelle vorkommen, stellen ein Grundelement der rekombinanten DNA-Technik dar. Die in der Plasmid-DNA einkodierte Information, umfasst die Information, die erforderlich ist, das Plasmid in Tochterzellen zu reproduzieren (d.h. eine Replikationsstartstelle -origin) und im allgemeinen eine oder mehrere phänotypische Selektionseigenschaften, wie im Fall von Bakterien Resistenz gegenüber Antibiotika, die die Erkennung und bevorzugte Züchtung in selektiven Medien von Klonen der das betreffende Plasmid enthaltenden Wirtszelle erlauben. Der Wert von Plasmiden liegt darin, dass sie spezifisch durch die eine oder andere Restriktionsendonuclease oder "Restriktionsenzym", die jeweils unterschiedliche Stellen derPlasmid-DNA erkennen, gespalten werden können. Anschliessend können heterologe Gene oder Genfragmente in das Plasmid eingesetzt werden, indem man eine Endenverbindung an der Spaltungsstelle oder an rekonstruierten Enden nahe der Spaltungsstelle durchführt. Somit werden sogenannte replizierbare Expressionsträger gebildet. Die DNA-Rekombination wird ausserhalb der Zelle durchgeführt, aber der entstandene "rekombinante" replizierbare Expressionsträger oder Plasmid können in die Zellen nach einem als Transformation bekannten Verfahren eingeführt werden und es lassen sich grosse Mengen des rekombinanten Trägers durch Züchtung des Transformanten erhalten. Wird ferner das Gen in geeigneter Weise in bezug auf die Bereiche des Plasmids, die die Transkription und Translation der einkodierten DNA-Botschaft steuern, so kann der erhaltene Expressionsträger zur tatsächlichen Bildung der Polypeptidsequenz, die durch das eingesetzte Gen kodiert wird, verwendet werden; ein Vorgang, der als Expression bezeichnet wird. Die Expression wird in einem als Promotor bekannten Bereich, der durch RNA-Polymerase erkannt und gebunden wird, initiiert. » ·

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In der Transkriptionsphase der Expression erfolgt eine Entwindung der DNA, wobei sie eine Schablone für die initiierte Synthese von ^: me^senger-RNA aus der DNA-Sequenz wird. Die messenger-RNA wird wiederum in ein Polypeptid mit der durch die mRNA kodierten Aminosäuresequenz übersetzt. Jede Amino-; saure wird durch ein Nucleotidtriplett oder "Codon" kodiert, die zusammen das "Strukturgen" . bilden, d.h. den Teil, der die Aminosäuresequenz des exprimierten ν

Pölypeptidprodukts kodiert. Die Translation wird durch ein Startsignal (im allgemeinen ATG, das in der erhaltenen messenger-RNA zu AUG wird) initiiert. Sogenannte Stop-Codons definieren das Ende der Translation und daher der Bildung von weiteren Aminosäureeinheiten. Das erhaltene Produkt kann gegebenenfalls durch Lysis der Wirtszelle in mlkrobiellen Systemen und Gewinnung des Produkts durch entsprechende Reinigung von anderen Proteinen erhalten werden.

In der Praxis kann die Verwendung der rekombinanten DNA-Technik zur Expression von vollkommen heterologen Polypeptiden - sogenannte direkte Expression - oder zur Expression eines heterologen Polypeptids führen, das mit einem Teil der Aminosäuresequenz eines homologen Polypeptids verschmolzen ist. In den .letztgenannten Fällen wird das gewünschte bioaktive Produkt gelegentlich innerhalb des verschmolzenen homolog/heterologen Polypeptids biologisch inaktiv, bis es in einer extrazellulären Umgebung gespalten wird; vgl. GB-OS 2 007 676A und Wetzel, American Scientist, Bd. 68 (1980), S. 664.

C. Zellkulturtechnik

Zeil- oder Gewebekulturen sind für genetische und zellphysiologische Untersuchungen gut eingeführt. Mittel und Methoden zur Erhaltung von permanenten Zellinien, die durch sukzessive Serienübertragungen von isolierten normalen Zellen.hergestellt werden, stehen zur Verfügung. Für Forschungszwecke werden der-

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artige Zellinien auf einem festen Träger in einem flüssigen I'aedium gehalten oder in Suspensionen mit einem Gehalt an unterstützenden Nährstoffen gezüchtet· Eine Vergrößerung des Herstellungsmaßstabs zur Herstellung von großen Präparatemengen scheint nur eine ]?rage der mechanischen Möglichkeiten au sein. Zur Vertiefung wird in diesem Zusammenhang auf j;Iicrobiology, 2. Aufl., Harper and How, Publishers, Inc· !•lagerst own, Maryland (1973)» insbesondere 3· 1122 ff. und auf Scientific American, Bd. 245 (1981), S. 66 ff. verwiesen. Auf diese Literaturstellen wird vollinhaltlich Bezug genommen. ' '. · .'·; " ·'. -. '·.

Ziel der Erfindung

Es ist Ziel der Erfindung, Human-Interferon bereitzustellen und damit ein wirksames Ilittel für die medizinische Praxis.

Darlegung des V/esens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die recombinante DNA-Technik mit Erfolg zur Herstellung von Human-Immuninterferon zu verwenden, vorzugsweise in direkter Form und in Mengen., die ausreichen, Tierversuche und klinische Untersuchungen, die Vorbedingungen für eine MarktZulassung sind, au initiieren und durchzuführen. Das Produkt eignet sich für alle formen der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung des Menschen bei viralen Infektionen und malignen Zuständen sowie Zuständen mit Immuhosuppression oder Immunodefizit. Seine Formen umfassen verschiedene mögliche oligomere Formen, die assoziierte Glycosylierung einschließen können., Das Produkt wird durch gentechnik cn manipulierte Mikroorganismen oder Zellkultursystenie gebildet« Somit besteht nun die Möglichkeit, Human-Interferon wirkungsvoller als bisher herzustellen und zu isolieren. Ein \/esent 1 icher Faktor der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung besteht da-

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rin, daß es gelungen ist, einen Mikroorganismus oder eine Zellkultur genetisch so zu dirigieren, daß sie veranlaßt werden, Human-Immuninterferon, das von der Wirtszelle in reifer Form ausgeschieden wird, in isolierbaren Mengen zu bilden.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptide, das im wesentlichen aus der Aminosäuresequenz reifen Human—Immuninterferons besteht.

Erfindungsgemäß wird das Polypeptid durch Expression eines Gens, welches Human-Immuninterferon in reifer Form kodiert, in einem Mikroorganismus oder einer Zellkultur hergestellt.

Zur Herstellung von Human—Immuninterferon als direktes Expressionsprodukt, das von der Wirtszelle in reifer Form ausgeschieden wird, kann das die Sequenz von reifem Human-Immuninterferon kodierende Gen zusammen mit der 5'-flankierenden DNA, die das Signalpolypeptid kodiert, verwendet werden. Das Signalpolypeptid gilt als Hilfsmittel beim Transport des Moleküls zur Zellwand des WirtsOrganismus, wo es während des Sekretionsvorgangs von reifem Human-Interferon abgespalten wird. Diese Ausführungsform ermöglicht die Isolierung und Reinigung des gewünschten reinen Immuninterferons, ohne daß man Verfahren zu Hilfe nehmen muß, die dazu bestimmt sind, Verunreinigungen von intrazellulärem Wirtsprotein oder Zellbruchstücken zu beseitigen.

Der hier verwendete Ausdruck "reifes Human-Immuninterferon" bezieht sich auf die durch Mikroorganismen oder Zellkulturen bewerkstelligte Herstellung von Human-»Immuninterferon, das nicht vom Signalpeptid oder Präsequenzpeptid, das unmittelbar für die Translation der Human-Imiauninterferon-mRNA, begleitet ist. Somit wird erfindungsgemäß reifes Human-Immuninterferon zur

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Verfügung gestellt, das Methionin als erste Aminosäure (vorhanden aufgrund der Einfügung des ATG-Startsignalcodons vor dem Strukturgen) oder, wenn das Methionin intra- Öder extrazellulär abgespalten ist, Cystein als im allgemeinen erste Aminosäure aufweist. Demgemäss kann reifes Human-Immuninterferon auch zusammen mit einem konjugierten Protein, das sich vom herkömmlichen Signalpolypeptid unterscheidet^ hergestellt werden. Wobei das Konjugat spezifisch in einer intra- oder extrazellulären Umgebung abspaltbar ist; vgl. GB-OS 2 007 676A. Schliesslich kann das reife Human-Immuninterferon durch direkte Expression ohne die Notwendigkeit einer Abspaltung von nicht dazugehörigen, überflüssigen Polypeptiden hergestellt werden. Dies ist von besonderer Bedeutung, wenn ein bestimmter Wirt ein Signalpeptid nicht oder nicht wirksam genug entfernen kann, sofern der Expressionsträger so gebaut ist, dass er die Expression von reifem Humaninterferon zusammen mit dessen Signalpeptid bewirkt. Das auf diese Weise hergestellte reife Human-Immuninterferon wird gewonnen und soweit gereinigt, dass es als Wirkstoff bei der Behandlung von viralen und malignen Zuständen sowie bei Zuständen mit Immunosuppression oder Immunodefizit geeignet ist.

Human-Interferonwurde folgendermassen erhalten:

1. Menschliches Gewebe, beispielsweise Milzgewebe oder periphere Blutlymphozyten werden mit Mitogenen gezüchtetem die Bildung von Immuninterferon zu stimulieren.

2. Zellpellets aus diesen Zellkulturen wurden in Gegenwart von Ribonuclease-Inhibitor extrahiert, um sämtliche zytoplasmätische RNA zu isolieren.

3. Eine Oligo-dT-Säule isolierte die gesamte messenger-RNA (mRNA) in polyadenylierter Form. Diese mRNA wurde unter

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Verwendung eines Saccharose-Dichtegradienten und der Säure-Harnstoff-Gelelektrophorese einer Grössenfraktionierung unterworfen.

4. Die entsprechende mRNA (12 bis 18 S) wurde in die entsprechende einzelsträngige komplementäre DNA (cDNA) umgewandelt, aus der doppelsträngige cDNA gebildet wurde. Nach poly-dC-tailing wurde sie in einen Vektor, z.B. ein Plasmid mit einem oder mehreren phänotypischen Markern, eingesetzt.

5. Die auf diese Weise hergestellten Vektoren wurden zur Transformation von Bakterienzellen unter Bildung einer Koloniebibliothek verwendet. Sowohl aus induzierter als auch aus nicht-induzierter mRNA (auf die vorstehende Weise erhalten) hergestellte radioaktiv markierte cDNA wurde zur getrennten Ermittlung von doppelten Koloniebibliotheken verwendet. Der überschuss an cDNA wurde sodann entfernt. Die Kolonien wurden auf Röntgenfilme aufgebracht, um die induzierten cDNA-Klone zu identifizieren.

6. Von den induzierten cDNA-Klonen würde die entsprechende Plasmid-DNA isoliert und sequenziert.

7·. Die sequenzierte DNA wurde sodann in vitro zur Einfügung in einen entsprechenden Expressionsträger zugeschnitten, der zur Transformierung einer entsprechenden Wirtszelle verwendet wurde, die wiederum in einem Medium gezüchtet wurde und die Expression des gewünschten Human-Immuninterferonprodukts durchführte.

8. Das auf diese Weise hergestellte Human-Immuninterferon weist in seiner reifen Form zweifelsfrei 146 Aminosäuren auf, wobei am Beginn Cystein steht, und besitzt einen

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sehr stark basischen Charakter. Sein monomeres Molekulargewicht wurde mit 17 140 berechnet. Das Molekül kann sich zu oligomeren Formen, z.B. zur dimeren, trimeren oder fee trainer en Form, assoziieren, was möglicherweise auf die Anwesenheit von zahlreichen basischen Resten, hydrophobe Eigenschaften, Salzbrückenbildung und dergleichen zurückzuführen ist. Die hohen Molekulargewichte, die früher bei natürlichem Material festgestellt wurden (6), die auf der Basis der Aminosäuresequenz allein nicht erklärbar sind, mögen auf derartige oligomeren Formen sowie auf den Kohlenhydratbeitrag aufgrund von GIycosylierung nach der Translation zurückzuführen sein.

9. In bestimmten Wirtszellsystemen, insbesondere bei Ligatur in einem Expressionsträger, so dass eine Expression zusammen mit dem Signaipeptid von 20 Aminosäuren stattfindet, wird die reife Form von Human-Immuninterferon in das Zellkulturmedium ausgebracht, was eine unermeßliche Hilfe bei Gewinnungs- und Reinigungsverfahren bedeutet.

Nachstehend werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert.

A. Mikroorganismen/Zellkulturen 1. Bakterienstämme/Promotoren

Die hier wiedergegebenen Versuche bedienen sich unter anderem des Mikroorganismus E. coli K-12 Stamm 2 94 (end A, thi", hsr", _khsm⁺), wie er in der GB-OS 2 055 382 A beschrieben ist; Dieser Stamm erhielt bei der American Type Culture Collection die Hinterlegungsnummer ATCC 31446. Jedoch eignen sieh auch verschiedene andere Mikroorganismenstämme, darunter bekannte E. coli-Stämme, wie E. coll B, E. coli X 1776 (ATCC 31537) und E. coli W 3110 (F", X", prototroph) (ATCC 27325), sowie andere Mikroorganismenstämme, von denen viele bei anerkannten

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Hinterlegungsstellen hinterlegt und dort erhältlich sind, beispielsweise bei der American Type Culture Collection (ATCC); vgl. den ATCC-Katalog. Hierzu wird auch auf die DE-OS 2644*132 verwiesen. Beispiele für andere Mikroorganismen sind Bazillen, wie Bacillus subtilis und andere Enterobacteriaceae, von denen z.B. Salmonella typhimurium und Serratia marcescens erwähnt seien, wobei Plasmide verwendet werden, die die darin enthaltenen heterologen Gensequenzen replizieren und exprimieren können.

Zum Beispiel wurden ß-Lactamase und Lactose-Promotorsysteme mit Erfolg zur Initiierung und Aufrechterhaltung der mikrobiellen Bildung von heterologen Polypeptiden verwendet-Einzelheiten zum Aufbau und zur Herstellung dieser Promotorsysteme gehen aus Chang et al., Nature, Bd. 275 (1978), S. und Itakura et al., Science, Bd. 198 (1977),S. 1056 hervor. Auf diese Literaturstellen wird Bezug genommen. Kürzlich wurde ein System auf der Basis von Tryptophan entwickelt, das sogenannte trp-Promotorsystem. Einzelheiten bezüglich der Bauweise und Herstellung dieses System werden von Goeddel et al., Nucleic Acids Research, Bd. 8 (1980), S. 4057 und Kleid et al., Europäische Patentanmeldung 0036776 beschrieben. Auf diese Literaturstellen wird ebenfalls Bezug genommen. Es wurden zahlreiche andere mikrobielle Promotoren entdeckt und eingesetzt. Einzelheiten über deren Nucleotidsequenzen, die es dem Fachmann ermöglichen, sie funktionell mit Plasmidvektoren zu verknüpfen, wurden veröffentlicht; vgl. z.B. Siebenlist et al., Cell, Bd. 20 (I98O), S. 269. Auch auf diese Literaturstelle wird Bezug genommen.

2. Hefestämme/Hefe-Promotoren

Das Expressionssystem kann auch das Plasmid YRp7 (14, 15, 16) verwenden, welches zur Selektion und Replikation sowohl in E. coli als auch in der Hefe Saccharomyces cerevisiae fähig

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ist. Für die Selektion in Hefe enthält das Plasmid das TRP1-Gen (14, 15, 16), das eine !Complementation (Ermöglichung des Wachstums in Abwesenheit von Tryptophan) von Mutationen der Hefe in diesem Gen am Chromosom IV (17) bewirkt. Beim hier verwendeten Stamm handelte es sich um den StammRH2 18 (18), der bei der American Type Culture Collection ohne Einschränkungen hinterlegt ist (ATCC 44076). Es wird Jedoch darauf hingewiesen, dass beliebige Stämme von Saccharomyces cerevisiae, die eine Mutation aufweisen, durch die die Zelle die Eigenschaft trp1 erhält, eine Wirksame Umgebung zur Expression des das Expressionssystem enthaltenden Plasmids ist. Ein Beispiel für einen weiteren verwendbaren Stamm ist pep4-1 (19). Dieser tryptophan-auxotrophe Stamm weist einePunktmutation im Gen TRP 1 auf. :

Wird an der 5'-Seite eines Nicht-Hefegens die 5'-Flanken-DNA-Sequenz (Promotor) aus einem Hefegen (für Alkoholdehydrogenase 1) angebracht, so kann sie die Expression eines fremden Gens in der Hefe, wenn sie in ein Plasmid zur Transformation von Hefe gebracht wird, fördern. Neben einem Promotor ist für die einwandfreie Expression eines Nicht-Hefegens in Hefe eine zweite Hefesequenz am 3^f-Ende des Nicht-Hefegens am Plasmid erforderlich, so dass eine einwändfreie Termination der Transkription und Polyadehylierung in der Hefe möglich ist. Dieser Promotor kann im Rahmen der Erfindung ebenso wie andere Promotoren verwendet werden (vgl. unten). Bei bevorzugten Aüsführungsformen wird die 5'-Flankensequenz des Hefe-3-Phosphoglycerat-kinase-Gens (20) aufwärts vom Strukturgen angeordnet, wiederum gefolgt von DNA mit einem Gehalt an Termination-PolyadenylierUngs-Signalen, beispielsweise TRP1-(14, 15, 16) -Gen oder PGK (20) -Gen.

Da Hefe-5'-Flankensequenz (in Konjunktion mit 3'-Hefe-Termihations-DNA) (vgl. unten) die Expression von fremden Genen

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in Hefe fördern kann, scheint es wahrscheinlich,dass die 5'-Flankensequenzen von beliebigen hoch-exprimierten Hefegenen zur Expression von wichtigen Genprodukten verwendet werden können. Da unter diesen Umständen Hefe bis zu 65 Prozent seines löslichen Proteins als glykolytische Enzyme (2 1) exprimierte Und da dieser hohe Anteil auf die Bildung von hohen Anteilen an individuellen mRNAs zurückzuführen scheint (22), sollte es möglich sein, die 5'-Flankensequenzen von beliebigen anderen glykolytischen Genen für derartige Expressionszwecke zu verwenden, beispielsweise Enolase, Glycerinaldehyd-3^phosphat-dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phösphat-isomerase, 3-Phosphoglycerat-mutase, Pyruvat-kinase, Triosephosphat-isomerase, Phosphoglycose-isomerase und Glucokinase. Beliebige 3'-Flankensequenzen dieser Gene können auch für eine geeignete Termination und mRNA-Polyadenylierung in einem derartigen Expressionssystem verwendet werden; vgl. oben. Beispiele für einige andere hoch-exprimierte Gene sind die für saure Phosphatasen (23) und diejenigen, die aufgrund von Mutationen in den 5'-Flankenbereichen (expressionssteigernde Mutanten) - im allgemeinen aufgrund der Anwesenheit eines TYl-transponierbaren Elements (2 4) - hohe Produktionsmengen exprimieren.

Von sämtlichen vorerwähnten Genen wird angenommen, dass sie durch Hefe-RNA-Polymerase II (24) transkribiert werden. Es ist möglich, dass die Promotoren für die RNA-Polymerase I und III, die Gene für ribosomale RNA, 5S RNA und tRNAs (24, 25) transkribieren, auch für derartige Expressionskonstruktionen wertvoll sind. Schliesslich können viele Hefepromotoren auch eine transkriptionale Steuerung enthalten, so dass sie bei einer Veränderung der Wachstumsbedingungen ab- oder angestellt werden können. Beispiele für derartige Hefepromotoren sind die Gene, die die folgenden Proteine bilden: Alkohol-dehydrogenase II, Isocytochrom-c, saure Phosphatase, mit dem Stickstoff Stoffwechsel assoziierte abbauende Enzyme, Glycerin-

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aldehyd-3-phosphat-dehydrogenase und Für die Maltose- und Galactoseverwertung verantwortliehe Enzyme (22')'... Ein derartiger Steuerungsbereich ist für die Steuerung der Expression von Proteiriprodukten, insbesondere wenn ihre Bildung für die Hefe toxisch ist, sehr wertvoll. Es dürfte auch möglich sein, den Steüerungsbereich an eine 5'-Flankensequenz mit einer 5'-Flankensequenz, die einen Promotor von einem hoch exprimierten Gen enthält, zu bringen.,Dies würde zu einem Hybridpromotor führen und sollte möglieh sein, da es sich beim Steüerungsbereich und dem Promotor offensichtlich um physikalisch unterschiedliche DNA-Sequenzen handelt.

3. Zellkultursysteme/Zellkulturvektoren

Die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kulturen (Gewebekultur) wurde in den letzten Jahren zu einem Röutineverfahren; vgl. Tissue Culture, Academic Press, Hrsg. Kruse und Patterson, (1973). Hier wurde die COS-7-Linie von Affennieren-fibroplasten als Wirt für die Herstellung von Immuninterferon verwendet (25a). Jedoch können die hier geschilderten Experimente in beliebigen Zellinien durchgeführt werden, die zur Replikation und Expression eines kompatiblen Vektors fähig sind, zum Beispiel WI38-, BHK-, 3T3-, CHO-, VERO- und HeLa-Zellinien. Ferner sind für den Expressionsvektor eine Repiikationsstartstelle und ein Promotor, angeordnet vor dem zu exprimierenden Gen, zusammen mit allen erforderlichen Ribosomen-Bindungsstellen, RNA-Spleisstellen, Polyadenylierungsstellen und transkriptionalen Terminatorsequenzen erforderlich. Während im Rahmen dieser Beschreibung diese wesentlichen Elemente von SV40 genutzt werden, ist darauf hinzuweisen, dass es sich hierbei nur um bevorzugte Ausführungsformen handelt und die Erfindung keineswegs auf diese Sequenzen beschränkt ist. Beispielsweise können die Replikationsstartstellen von anderen viralen- Cz. B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV und dergleichen) Vektoren, sowie jede zelluläre Startstelle der DNA-Replikation, die in einem nicht-integrierten Zustand funktioniert, verwendet werden.

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B. Vektorsysteme

1. Direkte Expression von reifem Immuninterferon in E. coli

Bei dem Verfahren, das zur Durchführung der direkten Expression von IFN-/ in E. coli als reifem Interferön-Polypeptid (minus die Signalsequenz) verwendet wurde, handelte es sich um eine Variante des früher für menschliches Wachstumshormon (26)>und menschliches Leukozyteninterferon (1) angewendeten Verfahrens, sö-weit die Kombination von synthetischen (N-terminalen) und cDNAs betroffen sind. .

Aufgrund der Ableitung der Nucleotidsequenz von p69 (vgl. unten) und aufgrund eines Vergleichs mit der bekannten Spaltungsstelle zwischen Signalpeptid und reifem Polypeptid für einige IFN-<xs (2) besitzt IFN-/ ein hydrophobes Signalpeptid von 20 Aminosäuren, gefolgt von 146 Aminosäuren von reifem IFN-y (Fig. 5). Wie in Fig. 7 gezeigt, ist eine BstNI-Restriktionsendonuclease-Stelle zweckmässigerweise an der Aminosäure 4 von reifem IFN-/ positioniert. 2 synthetische Desoxypligonucleotide wurden hergestellt, die ein ATG-translationales Initiierungscodon, Codone für die Aminosäuren 1, 2 und 3 (Cystein-Tyrosin-Gystein) enthalten und ein EcoRI-kohäsives Ende schaffen. Diese Desoxyoligonucleotide werden mit einem 100-vBasenpaar-BstNI-PstI-Fragment von p69 verknüpft, um ein synthetisch-natürliches 1115 Basenpaar-Hybridgen aufzubauen, das IFN-/ kodiert und das durch EcoRI-Pstl-Restriktionsstellen begrenzt ist. Dieses Gen wurde in das Plasmld pLelF A trp 103 zwischen den EcoRI- und Pstl-Stellen eingesetzt, wodurch das Expressionsplasmid pIFN-/ trp 48 erhalten wurde. In diesem Plasmid wird das IFN-^ -Gen unter der Steuerung des E. coli trp-Promotors exprimiert. (pLelF A trp 103 ist ein Derivat von pLelF A 25, in dem die EcoRI-Stelle distal zum LeIF A-Gen entfernt wurde. Das Verfahren zur Entfernung dieser EcoRI-Stelle wurde früher beschrieben (27)).

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2. Expression in Hefe

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Um ein heterologes Gen wie die cDNA für Immuninterferon in Hefe zu exprimieren, war es notwendig, einen Plasmidvektor rait einem Gehalt an 4 Komponenten aufzubauen. Bei. der ersten Komponente handelt es sich um den Teil, der die Transformation von E. coli und Hefe ermöglicht und der somit ein selektierbares Gen von beiden Organismen enthalten muss. (In diesem Fall handelt es sich um das Gen für die Ampicillin-Resistenz von E. coli und das Gen TRPI von Hefe). Diese Komponente benötigt auch eine Replikationsstartstelle von beiden Organismen, die als Plasmid-DNA in beiden Organismen aufrechtzuerhalten ist. (In diesem Fall handelt es sich um die E. coÜ-Startstelle aus pBR322 und die ars1-Startstelle vom Chromosom III von Hefe)

Bei der zweiten Komponente des Plasmids handelt es sich um eine 5'-Flankensequenz eines hoch exprimierten Hefegens, um die Transkription eines abwärts plazierten Strukturgens zu fördern. In diesem Fall wird als 5'-Flankensequenz die Sequenz aus dem Hefe-3-Phosphoglycerat-kinase .(PGK)-Gen verwendet. Dieses Fragment ist so gebaut, dass ATG der PGK-Struktursequenz sowie 8 bp (bp = Basenpaar) aufwärts von dieser ATG entfernt werden. Diese Sequenz wurde ersetzt durch eine Sequenz, die sowohl eine Xbal- als auch eine EcoRI-Restriktiönsstelle zur zweckmässigen Verknüpfung dieser 5'-Flankensequenz an das Strukturgen enthielt.

Bei der dritten Komponente des Systems handelt es sich um ein Strukturgen, das so aufgebaut ist, dass es sowohl ATG-Translations-Startals auch Translations-Stopsignale enthält. Die Isolierung und der Aufbau eines derartigen Gens ist weiter unten beschrieben.

Bei der vierten Komponente handelt es sich um eine Hefe-DNA-Sequenz, die die 3'-Flankensequenz eines Hefegens enthält,

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welches die geeigneten Signale zur Beendigung der Transkription und zur Polyadenylierung enthält.

Bei Anwesenheit all dieser Komponenten wurde in Hefe Immuninterferon gebildet.

3. Expression in Säugetier-Zellkultur

Die Strategie zur Synthese von Immuninterferon in Säugetier-Zellkulturen beruhte auf der Entwicklung eines Vektors der sowohl zur autonomen Replikation als auch Expression eines fremden Gens unter Steuerung einer heterologen Transkriptionseinheit fähig ist. Die Replikation dieses Vektors in Gewebekultur wurde erreicht, indem man eine DNA-Replikationsstart-•steile (abgeleitet vom SV¹JO-Virus) sowie eine Hilfsfunktion (T-Antigen) durch Einführung des Vektors in eine-'.ZeIlinie., die dieses Antigen endogen exprimiert, bereitstellte (28, 29). Der späte Promotor von SV40-Virus ging dem Strukturgen von Interferon voran und gewährleistete die Transkription des Gens.

Der zur Erzielung der Expression von IFN-^ verwendete Vektor bestand aus pBR322-Sequenzen, die einen selektierbaren Marker für die Selektion in E. coli (Ampicillin-Resistenz) und eine E. coli-Startstelle für die DNA-Replikation bereitstellten. Diese Sequenzen wurden vom Plasmid pML-1 (2 8) abgeleitet und umfassen den Bereich von der EcoRI-Restriktionsstelle bis zur BamHI-Restriktionsstelle. Die SV^O-Startstelle leitete sich von einem 3<42-Basenpaar-PvuII-HindIII-Fragment ab, das diesen Bereich umfasste (30, 31) (beide Enden waren in EcoRI-Enden umgewandelt). Diese Sequenzen kodieren abgesehen davon, dass sie die virale Startstelle für die DNA-Replikation enthalten, den Promotor sowohl für die frühe als auch für die späte Transkriptionseinheit. Die Orientierung des SV40-Start-

LkkUO I I

stellenbereichs war so beschaffen, dass sich der Promotor für die späte Transkriptionseinheit proximal zu dem Interferon kodierenden Gen befand.

Fig. 1 zeigt das Ergebnis einer Saccharosegradientenzentrifugation von induzierter PBL (periphere Blutlymphozyten)-PoIy(A)+ RNA.. 2 Peaks von Interferonaktivität (schraffierte Kästchen) mit den Grossen 12S und 16S wurden beobachtet. Die Positionen der ribosomalen RNA-Marker (unabhängig zentrifugiert) sind oberhalb des Absorptionsprofils angegeben.

Fig. 2 zeigt das Ergebnis einer Elektrophorese von induzierter PBL-PoIy(A)+ RNA durch Säure-Harnstoff-Agarose. Nurein Peak mit Aktivität wurde beobachtet, der zusammen mit 18S RNA wanderte. Die Positionen!von ribosomalen RNA-Markern, die in einer benachbarten Bahn der Elektrophorese unterworfen wurden und durch Anfärben mit-Ethidiumbromid sichtbar gemacht wurden, sind oberhalb des Aktivitätsprofils angegeben.

Fig. 3 zeigt ein Hybridisierungsmuster von 96 Kolonien mit

' ' ' ' 32

induzierten und nicht-induzierten, mit P-markierten cDNA-Tracern. 96 individuelle Transformanten wurden in einer Mikrotiterplatte gezüchtet und durch Replikaplattierung auf 2 Nitrocellulosemembranen aufgebracht. Sodann wurden die Filter mit

32 ' ·

P-cDNA-Tracern, die entweder aus induzierter mRNA (oben) oder

aus aus nicht-induzierten PBL-Kulturen isolierter mRNA (nicht induziert: unten) hergestellt worden waren, hybridisiert. Die Filter wurden zur Entfernung von nicht-hybridisierter RNA gewaschen und sodann auf einen Röntgenfilm gelegt. Dieser Filtersatz ist repräsentativ für 86 derartige Sätze (8300 unabhängige Kolonien). Ein Beispiel für einen "induzierten" Klon ist mit H12 bezeichnet.

Fig. 4 ist eine Restriktionsendonuclease-Karte des Klon 69-cDNA-Inserts. Das cDNA-Insert wird durch Pstl-Stellen (Punkte

24408

an beiden Enden) und durch Öligo-dC-dG-Schwänze (einzelne Linien) begrenzt. Die Anzahl und Grosse der durch Spaltung mit Restriktionsnuclease gebildeten Fragmente wurde durch Elektrophorese an 6-prozentigem Acrylamidgel ermittelt. Die Positionen der.Stellen wurden durch Nucleinsäuresequenzierung (dargestellt in Fig. 5) bestätigt. Der kodierende Bereich des grössten offenen Leserasters ist mit einem Kästchen versehen und der schraffierte Bereich stellt die mutmassliche Signalpeptidsequenz mit 20 Resten dar. Der punktierte Bereich stellt die Sequenz von reifem IFN (146 Aminosäuren) dar. Das 5'-Ende von mRNA befindet sich auf der linken Seite und das 3'-Ende auf der rechten Seite.

Fig. 5 zeigt die Nucleotidsequenz des Plasmid peQ-cDNA-Inserts, erläutert jedoch die geläufigste Allelform von IFN-y. Die abgeleitete AtninösäuresejEriz des längsten offenen Ableserasters ist ebenfalls dargestellt. Die mutmassliche Signalsequenz wird durch die mit S1 bis S20 bezeichneten Reste wiedergegeben.

Fig. 6 stellt einen Vergleich der IFN-/ -mRNA-Struktur mit der entsprechenden Struktur von Leukozyteninterferon (iFN-oO und Fibroblasteninterferon (IFN-ß) dar. Die Klon 69-mRNA (mit Immuninterferon beschriftet) enthält signifikant grössere Anteile an nicht-übersetzten Sequenzen.

Fig. 7 zeigt eine schematische Darstellung des Aufbaus des IFN-J-Expressionsplasmids pIFN-f -trp 48. Ausgangsmaterial ist das 1250-Basenpaar-PstI-cDNA-Insert von Plasmid p69.

Fig. 8 zeigt eine Darstellung des zur Expression von IFN-γ in Affenzellen verwendeten Plasmids.

Fig. 9 zeigt eine Southern-Hybri'disierung von 8 unterschiedlichen EcoRI-verdauten menschlichen Genpm-DNAs, hybridisiert

Ί2 ' · '

mit einem ^J P-markierten 600 Basenpaar-Ddel-Fragment vom cDNA-Insert von p69- 2 EcoRI-Fragmente hybridisieren klar mit dem Tracer in jeder DNA-Probe.

ι ι

Fig. 10 zeigt eine Southern-Hybridisierung von menschlicher Genom-DNA, verdaut mit 6 verschiedenen Restriktionsendonucle asen, hybridisiert mit dem ³²P-markierten Tracer von p69.

Fig. 11..zeigt schematisch die Restriktionskarte des 3,1 Hindlll-Inserts von Vektor pB1, aus dem der PGK-Promotor isoliert wurde. Angegeben ist die Insertion einer EcoRI-Stelle und einer Xbal-Stelle" in der 5 '-Flanken-DNA des.PGK-Gehs.

Fig. 12 zeigt die 5'-Flankensequenz zusammen mit der Initiationscodonsequenz für das PGK-Gen vor der Insertion einer Xbal- und einer EcoRI-Stelle.

Fig. 13 zeigt schematisch Techniken, die zur Insertion einer Xbal-Stelle in Position 8 im PGK-Promotor und zur Isolierung eines 39bp-Fragments der 5'-Flankensequenz von PGK mit einem Gehalt an diesem Xbal-Ende und einem Sau3A-Ende.

Fig. 14 zeigt sehematisch den Bau eines 300bp-Fragments mit dem obigen 39bp-Fragment zuzüglich der .PGK^-5 '-Flankensequenz (265 bp) von Pvul bis Sau3A (vgl. Fig. 11) und einer EcoRI-, Stelle benachbart zu Xbal.

Fig. 15 zeigt sehematisch den Aufbau des 1500 bp-PGK-^Promotor-Fragments (Hindlll/EcoRI), das zusätzlich zu dem in Fig. 14 aufgebauten Fragment ein 1300bp Hindlll- bis Pvul-Fragment aus der PGK-5'-Flankensequenz (vgl. Fig. 11) enthält.

Fig. 16 erläutert die Zusammensetzung eines Expressionsvektors für Human-Immuninterferon in Hefe, der den modifizierten PGK-Promotor,die IFN-/-cDNA und den Terminator-Bereich des Hefe-PGK-Gens, wie hier näher erläutert, enthält.

Nachstehend folgt eine ausführliche Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung.

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A. Quelle von IFN-^-

Periphere Blutlymphozyten (PBLs) wurden durch Leukophorese von menschlichen Spendern gewonnen. Die PBLs wurden durch FicoIl^Hypaque-Gradientenzentrifugation weiter gereinigt und in RPMI 1640 , 1 Prozent L-Glutamin, 25 millimolar HEPES und 1 Prozent Penicillin-Streptomycin-Lösung (Gibco, Grand Island, NY) bis zu einer Konzentration von 5x10 Zellen/ml gezüchtet. Diese Zellen wurden durch das Mitogen Staphylococcen-Entero- toxin'B (1 ^g/ml) zur Bildung von IFN-/· induziert Und 2 4 bis 48 Stunden bei 37°C in 5 Prozent CO₂ gezüchtet. Die PBL-Kulturen wurden zur Erhöhung der relativen Ausbeute an IFN-/"-Aktivität mit 0,1 ug/ml Desacetylthymosin-oc-1 versetzt.

B. Isolierung von messenger-RNA

Die gesamte RNA aus PBL-Kulturen wurde im wesentlichen nach dem Verfahren von S.L. Berger et al. (33) extrahiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletisiert und sodann in 10 millimolar NaCl, 10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 1,5 millimolar MgCIp und 10 millimolar Ribonucleqsid-Vanadyl-Komplex resuspendiert. Die Zellen wurden durch Zusatz von NP-40 (Endkonzentration 1 Prozent) lysiert. Die Zellkerne wurden durch Zentrifugation pelletisiert. Der überstand enthielt die gesamte RNA, die durch mehrfache Phenol- und Chlorofbrmextraktionen weiter gereinigt wurde. Die wässrige Phase würde auf 0,2 m NaCl gebracht. Sodann wurde die gesamte RNA durch Zugabe von 2 Volumina Äthanol ausgefällt. RNA aus nicht-induzierten (nicht-stimulierten) Kulturen wurde mit den gleichen Verfahren isoliert. -Die Oligo-dT-Cellulose-Chromatographie wurde angewendet, um mRKA aus den Gesamt-RNA-Präpafaten zu reinigen (34). Typische Ausbeuten aus 1 bis Liter PBL-Kulturen betrugen 5 bis 10 mg gesamte RNA und bis 200 ^g PoIy(A)+ RNA.

Z4 4UÖ I 1 ₂₄

C. Grossenfraktlonierung von mRNA

2 Verfahren wurden zur Fraktionierung von mRNA-Präparaten angewendet. Diese Verfahren wurden unabhängig (und nicht zusammen) angewendet und ergaben jeweils eine signifikante Anreicherung an IFN-Z'-inRNA.

Eine Saccharosegradientenzentrifugation in Gegenwart von denaturierend wirkendem Formamid wurde zur Fraktionierung von mRNA angewendet. Gradienten von 5 bis 25 Prozent Saccharose in 70 Prozent Formamid (32) wurden 19 Stunden bei 20⁰C und 154 000 g zentrifugiert. Sodann wurden nacheinander Fraktionen von 0,5 ml von oben aus dem Gradienten entnommen und mit Äthanol gefällt. Eine Aliquotmenge wurde in Xenopus laevis-Oozyten zur Translation der mRNA injiziert (35)· Nach 24-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Inkubationsmedium auf seine antivirale Aktivität getestet, wozu ein Standardhemmtest zur Ermittlung der zytopathischen Wirkung unter Verwendung des vesikuläre Stomatitis erregenden Virus (Indiana-Stamm) oder von Eneephalomyocarditis^Vifus auf WISH (Humanamnion)-Zellen gemäss Stewart (36) angewendet wurde, mit der Abänderung, dass die Proben vor der Infektion mit dem Virus 24 Stunden (anstatt von 4 Stunden) mit den Zellen inkubiert wurden. Folgerichtig wurden 2 Aktivitätspeaks in der im Saccharosegradienten fraktionierten RNA beobachtet (Fig. 1). Ein Peak sedimentierte entsprechend einer berechneten Grosse von 12S und enthielt 100 bis 400 Einheiten/ml an antiviraler Aktivität (verglichen mit IFN-<-Standard) pro 1 ^ug injizierter RNA. Der andere Aktivitätspeak sedimentierte entsprechend einer Grosse von 16S und enthielt etwa die Hälfte der Aktivität des langsamer sedimentierenden Peaks. Beide Aktivitätspeaks sind offenbar auf IFN-/'zurückzuführen, da keine Aktivität festgestellt wurde, wenn die gleichen Fraktionen an Rinderzellinie (MDBK), die nicht durch Human-IFN--/'geschützt ist, untersucht wurden. Sowohl IFN-od- als auch IFN-ß-Aktivität liesse sich mit dem MDBK-Test leicht nachweisen (5).

2ΛΛ 08 1 1

2^Γ·>

Die Fraktionierung von mRNA (200 /ig) wurde auch mittels Elektrophorese durch Säure-Harnstoff-Agarose-Gele durchgeführt. Das Platten-Agarose-Gel (37, 38) war aus 1,75 Prozent Agarose, 0,025 m Natriumcitrat (pH-Wert 3,8) und 6 m Harnstoff zusammengesetzt. Die Elektrophorese wurde 7 Stunden bei 25 Milliamper-e und 4⁰G durchgeführt. Das Gel wurde sodann mit einer Rasierklinge in Scheiben geschnitten. Die einzelnen Scheiben wurden bei 7O⁰C geschmolzen und 2 mal mit Phenol und 1 mal mit Chloroform extrahiert. Die Fraktionen wurden sodann der Äthanolfäl^- lung unterworfen und anschliessend auf IFN-/'-mRNA durch Injektion in Xenopus laevis-Oozyten und auf antivirale Aktivität getestet. In den im Gel fraktionierten Proben wurde nur ein Aktivitätspeak beobachtet (Fig. 2). Dieser Peak wanderte gemeinsam mit 18S RNA und wies eine Aktivität von 600 Einheiten/ml pro 1 jjg injizierter RNA auf. Diese Aktivität erwies sich ebenfalls IFN-/-spezifisch, da sie MDBK-Zellen nicht schützte*

Dieser Grössenunterschied zwischen den Aktivitätspeaks von Saccharosegradienten (12S und 16S) und Säure-Harnstoff-Gelen (18S) kann durch die Feststellung erklärt werden, dass diese unabhängigen Fraktionierungsmethoden nicht unter vollständigen Denaturierungsbedingungen durchgeführt wurden-

D. Herstellung einer Koloniebibliothek mit einem Gehalt an IFN-^-Sequenzen ,

3 Ug durch Gelfraktionierung erhaltene mRNA wurde zur Herstellung von doppelsträngiger cDNA gemäss Standardverfahren (26, 39) verwendet. Die cDNA wurde der Grössenfraktionierung an 6-prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen. 2 Fraktionen mit unterschiedlichen Grossen wurden durch Elektroelution erhalten, nämlich 138 ng 800 bis 1500 bp und 204 ng >1500 bp. Von jeder cDNA-Grösse wurden 35 ng-Portionen mit Desoxy-C-Resten unter Verwendung von terminaler Desoxynucleotidyltransferase (40) erweitert und mit 300 ng des Plasmids pBR322

UOII

(41), das iri ähnlicher Weise mit Desoxy-G-Resten an der Pstl-Stelle geschwänzt war (40 ),verschmolzen. Die verschmolzenen Gemische wurden sodann in E. coli K12 Stamm 294 transformiert. Etwa 8000 Transformanten wurden mit der .800 bis 1500 bp cDNA und 400 Transformanten mit der >1500 bp cDNA erhalten.

E. Sichten (Screening) der Koloniebibliothek auf induzierte cDNAs :

Die Kolonien würden einzeln in Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit einem Gehalt an LB (58) + 5 ^g/ml Tetracyclin inokuliert und nach Zusatz von DMSO in einer Menge von 7 Prozent bei -20⁰C gelagert. 2 Kopien der Koloniebibliothek wurden auf Nitrocellulosefiltern gezüchtet. Die DNA aus jeder Kolonie wurde nach dem Grunstein-Hogness-Verfahren (42) am Filter fixiert. .

32 ' ' ' ' · ' ' Mit p-markierte cDNA-Tracer wurden unter Verwendung von i8S-gelfraktionierter mRNA aus induzierten und nicht-induzierten PBL-Kulturen hergestellt. Oligo-dT.p \.q wurde als Primer verwendet.. Die Reäktionsbedingungen entsprachen denen von (T)... Filter mit einem Gehalt an 8000 Transformanten aus der 600 bis 1500 bp-cDNA-Grössenfraktion und an 400 Transformanten aus der >1500 bp-cDNA-Grössenfraktion wurden mit 20x10 cpm induziertem ² P-cDNA hybridisiert. Ein zweiter Filtersatz wurde mit 20x10 cpm nicht-induzierter -⁵P-CDNA hybridisiert. Die Hybridisierungszeit betrug 16 Stünden, wobei die Bedingungen gemäss Fritsch et al. (43) angewendet wurden. Die Filter wurden gründlich gewaschen (43) und sodann 16 bis 48 Stunden auf Kodak XR-5-Röntgenfilme unter Verwendung von DuPont Lightning-Plus-Verstärkerschirmen gelegt. Die Hybridisierungsmuster mit den beiden Tracern wurden für die einzelnen Kolonien verglichen. Etwa 40 Prozent der Kolonien hybridisierten klar mit beiden Tracern, während etwa 50 Prozent der Kolonien mit keinem der Tracer hybridisierten (vgl.

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Fig. 3). 124 Kolonien zeigten eine signifikante Hybridisierung mit dem induzierten Tracer, während die Hybridisierung mit dem nicht-induzierten Tracer nicht nachweisbar, oder schwächer war. Diese Kolonien wurden einzeln in Vertiefungen von Mikrotiterplatten inokuliert, gezüchtet, auf Nitrocellulosefilter übertragen und, wie vorstehend erläutert, mit den gleichen beiden Tracern hybridisiert. Plasmid-DNA, die aus jeder dieser Kolonien durch ein Schnellverfahren (44) isoliert worden war, wurde ebenfalls an Nitrocellulosefilter gebunden und mit den induzierten und nicht-induzierten Tracern hybridisiert (45). DNA aus 22 Kolonien hybridisierten nur mit dem induzierten Tracer und wurden als "induzierte" Kolonien bezeichnet.

F. Charakterisierung von induzierten Kolonien

Plasmid-DNA wurde aus 5 der induzierten Kolonien hergestellt (46) und zur Charakterisierung der cDNA-Inserts verwendet. Unter Verwendung von Restriktionsendonuclease hergestellte Karten der 5 induzierten Plasmide (p67, p68, p69, p71 und p72 ) deuteten darauf hin, dass 4 Plasmide ähnliche Restriktionsnuclease-Karten aufwiesen. Diese 4 Plasmide (p67, p69, p71 und p72) hatten jeweils 4 Ddel-Stellen, 2 HinfI-Stellen und eine einzelne Rsal-Stelle im cDNA-Insert. Das fünfte Plasmid (p68) enthielt ein gemeinsames Ddel-Fragment und war offenbar ein kurzer mit den anderen 4 Plasmiden verwandter cDNA-Klon. Die bei der Restriktionsnuclease-Kartenbildüng nahegelegte Homologie wurde durch Hybridisierung bestätigt. Ein aus dem 600 bp-Ddel-Fragment des p67-Plasmids hergestellter (47) P-markierter DNA-Tracer wurde zur Hybridisierung (42) der übrigen induzierten Kolonien verwendet. Sämtliche 5 mit Restriktionsnuclease kartierten Kolonien ergaben eine Kreuzhybridisierung mit diesem Tracer, ebenso verhielten sich 17 andere Kolonien der 124 beim Screening auf

uo ι ι 28

induzierte/nicht-induzierte Kolonien ausgewählten 124 Kolonien. Die Länge des cDNÄ-lnsertS in jedem dieser kreuzhybridisieften Plasmide wurde durch Pstl-Verdauung und Gelelektrophorese bestimmt. Der Klon mit dem längsten cDNA-Insert war offensichtlich der Klon 69 mit einer Insertlärige von 1200 bis 1400 bp. Diese DNA wurde für sämtliche weiteren Versuche verwendet. Seine RestriktiOnsendonuclease-Karte ist in Fig. 4 dargestellt.

Das cDNA-Insert in p69 erwies sich aufgrund seines Expressionsprodukts, das in 3 unabhängigen Expressionssystemen hergestellt wurde und antivirale Aktivität ergab (für Einzelheiten siehe weiter unten), als IFN- /'-cDNA.

G. Sequenzanalyse des cDNA-Inserts yon p69

Die vollständige·' Nucleotidsequenz des Plasmid p69-cDNA-Inserts wurde durch das Didesoxynucleotid-Kettenendenverfahren (48) nach Subkloniereh der Fragmente in den M13-Vektor-mp7 (49) und durch das chemische Verfahren gemäss Maxam-Gilbert (52) bestimmt. Der längste offene Ableseraster kodiert ein Protein yon 166^ Aminosäuren; vgl. Fig. 5. Beim ersten kodierten Rest handelt es sich um das erste met-Codon, das am 5'-Ende voncDNA auftritt. Die ersten 20 Reste am Aminoende dienen wahrscheinlich als Signalsequenz für die Sekretion der übrigen 146 Aminosäuren. Diese mutmassliche Signalsequenz hat mit anderen charakteristischen Signalsequenzen Gemeinsamkeiten, beispielsweise in bezug auf Grosse und hydrophobe Eigenschaften Ferner sind die 4 Aminosäuren an der mutmasslichen Spaltungssequenz (ser-leu-gly-cys) identisch mit den 4 an der Spaltsteile von verschiedenen Leukozyten-Interferonen (LeIF B, C, D, F und H (2)) aufgefundenen Resten. Die kodierte reife Aminosäuresequenz von 146 Aminosäuren weist ein Molekulargewicht von 17 140 auf.

Es gibt 2 potentielle Glycosylierungsstellen (50) in der kodierten Proteinsequenz, nämlich an den Aminosäuren 28 bis 30

2Λ Λ 08 1 1

(asn-gly-thr) und an den Aminosäuren 100 bis 102 (asn-tyr-ser). Die Existenz dieser Positionen stimmt mit der beobachteten Glycosyliefung von Human-IFN-/" (6, 51) überein. Ferner liegen die einzigen beiden Cysteinreste (Positionen 1 und 3) sterisch zu eng beieinander, als dass sie eine Disulfidbrücke bilden könnten, was mit der beobachteten Stabilität von IFN-ιλ in Gegenwart von Reduktionsmitteln, wie ß-Mercaptoäthanol, (51) übereinstimmt. Die abgeleitete reife Aminosäuresequenz ist im allgemeinen recht stark basisch, mit insgesamt 30 Lysin-, Arginin- und Histidinresten und nur insgesamt 19 Asparaginsäure-; und Glutaminsäureresten.

Die mRNA-Struktur von IFN-J^, abgeleitet aus der DNA-Sequenz des Plasmids p69 unterscheidet sich deutlich von IFN-oC (1, 2)- oder IFN-ß (5)-mRNA. Wie aus Fig. 6 hervorgeht, ist der Kodierungsbereich von IFN-^ kürzer, während die 5'-nicht-über-.setzten' und. 3'-nicht-übersetzten Bereiche wesentlich länger als bei IFN-*- oder IFN-ß sind.

H. Direkte Expression von reifem Immuninterferon in E. coli

Es wird auf Fig. 7 Bezug genommen. 50 jag Plasmid p69 wurden mit Pstl verdaut. Das 1250-Basenpaar-Insert wurde durch Gelelektrophorese an 6-prozentigem Polyacrylamidgel isoliert. Etv/a 10 ^g dieses Inserts wurden durch Elektroelution aus dem Gel gewonnen. 5 ,ug dieses Pstl-Fragments wurden partiell mit 3 Einheiten BstNI (Bethesda Research Labs) 15 Minuten bei.37⁰C verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde an 6-prozentigem Polyacrylamidgel gereinigt. Etwa 0,5^Ug des gewünschten 1100-Basenpaar-BstNI-Pstl-Fragments wurden gewonnen. Die beiden angegebenen Desoxyoligonucleotide 5'-dAATTCATGTGTTATTGTC und 5^dTGACAATAACACATG (Fig. 7) wurden nach der Phosphotriester-Methode (53) synthetisiert und folgendermassen phosphoryliert. Jeweils 100 pMol der Desoxyoligonucleotide wurden in 30 μΐ 60 millimolarem Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 8, 10 millimolar MgCl₂, 15 millimolar ß-Mercaptoäthanol und 2 40 ^uCi ³²

£4,4 UBl 1

ATP (Amershäm, 5000 CiAmMoI-) vereinigt. 12 Einheiten T4-Polynucleotid-kinase wurden zugesetzt. Die Umsetzung Wurde 30 Minuten bei 3'T⁰C durchgeführt. 1 ^u-I- 10 millimolares ATP wurde zugesetzt. Die Reaktion wurde weitere 20 Minuten durchgeführt. Nach 0-OH/CHCl_-Extraktion wurden die Oligomeren mit 0,25 >ug des '.B-StNI-P-StI 1100-Basenpaar-Fragments kombiniert und mit Äthanol gefällt* Diese Fragmente wurden 2 Stünden bei 20⁰C in 30 yul 20 millimolarem Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5, 10 millimolar MgCl₂, 1° millimolar Dithiothreit, 0,5 millimolar ATP und 10 Einheiten T4-DNA-Ligase verknüpft. Das Gemisch wurde 1 Stunde mit 30Einheiten Pstl und 30 Einheiten EcoRI (zur Beseitigung der Polymerisation durch Verknüpfung von kohäsiven Termini) verdaut und der Elektrophorese an 6-prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen. Das 1115-Basenpaar-Produkt (110 000 cpm) wurde durch Elektroelution ge-

- ' _ . ' . . . '. "-. ' j '

wonnen. : _;; :.'

Bei dem Plasmid pLeIF A trp 103 (vgl. Fig. 7) handelt es sich um ein Derivat des Plasmids pLeIF A 25 (1), in dem die EcoRI-Stelle distal zum LeIF Α-Gen entfernt worden ist (27). 3 pLeIF A trp 103 wurden 90 Minuten bei 37°C mit 20 Einheiten EcoRI und 20 Einheiten Pstl verdaut und der Eiektrophorese an 6-prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen. Das grösse Vektorsegraent C" 3900 Basenpaare) wurde durch Elektroelution gewonnen. Das 1115-Basenpaar-EeoRI-PstI-IFN-y-DNA-Fragment wurde in 0,15^ug des hergestellten Vektors eingebunden. Durch Transformation von E. coli K-12 Stamm 2 94 (ATCC 31446) erhält man 120 gegen Tetracyclin resistente Kolonien. Plasmid-DNA wurde aus 60 dieser Transformanten hergestellt und mit EcoRI und Pstl verdaut. 3 dieser Plasmide enthielten das gewünschte 1115-Basenpaar-EcoRI-PstI-Fragment. Die DMÄ~Sequenzanalyse bestätigte, dass diese Plasmide an den Verbindungen zwischen dem trp-Promotor, synthetischer DNA und cDNA die gewünschte Nucleotidsequenz aufwiesen. Eines dieser Plasmide, nämlich pIFN-y-trp 48 wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt.

Dieses Plasmid wurde zur Transformation von E. coli K-12 Stamm W3110 (ATCC 27325) verwendet.

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I. Genstruktur der IFN-/'-Kodierseqzenz

Die Struktur des IFN-y" kodierenden Gens wurde durch Southern-Hybridisierung analysiert. Bei diesem Verfahren (54); werden 5 ^g hochmolekdlare Human-Lymphozyten-DNA (hergestellt gemäss 55) vollständig mit verschiedenen Restriktionsendonueleasen verdaut, der Elektrophorese an 1,0-prozentigen Agarosegelen unterworfen (56) und auf ein Nitrocellulosefilter geblottet

32 ' ' ' -.

(54). Ein P-markierter DNA-Tracer wurde aus einem 600 bp-Ddel-Fragment des cDNA-Inserts von p69 hergestellt (47) und mit dem

. · '" ' . . ' '" ' 7 Nitrocellulose-DNA-Blot hybridisiert (43). Es wurden 10 cpm des Tracers Ί6 Stunden hybridisiert und sodann gemäss (43) gewaschen. 8 Genom-DNA-Proben von verschiedenen menschlichen Spendern wurden mit EcoRI-Restriktionsendonuclease verdaut

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und mit dem p69- P-markierten Tracer·hybridisiert. Wie in Fig. 9 gezeigt, werden 2 klare Hybridisierungssignale mit Grossen von 8,8 Kilobasenpaaren (kbp) und 2,0 kbp beobachtet, wobei die Grosse durch Beweglichkeitsvergleich mit Hindlll, verdaut mit Λ DNA, geschätzt wurde. Dies könnte das Ergebnis von 2 IFN-jT-Genen oder eines einzelnen Gens, gespalten durch eine EcoRI-Stelle, sein« Da p69~cDNA keine EcoRI-Stelle enthält, wäre eine intervenierende Sequenz (Intron) mit einer internen EcoRI-Stelle erforderlich, um ein einzelnes Gen zu erklären. Um zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu unterscheiden, wurde eine weitere Southern-Hybridisierung mit dem gleichen.Tracer gegen 5 andere Endonuclease-Verdauungsprodukte einer einzelnen Human-DNA durchgeführt (Fig. 10). Es wurden 2 hybridisierende DMA-Fragmente mit 2 anderen Endonuclease-Verdauungsprodukten, PvuII (6,7 kbp und 4,0 kbp) und Hindi (2,5 kbp und 2,2 kbp) beobachtet. Jedoch liefern 3 Endonuclease-Verdauungsmuster nur ein einzelnes hybridisierendes DNA-Fragment: Hindlll (9,0 kbp) BgIII (11,5 kbp) und BamHI (9,5 kpb). 2 IFN-^-Gene müssten in einem unüblich engen Abstand (weniger als 9,0 kbp) verknüpft sein, damit sie im gleichen Hindlll-Hybridisierungsfragment enthalten sein könnten. Dieses Ergebnis

24 4 08 1 Λ

legt es nahe * dass nur ein einzelnes homologes IFN-^-Gen (in Abweichung von zahlreichen verwandten IFN~*-Genen) in Humangenom-DNA Vorhanden' ist und dass dieses Gen durch eines oder mehrere Introns mit einem Gehalt an EcoRI-, PvuII- und Hindll-Stellen gespalten wird. Diese Vorhersage wurde durch Hybridi-

' ^: 32 ' ' ' ' ' .· ' . sierung eines P-markierten (47) Fragments (hergestellt genau aus dem 3'-nicht-übersetzten Bereich der cDNA von p69 (130 bp Ddel-Fragment von860 bp bis 990 bp in Fig. 5)) gegen ein EcoRI-Verdauungsprodukt von Humangenom-DNAgestützt. Nur das 2,0 . k'bp EcoRI-Fraginent hybridisierte mit diesem Tracer, was darauf schliessen lässt, dass dieses Fragment die 3'-nichtübersetzten Sequenzen enthält, während das 8,8 kbp EcoRl-Fragment die 5'-Sequenzen enthält. Die Genstruktur von IFN-^* (ein Gen mit mindestens einem Intron) unterscheidet sich deutlich von IFN-öG (Mehrfachgene (2) ohne Introns (56)) oder iFN-ß (ein Gen ohne Introns (57)).

J. Herstellung von Bakterienextrakten

Eine über Nacht gezüchtete Kultur von E. coil W3110/pIFN-ytrp 48 in Luria-Brühe + 5 /ig/ml Tetracyclin wurde zur Inokulation von M9 (58)^Medium mit einem Gehalt an 0,2 Prozent Glucose, 0,5 Prozent Casaminsäuren und 5 jiig/ml Tetracyclin in einer 1:100-Verdünnung verwendet. Indolacrylsäure wurde bis zu einer Endkonzentration von 20 ^g/ml zugesetzt,wenn der Arrn-Wert zwischen 0,1 und 0,2 lag. 10 ml-Proben wurden durch Zentrifugation bei einem Ac-C₀-Wert von 1,0 geerntet und sofort in 1 ml mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 1 mg/ml Rinderserumalbumin (PBS-BSA) resüspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen und durch Zentrifugation von Zellbruchstücken befreit. Der überstand wurde bis zur Testdurchführung bei 4°C gelagert. Die Interferonaktivität im überstand wurde zu 250 Einheiten/ml bestimmt, wobei die Bestimmung mittels der Hemmung des zytopathischen Effekts (CPE) durch Vergleich mit IFN-u:-Standard erfolgte.

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K. Transformation von Hefestammen und Medien

Hefestämme wurden gemäss (59) transformiert. E. coli Stamm JA30-0 (thr leuBö thi thyA trpC1117 hsdm" hsdR" str^R) (20) wurde zur Selektierung von Plasmiden mit einem Gehalt an funktionellem TRPI-Gen verwendet. Der Hefestamm RH218 mit dem Genotyp (trp1 ga12 SUC2 mal CIlPI) (18) wurde alsHefetransformationswirt verwendet. RH2 18 ist ohne Einschränkungen bei der American Type Culture Collection unter der Nr. ATCC 44076 hinterlegt. M9 (Minimalmedium) mit 0,25 Prozent Casaminsäuren (CAA) und LB (rieh medium) entsprechen den Angaben von Miller (58), wobei die Medien nach*Autokiavisierung und Kühlung mit 20 ,ug/ml Ampicillin (Sigma) versetzt wurden. Hefe wurde auf folgenden Medien gezüchtet: YEPD mit einem Gehalt an 1 Prozent Hefeextrakt, 2 Prozent Pepton und 2 Prozent Glucose + 3 Prozent Difco-Agar. YNB + CAA enthielt 6,7 g Hefe-Stickstoffbase (ohne Aminosäuren (YNB) (Difco), 10 mg Adenin, 10 mg Uracil, 5 g CAA, 20 g Glucose und + 30 g Agar pro Liter.

L. Aufbau des Hefeexpressionsvektors

1. 1O₇Ug YRp7 (14, 15, 16) wurde mit EcoRI verdaut. Die erhaltenen kohäsiven DNA-Enden wurden unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) stumpf gemacht. Man Hess Vektor und Insert auf 1 Prozent Agarose (SeaKem)-Gel laufen. Sodann wurde das Gel zerschnitten, der Elektroelution unterworfen und vor der Fällung mit Äthanol 2 mal mit gleichen Volumina an Chloroform und Phenol extrahiert. Die erhaltenen stumpfendigen DNA-Moleküle wurden sodann 12 Stunden bei 12°C in einem Endvolumen von 50 _xul miteinander verknüpft. Dieses Verknüpfungsgemisch wurde sodann zur Transformation von E. coli Stamm JA300 zur Verleihung von Ampicillin-Resistenz und Tryptophan-Protötrophie verwendet. Plasmide, die das TRPI-Gen in beiden Orientierungen erhielten, wurden isoliert. pFRWI wies das TRPI-Gen in der gleichen Orientierung wie YRP7 auf, während bei pFRW2 das TRPI-Gen in der entgegengesetzten Orientierung vorlag.

Uo I I

20 ^Jg pFRW2wurden mit HindIII linearisiertund der Elektrophorese an 1:-prozentigem Agarosegel unterworfen. Lineare Moleküle wurden vom Gel eluiert. 200 ng wurden sodann mit 500 ng des 3,1 kb HindHI-Inserts des Plasmids pBI; (13), bei dem es sich um ein Restriktionsfragment mit einem Gehalt am Hefe>-3-Phosphoglycerat-kinase-Gen handelte, verknüpft. Das Verknüpfungsgemisch wurde zur Transformation von E. coil Stamm 294 verwendet, um Ampicillin-Resistenz undTetracyclin-Empfindlichkeit hervorzurufeni. Ein aus einer dieser Rekombinänten hergestelltes Plasmid wies ein intaktesTRP1-Gen mit dem 3,1 kbp-Hindlll-Fragment aus pB1-Insert-DNA an der Hindlll-Stelle des Tetracyclin-Resistenz-Gens auf. Bei diesem Plasmid handelt es sich um pFRM31i 5 jag pFRM31 würden voirständig mit EcoRI verdaut, 2 mal mit Phenol und Chloroform extrahiert und sodann mit Äthanol gefällt. Die kohäsiven Enden des Moleküls wurden unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) im Verlauf einer Reaktion, bei der von jedem Desoxynucleosid-triphosphat eine Konzentration von 250 millimolar hergestellt wurde, gefüllt. Die Reaktion wurde 20 Minuten bei 14°C durchgeführt. Anschliessend wurde die DNA 2 mal mit Phenol-Chloroform extrahiert und hierauf mit Äthanol gefällt. Die resuspendierte DNA wurde vollständig mit CIaI verdaut und der Elektrophorese an 6-prozentigem Acrylamidgel unterworfen. Das Vektorfragment würde vom Gel eluiert, mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt., ;.. '. . '.' ; ; ; .· ' ·. " . '·'. . r^: ' . ;.. -·

Gereinigtes,vom Menschen stammendes 3-Phosphoglycerat-Enzym weist folgende 6 N-endständigen Aminosäuren auf:

1 - 2 - 3 - ¹J - 5 - 6 SER-LEU-SER-SER ^ LYS - LEU —

Einer der aus dieser DNA-Sequenz des 141 bp-Sau3A- bis -Sau3A-Restriktionsfragments (enthaltend die interne HincII-Stelle ;

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vgl. PGK-Restriktionskartevon Fig. 11) erzeugten Translations-Ableseraster bildet folgende Aminosäuresequenz:

'.. : ;.rv;;^;V'"2 .-'.; .3. ' '- 4 5 '. - '.>/ " MET-SER - LEU - SER - SER - . LYS-LEU;-

Nach Entfernung des Initiator-Methionins ergibt sich für 5 von 6 Aminosäuren der PGK-N-endständigen Aminosäuresequenz eine Homologie mit der N-endständigen Aminosäuresequenz von

Human-PGK. ; _: . . ' ';.; .-

Dieses Sequenzierungsergebnis lässt darauf schliessen, dass der Start des Hefe-PGK-Strukturgens durch DNA im i4ibp-Sau3A-Restriktionsfrägment von p.B'1 kodiert wird. Eine frühere Arbeit (20) liess darauf schliessen, dass die DNA-Sequenzen, die die PGK-mRNA angeben, möglicherweise in diesem Bereich des Hindill-Fragments liegen. Eine weitere Sequenzierung des 141 bp-Sau3A-Fragments ergibt eine weitere DNA-Sequenz des

PGK-Promotors (Fig. 12). :

. . i ·. .-.

ι ' ' .

Ein synthetisches Oligonucleotid mit der Sequenz 5'ATTTGTTGTAAA3' wurde nach Standardmethoden (Crea et al., Nucleic Acids Res., Bd.. 8 (1980), S. 2331, synthetisiert. 100 ng dieses Primers wurden am 5'-Ende markiert, wobei 10 Einheiten T4-Polynucleotid~kinase in 20 ,ul-Reaktionsmedium mit einem Gehalt an ^Ci l_/- -V_/ ATP verwendet wurden. Diese markierte Primerlösung wurde in einer Primer-Reparaturreaktion als erste Stufe eines mehrstufigen Verfahrens mit dem Ziel, eine EcoRI-Restriktionsstelle in der PGK-5'-Flanken-DNA unmittelbar vor der PGK-Strukturgen-Sequenz einzuführen, eingesetzt.

pB.1 (20) wurden vollständig mit Haelll verdaut und sodann auf 6-prozentigem Polyacrylamidgel laufen gelassen. Die oberste Bande an dem mit Ethidium gefärbten Gel (die den PGK-Promotorbereich enthält) wurde auf die vorstehend erläuterte Weise durch Elektroelution isoliert. Dieses 1200 bp-Haelll-

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Stück von DNA wurde der Restriktion mit Hindi unterworfen und sodann auf 6>prozentigem Acrylamidgel laufen gelassen. Die 650 ρ ρ-.Bah de wurde durch Elektröelution isoliert. Es wurden 5 Ag DNA isoliert. Dieses 650 bp-Haelll- bis HincII-· Stück von DNA wurde in 20 ^l H-O resuspendiert und sodann auf die vorstehend erläuterte Weise mit 20 jxl der phosphorylierten Primerlösung vermischt* Dieses Gemisch wurde 1 mal mit Phenol-Chloroform extrahiert und sodann mit Äthanol gefällt. Die getrocknete DNA wurde in 50 ^uI H₂O resuspendiert und sodann 1 Minuten in einem siedenden Wasserbad erwärmt. Diese Lösung wurde sodann rasch in einem Trockeneis/Äthanol-Bad (10 bis 20 Sekunden)gekühlt und hierauf in ein Eis/Wasser-Bad übertragen. Sodann wurde die Lösung mit 50 ;ul einer Lösung mit einem Gehalt an 10 μ1 lOX-DNA-Polymerase I-Puffer (Boehringer Mannheim), 10 ,ul einer Lösung, die vorher in bezug auf jedes Desoxynucleosid-triphosphät (dATP, dTTP, dGTP und dCTP)auf eine Konzentration von 2,5 millimolar gebracht Worden war, 25/Ul HpO und 5 Einheiten DNA-Polymerase I (Klenow-Fragmerit) versetzt. Dieses 100 ^ul-Reaktionsgemisch wurde 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Lösung wurde sodann 1 mal mit Phenol-Chloroform extrahiert. Hierauf wurde mit Äthanol gefällt, durch Lyophilisation getrocknet und schliesslich mit 10 Einheiten Sau3A eine erschöpfende Restriktion durchgeführt. Man liess diese Lösung sodann auf einem 6-prozentigen Acrylamidgel laufen. Die Bande entsprechend einer Grosse von 39 bp wurde aus dem Gel geschnitten und sodann auf die vorstehend erläuterte Weise durch Elektröelution isoliert. Diese 39 bp-Bande weist ein stumpfes Ende und ein Sau3A-kohäsives Ende auf. Dieses Fragment wurde zu einem modifizierten pFIF-trp-69-Vektor (5) geklont. 10 ^g pFIF-trp-69 wurden mit Xbal linearisiert, 1 mal mit Phenol-Chloroform extrahiert und sodann mit Äthanol gefällt. Das Xbal-^ kohäsive Ende wurde unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) in 50 jil Reaktionsmedium, das jeweils mikromolar an den einzelnen Nucleosidtriphosphaten war, gefüllt. Diese DNA wurde mit BamHI geschnitten und auf 6 prozentigem Acrylamidgel laufen gelas-

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sen. Das Vektorfragment wurde aus dem Gel durch Elektroelution isoliert und sodann in 20 μΐ HpO resuspendiert. 20 ng dieses Vektors wurden 4 Stunden bei Raumtemperatur mit 20 ng des oben hergestellten 39 bp-Fragments verknüpft. 1/5 des Ligationsgemisches wurden zur Transformation von E. coli Stamm 2 94 verwendet, um diesem Stamm Ampicillin-Resistenz (auf LB +20 ug/ml amp-Platten) zu verleihen. Plasmide aus den Transformanten wurden durch ein Schnellsichtungsverfahren (44) überprüft.Ein Plasmid, pPGK-39, wurde für die Sequenzanalyse ausgewählt. 20 yg dieses Plasmids wurden mit Xbal verdaut, mit Äthanol gefällt und sodann mit 1000 Einheiten 45 Minuten bei 68°G mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt. Die DNA wurde 3 mal mit Phenol-Chloroform extrahiert und sodann mit Äthanol gefällt. Die dephosphorylierten Enden wurden sodann in 20 μΙ Reaktionsmedium mit einem Gehalt an 200 ^Ci 7~/³²-P_-T-ATP und 10 Einheiten T^-Polynucleotidkinase markiert. Das Plasmid wurde mit Sail geschnitten und auf einem 6-prozentigen Acrylamidgel laufen gelassen.

Die markierte Insertbande wurde aus dem Gel isoliert und nach dem chemischen Abbauverfahren (52) sequenziert. Die DNA-Sequenz am 3'-Ende dieses Promotorstücks entsprach den Erwartungen.

2. Aufbau des 312bp-PvuI- bis-EcoRI-PGK-Promotorfragments

25 ^g pPGK-39 (Fig. 13) wurden gleichzeitig mit Sail und Xbal (jeweils 5 Einheiten) verdaut und sodann der Elektrophorese an einem 6-prozentigen Gel unterworfen. Die 390 bp-Bande, die das 39 bp-Promotorstück enthielt, würde durch Elektroelution isoliert. Die resuspendierte DNA wurde der Restriktion mit Sau3a und sodann der Elektrophorese an einem 8-prozentigen Acrylamidgel unterworfen. Die 39 bp-PGK-Promotorbande wurde durch Elektroelution isoliert. Diese DNA enthielt 39 bpdes 5'-Endes des PGK-Promotors an einem Sau3A-

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bis -Xbal-Fragment.

25 jug pB1 wurden der Restriktion mit Pvul und Kpnl und sodann der Elektrophorese an einem 6-prozentigen Aerylamidgel unterworfen. Die 0,8 kbp-Bande von DNA wurde durch Elektroelution isoliert und der Restriktion mit Sau3A und sodann der Elektrophorese an einem 6-prozentigen Aerylamidgel unterworfen. Die 2 65 bp-Bande aus dem PGK-Promotor (Fig. 11) wurde durch Elektroelution isoliert.

Diese DNA wurde sodann mit dem 39 bp-Promotorfragment (vgl. oben) 2 Stunden bei Raumtemperatur verknüpft. Das Ligationsgemisch wurde der Restriktion mit Xbal und Pvul und sodann der Elektrophorese an einem 6-prozentigen Aerylamidgel unterworfen. Das 312 bp-Xba- bis Pvul-Restriktionsfrägment wurde durch Elektroelution isoliert und sodann zu einem Ligationsgemisch mit einem Gehalt an 200 ng pBR322 (41) (vorher isoliert unter Weglassen des 162 bp-PvuI- bis-Pstl-Restriktionsfragments) und 200 ng des Xbal- bis -Pstl-LelF A-cDNA-Gens (vorher isoliert aus 20 pg pLelF-trp A 25. Dieses 3 Faktoren enthaltende Ligätionsgemisch wurde zur Transformation von E. coli Stamm 294 verwendet, um diesem Stamm Tetracyclin-Resistenz zu verleihen. Transformantenkolönien wurden einer Minisichtung (44) unterworfen. Eine der Kolonien, pPGK-300 wurde isoliert. Sie wies 304 bp von PGK-5¹-Flanken-DNA verschmolzen mit LeIF Α-Gen in einem auf pBR322 basierenden Vektor auf. Das 5'-Ende des LeIF Α-Gens weist folgende Sequenz auf: 5'-CTAGAATTG-S'. Diese Verschmelzung der Xbal-Stelle aus dem PGK-Promotorfragment in diese Sequenz erlaubt die Hinzufügung einer EcoRI-Stelle an die. Xbal-Stelle. pPGK-300 enthält somit einen Teil des in einem Pvul- bis-EcoRI-Fragment isolierten PGK-Promotors.

3. Aufbau eines 1500 bp-EcoRI- bis-EcoRI-PGK-Promotorfragments 10 ,ug pBI wurden mit Pvul und EcoRI verdaut und auf einem

2ΛΛ 08 1 1

6-prozentigen Äcrylamidgel laufen gelassen. Die 1,3 kb Pvulbis -EcoRI-PNA-Bande der PGK-5'-Flanken-DNA wurde durch Elektroelution isoliert. 10 ^g pPGK-300 wurden mit EcoRI und Pvul verdaut. Das; 312- bp-Promotorfragment wurde nach Elektrophorese des Verdauungsgemisches an einem 6-prozentigen Acrylamidgel durch Elektroelution isoliert. 5 μ& pFRL4 wurden mit EcoRI geschnitten,; mit Äthanol ausgefällt und sodann 45 Minuten bei 68°C mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt. Nach 3 DNA-Extraktionen mit Phenol-Chloroform, Äthänolfällung und Resuspension in 20 ml HpO wurden 200 ng des Vektors mit 100 ng 312 bp EcoRI- bis -PvuI-DNA aus pPGK-300 Und 100 ng EcoRI- bis -PvuI-DNA aus pB1 verknüpft. Das Ligationsgemisch wurde zur Tränsformation von E. coli Stamm 294 verwendet, um diesem Stamm Ampicillin-Resistenz zu verleihen. Bei einer der erhaltenen Transformanten handelte es sich um pPGK-1500. Dieses Plasmid enthält das 1500 bp-PGK-Promotorfragment als ein EcoRI- bis -EcoRI oder Hindlll- bis -EcoRI-rStück von DNA.

10 Mg pPGK-1500 wurden vollständig mit CIaI und EcoRI verdaut. Anschliessend wurde das Verdauungsgemisch der Elektrophorese an einem 6-prozentigen Aerylamidgel unterworfen. Das 900 bp-Fragment, das den PGK-Promotor enthält, wurde durch Elektroelution Isoliert. 10 ^g pIFN-/-trp 48 wurden vollständig mit EcoRI und Hindi verdaut und der Elektrophorese an einem 6-prozentigen Aerylamidgel unterworfen. Die 938 bp-Bande, die die direkt exprimierbare IFN-/'-cDNA enthält, wurde durch Elektroelution aus dem Gel isoliert.

Der Hefeexpressionsvektor wurde in einer Dreifaktorenreaktion durch Verknüpfung des PGK-Promotorfragments (an einem CIaI- bis -EcoRI-Stück)j des der Deletion unterworfenen pFRM-31 und der vorstehend isolierten IFN-^-cDNA aufgebaut. Das Ligationsreaktionsgemisch wurde 12 Stunden bei 14°C inkubiert. Das Ligationsgemisch wurde sodann zur Transformation von E. coli Stamm 294 verwendet, um diesem Stamm Ampicillin-Resistenz zu

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verleihen. Transformanten wurden zur Feststellung der Anwesenheit des einwandfrei aufgebauten Expressionsplasmids pPGK-IFN-/" (Fig. 16) analysiert. Plasmide mit einem Gehalt an diesem Expressionssystem wurden zur Transformation von Sphäroplasten des Hefestammes RH2 18 verwendet, um diesem Stamm Tryptophan^-Prototrophie in einem kein Tryptophan .enthaltenden Agar zu verleihen. Diese Rekombinantenhefe wurde dann auf die Anwesenheit von Immuninterferon untersucht. :

Hefeextrakte wurden folgendermassen hergestellt: 10 mi-Kulturen wurden in YNB+CAA bis zum Erzielen eines A/-/-_n-Werts von etwa 1 bis 2 gezüchtet. Sodann wurde zentrifugiert und in 500 ,ul PBS (20 millimolar NaH₂PO₄, pH-Wert 7,4, 150 millimoTar NaCl) resuspendiert. Ein gleiches Volumen an Glasperlen (0,45 bis 0,5 mm) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 2 Minuten durchgewirbelt. Die Extrakte wurden 30 Sekunden bei 14 000 U/min zentrifugiert. Der überstand wurde entfernt. Die Interferonaktivität im überstand wurde zu 16 000 Einheiten/ml bestimmt, wobei die Bestimmung unter Vergleich mit einem IFN-<*-Standard unter Anwendung des CPE-Hemmtests erfolgte,

M. Aufbau von Zellkulturvektor pSV / 69

Das 342 Basenpaar-Hindlll-PvuII-Fragment , das die SV40-Startstelle umfasste, wurde in ein EcoRI-restriktionsstellengebundenes Fragment umgewandelt. Die Hindlll-Stelle wurde durch Zusatz eines synthetischen Oligomers (5'dAGCTGAATTC) umgewandelt. Die PvuII- Stelle wurde durch stumpfendige Verknüpfung unter Verwendung von Polymerase I (Klenow-Fragment) in eine gefüllte EcoRI-Stelle verwandelt. Das erhaltene EcoRI-Fragment wurde in die EcoRI-Stelle von pML-1 (28) ein-

. .' ρ

gesetzt. Ein Plasmid mit dem vom amp -Gen wegorientierten SV40-späten Promotor wurde durch Entfernen der EcoRI-Stelle nächst dem amp -Gen von pML-1 (27) weiter modifiziert.

Das 1023 Basenpaar-Hpal-Bglll-Fragment von geklönter HBV-DNA (60) wurde isoliert und die Hpal-Stelle von Hepatitis B-Virus

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(HPV) mit einem synthetischen Oligomeren

(5¹CIGCGAATTCGc) in eine EcoRI-Stelle umgewandelt.

Dieses EcoRI-Bglll-gebundehe Fragment wurde direkt in die EcoRI-BamHI-Stellen des vorstehend beschriebenen Plasmids, das die Startstelle yon SV40 enthält, geklönt..

In die verbleibende EcoRI-Stelle wurde das IFN-^-Gen an ein 12 50-Basenpaar-PstI-Fragment von p69 nach Umwandlung der Pstl-Enden zu EcoRI-Enden eingesetzt. Klone wurden isoliert, in denen dem SV4O-späten Promotor das Strukturgen von IFN-/ vorherging. Die erhaltenen Plasmide wurden sodann in Gewebekulturzellen (29) eingeführt, wobei eine DEAE-Dextrantechnik (61), die so modifiziert war, dass die Tränsfektion in Gegenwart des DEAE-Dextrans 8 Stunden durchgeführt wurde, angewendet wurde. Die Zellmedien wurden alle 2 bis 3 Tage ausgetauscht. 200 'jil Wurden täglich zur biologischen Interferonbestimmung entfernt. Typische Ausbeuten betrugen 50 bis 100 Einheiten/ml bei Proben, die 3 oder U Tage nach der Tränsfektion bestimmt wurden.

N. Partielle Reinigung von aus Affenzellen abgeleitetem Immuninterferon

Um grössere Mengen an ausAffenzellen abgeleitetem Human-IFN-/ zu erhalten, wurden frische Monolayers von COS-7-Zellen in 10 cm-Platten der Tränsfektion mit insgesamt 30 jjg pDLIF3 in 110 ml DEAE-Dextran (200 ^ig/ml DEAE-Dextran, Molekulargewicht 500 000, 0,05 m Tris, pH-Wert 7,5, in DMEM) unterworfen. Nach 16 Stunden bei 37°C wurden die Platten 2 mal mit DMEM gewaschen. 15 ml frisches DMEM, ergänzt mit 10 Prozent f.b.s., 2 millimolar Glutamin, 50^ig/ml Penicillin G und 50 mg/ml Streptomycin, wurden sodann zu jeder Platte gegeben. Die Medien wurden am folgenden Tag mit serumfreien DMEM ersetzt. Sodann wurden jeden Tag frische, serumfreie Medien zugesetzt. Die gesammelten Medien wurden bei 4⁰C aufbewahrt, bis sie entweder einem Test unterworfen öder an CPG gebunden wurden.

LW k Uö 1 1

Die vereinigten Fraktionen von Proben vom 3· und 4. Tag nach der Transfektion enthielten im wesentlichen die gesamte Aktivität. .';'"; ' ^: "'· ; ·' / ' ' ' 'z ' ' ., '. .'.'. . ' - . '. ' \ .' ' / \: ^:-"Yy

0,5 g CPG ("controlled pore glass", Electronueleonics, CPG 350, 120/200 mesh) wurden zu 100 ml Zeilüberstand gegeben. .Das Gemisch wurde 3 Stunden bei H⁰C gerührt. Nach kurzer Zentrifugation in einer "bench top"-Zentrifuge wurden dieabgesetzten Kügelchen in eine Säule gepackt und gründlich mit 20 millimolarem NaPp₂,-Puffer vom pH-Wert 7,2 mit einem Gehalt an 1 m NaCl und 0,1 Prozent ß-Mercaptoäthanol gewaschen. Die Aktivität wurde sodann mit dem gleichen Puffer mit einem Gehalt an 30 Prozent Äthylenglykol eluiert. Schliesslich wurde die Elütion mit dem vorgenannten Puffer mit einem Gehalt an 50 Prozent Ä'thylenglykol fortgesetzt. Die gesamte Aktivität war im wesentlichen an CPG gebunden. 75 Prozent der. eluierten Aktivität fanden sich in den mit 30 Prozent Äthylenglykol eluierten Fraktionen. Diese Fraktionen wurden vereinigt und mit 20 milllmolarem NaPO^-Puffer vom pH-Wert 7,2 mit einem Gehalt an Im NaCl auf eine Endkonzentration von 10 Prozent Sthylenglykol verdünnt und direkt auf eine mit 10 ml Con A-Sepharose (Pharmacia)-Säule aufgesetzt. Nach gründlichem Waschen mit 20 millimolarem NaPO^-Puffer vom pH-Wert 7,2 mit einem Gehalt an 1 m NaCl wurde die Aktivität mit 20 millimolarem NaPO^-Puffer mit einem Gehalt an 1m NaCl und 0,2 m ri-Methyl-D-Mannosiä eluiert. Ein wesentlicher Anteil der Aktivität (55 Prozent) wurden nicht an dieses Lectin gebunden. h5 Prozent der Aktivität wurden mit oG-Methyl-D-Mannsodid eluiert.

Arzneipräparate

Die Verbindungen der Erfindung können nach bekannten Verfahren zu Arzneipräparaten verarbeitet werden, wobei das Human-Immuninterferon mit einem pharmakologisch verträglichen Träger

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kombiniert wird. Entsprechende Trägerstoffe und deren Formulierung sind in Remingtons Pharmaceutical Sciences, E.W. Martin, beschrieben. Diese Arzneipräparate enthalten eine wirksame Menge Interferonprotein zusammen mit einer geeigneten Menge an Träger, so dass pharmakologisch verträgliche Arzneipräparate, die sich zur Verabreichung an den Wirt eignen, erhalten werden.

A. Parenterale Verabreichung

Das erfindungsgemässe Human-Immuninterferon kann parenteral verabreicht werden, wenn eine Antitumorbehandlung, antivirale Behandlung oder eine Behandlung von immunosuppressiven Zuständen erforderlich ist. Die Dosierung kann ebenso wie bei anderen Human-Interferonen, die gegenwärtig klinisch untersucht werden, erfolgen, z.B. (1-10) χ 10 Einheiten täglich und im Fall von Materialien mit einer Reinheit von mehr als 1.Prozent .bis:zu-etwa 50 χ 10 Einheiten täglich. Die IFN-^- Dosen können zur Erzielung einer stärkeren Wirkung beträchtlich erhöht werden, was auf die weitgehende Abwesenheit von anderen, sich von IFM-/ unterscheidenden Proteinen, die bei aus menschlichen Quellen abgeleiteten Materialien bestimmte ungünstige Wirkungen hervorrufen können, zurückzuführen ist.

Eine geeignete Dosierung für im wesentlichen homogenes IFN-/ zur parenteralen Verabreichung besteht aus 3 mg IFN-/ mit ' 8

einer spezifischen Aktivität von etwa 2 χ 10 U/mg, gelöst in 25 ml 5 η Serumalbumin (Mensch) -USP. Die Lösung wird durch ein bakteriologisches Filter gegeben. Die filtrierte Lösung wird aseptisch in 100 Fläschchen unterteilt, die jeweils 6 χ 10 Einheiten reines, zur parenteralen Verabreichung geeignetes Interferon enthalten. Die Fläschchen werden vor der Verwendung vorzugsweise in der Kälte (-20⁰C) gelagert.

Biologische Daten A. Charakterisierung der antiviralen Aktivität

Für Antikörper-Neutralisationsreaktionen werden Proben gegebenenfalls mit PBS-BSA auf eine Konzentration von 500 bis 1000 Einheiten/ml verdünnt. Gleiche Pröbenvolumina werden 2 bis 12 Stunden bei 4°C mit Reihenverdünnungen von Kaninchen-Antihuman^Leukozyten-, Fibroblasten- oder Immun-Interferon-Antiseren ihkubiert. Anti-TFN-cx und -ß wurden vom National Institut of Allergy and Infectious Diseases erhalten. Anti-IFN- jf wurde unter Verwendung von authentischem IFN-/¹ (Reinheit 5 bis 20 Prozent)), gereinigt aus stimulierten peripheren Blutlymphozyten, hergestellt. Die Proben wurden vor der Bestimmung 3 Minuten bei 12000 g zentrifugiert. Zur Untersuchung der Stabilität beim pH-Wert 2 wurden die Proben durch Zusatz von 1 η HCl auf den pH-Wert 2 eingestellt, 2 bis 12 Stunden bei 4⁰C inkubiert und vor dem^:Test durch Zusatz von 1 η NaOH neutralisiert. Der Test auf Empfindlichkeit gegenüber Natriumdodecylsulfat (SDS) wurden durchgeführt, indem die Proben vor der Bestimmung 2 bis 12 Stunden bei 4^QC mit gleichen Volumina 0,2-prozentiger SDS-Lösung inkubiert wurden.

B. Charakterisierung von IFN- y , gebildet durch E* coli- und COS-7-Zelleri

^Ant^ivirale Aktivität (Einheiten/ml)

:.' E. coli W3110/ COS-7-

';.. . · pIFN-/trp48- Zellen/

Behandlung	IFN- α'.	IFN-ß	IFN-/-	Extrakt	pSVy69 über stand
unbehandelt	375 :	125	250	2 50	62,5
pH-Wert 2	375	125	<6	< 12	< 4
0,1 % SDS	375	-	< 4	<8	' · -
Kaninchen-anti— IFN-.χ.	<8	12 5	250	2 50	187
Kaninchen-anti- IFN-ß	375	<8	187	2 50	125
Kaninchen-anti- IFN-r	375	125	< 4	< 8	< 4

24 4 08

Diese Tabelle zeigt das charakteristische Verhalten vqn IFN-<x, -ß- und -/-Standards nach verschiedenen Behandlungsweisen. Die durch E. <2öli W311O/pIFN-/trp 48 und durch COS-7'/pSV^69 gebildete Interferonaktivität ist säureempfindlichund SDS-empfindlich und wird durch Immun-Interferon-Antiserum neutralisiert. Es wird nicht durch Antikörper gegen 'IFN-A oder -ß neutralisiert. Diese Daten bestätigen, dass es sich bei dem in diesen Systemen gebildeten Interferon um IFN-^ handelt und dass das cDNÄ-Inser.t des Plasmids p69 IFN-^ kodiert.

Reinigung

Ein Verfahren, nach dem IFN-γ z.B. aus Bakterien gereinigt werden kann, ist in dem folgenden allgemeinen Schema beschrieben:

1. Extraktion der Zellen in einem Lysepuffer (etwa pH 8) von hoher Leitfähigkeit mittels Passage durch einen Homogenisator bei hohem Druck, Abkühlen des Äbstroms in einem Eisbad.

2. Ausfällung der DNA durch Zugabe von Polyethylenimin unter Rühren z.B. bei 4°C.

3„ pH-Ausfällung der bakteriellen Proteine, wobei wiederum IFN-yin Lösung bleibt.

4. Abzentrifugieren der Feststoffe bei 4°C.

5. Konzentrieren des Überstands (nach erneuter Einstellung des pH) z.B. durch Ultrafiltration.

6. Dialyse des Konzentrats gegen einen Puffer von niedriger Leitfähigkeit.

7. Abzentrifugieren der Feststoffe, wobei IFN-y in Lösung bleibt.

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8. Ionenaustauschchromatographie an Carboxymethylcellulose, Elution mit einem Gradienten an zunehmender Ionenstärke.

9. Chromatographie an Calciumphosphat-Gel und Elution mit einem Gradienten an zunehmender Iorienstärke.

10. IonenaustauschchromatographLe an Carboxymethylcellulose unter schwach denaturierenden Bedingungen und Elution mit einem Gradienten an zunehmender Ionenstärke.

11. Abtrennung durch GeIfiltrationschromatographie.

Das genannte Verfahren ermöglicht Materialausbeuten mit einer Reinheit von mehr als 95%.

Das erfindungsgemässe Immun-Interferonprotein wurde durch determinierte DNA-Gensequenzierung und abgeleitete Aminosäuresequenzierung (vgl. Fig. 5) definiert. Es wird darauf hingewiesen, dass für dieses spezielle erfindungsgemässe Interferon natürliche Allelvariatiorien existieren, die von Individuum zu Individuum unterschiedlich sein können. Diese Variationen machen sich durch Unterschiede bezüglich einer oder mehreren Aminosäuren in der Gesamtsequenz oder durch Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen von einer oder mehreren dieser Aminosäuren in der Sequenz bemerkbar. Unter den Gegenstand der Erfindung fällen sämtliche derartigen Allelvariationen.

Es besteht tatsächlich die Möglichkeit einer Anwendung der rekombinanteri DNA-Technik zur Herstellung verschiedener Human-IFN- J^ -derivate, die durch ein- oder mehrfache Aminosäuresubstitutionen, -deletionen, -additioneh oder -=-v-e- -n verschiedener Weise modifiziert sind.

081 1

Alle derartigen Modifikationen, die solche Derivate von Human-IFN-y ergeben, werden von der vorliegenden Erfindung erfasst, solange die essentielle charakteristische Human-IFN- / -Aktivität der Art nach unbeeinträchtigt bleibt.

' .' / ' / ι ^;- ' .' ' '. ' ·' ' .· ^:

Mit Hilfe der DNA- und Aminösäuresequenzen von IFN-/ (siehe Fig. 5) besteht der vorteilhafteste Weg zur Nacharbeitung der Erfindung zweifellos darin, entweder das vollständige Gen zu synthetisieren (siehe z.B. 26) oder synthetische Desoxyoligonucleotide herzustellen, mit denen die cDNA-QuelIe getestet werden kann, um das Gen mittels Standard-Hybridisierungsmethoden zu isolieren. Sobald man die Nucleotidsequenz mit dem Code für das gewünschte IFN-y -Protein erhalten hat, lassen sich die Expression, isolierung und Reinigung zu hoch-reinen IFN-y-Präparaten in Anlehnung an die vorstehende Beschreibung durchführen.

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Claims (9)

1. Ol Ί Π ft 1 1 AP C 12 N /244 081/1

   61 564 12

   E rf indung sanspruoh ..-.

   1. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das im wesentlichen aus der Aminosäuresequenz von reifem Human-Immuninterferon besteht, gekennzeichnet dadurch, daß eine Expression eines Gens, welches Human-Immuninterferon in reifer Form kodiert, in einem Mikroorganismus oder einer Zellkultur durchgeführt wird.

   2ο Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Kultur eines Mikroorganismus oder eine Zellkultur, die mit einem replizierbaren Expressionsträger, welcher zur Expression des Polypeptids befähigt ist, transformiert worden sind, zum IP/achstum und zur Bildung des Polypeptids veranlaßt und das Polypeptid gewinnt.
2. 3. Verfahren rach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß der Bxpressionsträger durch Aufbau einer ersten, für das Polypeptid kodierenden DNA-Sequenz und funktioneile Verknüpfung dieser ersten DMA-Sequenz mit einer zweiten DNA-Sequenz, die zur Expression der ersten DNA-Sequenz fähig ist, erhalten wird.

   .4. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man transformierte Äffennieren-Fibroblasten der GOS-7-Linie verwendet»
3. 5. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man einen transformierten E. coli-Stamm verwendet.
4. 6. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man einen transformierten Hefestamm verwendete

   AP C 12 N /244 081/1

   24Λ081 1 -S2- ^6156412
5. 7. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man einen Mikroorganismus oder eine Zellkultur verwendet, die mit einem Plasmid, ausgewählt unter ρΙϊΊΤ-» Y>»trp 48, pSV-/ —69 und PGK-^IPN- Jf , transformiert worden sind.
6. 8. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein Polypeptid erhalten wird, das nicht von assoziierter nativer Glycosylierung begleitet ist,
7. 9. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein Polypeptid erhalten wird, das gegebenenfalls die Aminosäure Methionin enthält, die am N-terminalen Ende der üblicherweise ersten Aminosäure von Interferon gebunden
8. 10. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein Polypeptid erhalten wird, das gegebenenfalls ein abspal tbares Konjugat oder.Signalprotein enthält, das am N-terminalen Ende der üblicherweise ersten Aminosäure von Interferon gebunden ist«
9. 11. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein im wesentlichen reines Polypeptid erhalten wird, dessen Aminosäuresequenz im wesentlichen der in Flg. 5 dargestellten Sequenz entspricht.

   Hierzu. j£.Seiten Zeichnungen