DD208918A1 - Verfahren zur herstellung eines intravenoes vertraeglichen unmodifizierten humangammaglobulins - Google Patents

Abstract

DIE ERFINDUNG BETRIFFT EIN VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG EINES INTRAVENOES VERTRAEGLICHEN HUMANGAMMAGLOBULINS, BEI WELCHEM DIE KOMPLEMENTAKTIVIERENDEN IMMUNGLOBULINAGGREGATE DURCH ADSORPTION AN POLYMERES HUMANALBUMIN IN GEGENWART EINES WASSERLOESLICHEN, UNGELADENEN, KETTENFOERMIGEN POLYMER ENTFERNT WERDEN. DAS VERFAHREN GESTATTET EINE HOEHERE AUSBEUTE ANINTRAVENOES VERTRAEGLICHEM GAMMAGLOBULIN, WEIL DER POLYMERENANTEIL DURCH DIE ADSORPTION DER AGGREGATE GESENKT WERDEN KANN UND SO DIE MITFAELLUNG VON MONOMEREN IMMUNGLOBULINMOLEKUELEN VERMIEDEN WIRD. DAS VERFAHREN IST VORZUGSWEISE IM BEREICH DER HUMANMEDIZIN ANWENDBAR.

Description

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Verfahren zur Herstellung eines intravenös verträglichen unmodifizierten Humangammaglobulins

Anwendungsgebiet der Erfindung ,

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines intravenös verträglichen, unmodifizierten Humangammaglobulins, welches mittels Polyethylenglycol in Gegenwart eines Albuminpolymeren von unerwünschten Proteinverunreinigungen befreit wird«

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die humorale Immunität des Menschen beruht darauf, daß im Blut Immunglobuline zirkulieren, die von B-Zellen synthetisiert werden.

Immunglobuline oder auch Gammaglobuline sind hochmolekulare Eiweißstoffe, deren Molekülstrukturen entsprechend der auf den Organismus einwirkenden Fremdsubstanzen wie z.B, Viren, Bakterien bzw. deren Stoffwechselprodukte variabel angepaßt sind. Immunglobuline dienen der Abwehr von Fremdsubstanzen, wobei sie in einem komplexen Mechanismus wirken. Von den 5 Klassen der Antikörper sind die der Klasse G von ihrer Menge und Wirksamkeit die wichtigsten* Immunglobulin G hat ein Molekulargewicht von ca. 160 000 Dalton. Das Molekül des Immunglobulin G besitzt einen variablen Teil F (ab¹)«» ^er entsprechend der einwirkenden Fremdsubstanz strukturiert ist und einen konstanten Teil (Fc), der wichtige biologische Funktionen im Körper erfüllt wie z.B. die Komplementbindung, die Wechselwirkung mit Rezeptoren auf Zellmembranen, den transplazemtaren Transport des Moleküls, katabolische Eigenschaften und die passive kutane Anaphylaxie.

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Die Entwicklung der humoralen Immunität wird in den ersten zwei LebensJahrzehnten ausgebildet und ist am schwächsten zwisohan dom 6, und 24. Lebenamonat. Geatürt ist die humorale Immunität bei Menschen, die am Antikörpermangelsyndrom leiden oder deren Organismus infolge einer Krankheit oder anderer hoher Belastungen geschwächt ist.

Um die fehlenden Antikörper zu substituieren, die für die Abwehr von Infektionen von größter Bedeutung sind, werden dem Organismus Immunglobuline appliziert,

Es ist bekannt, daß diese Immunglobuline durch Fraktionieren _N von menschlichem Blutplasma nach der sogenannten Cohn-Methode durch Ethanolfällung in reiner Form isolierbar sind

Cohn et.al., J.Amer.Chem.Soc., 68, 459 (1946) Cohn et.al., J.Amer.Chem.Soc, 7^, 465 (1950).

Die so gewonnenen Immunglobulin-Präparate können nur intramuskulär appliziert v/erden, weil während der Fraktionierung Immunglobulin-Aggregate entstehen. Die Aggregate lösen bei intravenöser Applikation eine Reihe von Unverträglichkeitsreaktionen aus, die durch Einwirkung auf das körpereigene Komplementsystem hervorgerufen werden. Die intravenöse Anwendung von Humangammaglobulin ist der intramuskulären vorzuziehen, um einen Abbau der Antikörper im Muskel vor dem Wirksamwerden zu verhindern und um im akuten Krankheitsfalle die therapeutische Wirkung rasch herbeiführen zu können. Es ist versucht worden, die Intravenösvertraglichkeit von' Humangammaglobulin durch verschiedene Methoden zu erreichen. Es wurden Methoden angewendet, bei denen durch Zugabe von Enzymen (Pepsin oder Plasmin) die Immunglobulinmoleküle ganz oder teilweise gespalten oder durch Hydrolyse bei pH 4 so verändert wurden, daß eine Aggregatbildung und die damit ausgelöste Komplementaktivierung verhindert wurde.

Weiterhin wurde der gleiche Effekt der Unterdrückung der •Aggregatbildung dui-ch chemische Modifikation der Immunglobulinmoleküle mit Propiolacton, durch Sulfonierung von 4 bis 5 intramolekularen Disulfidbrücken oder durch Reduktion von 2 bis 4 intramolekularen Disulfidbrücken und anschließende

Alkylierung mit Jodace^tamid erzielt. Durch diese Behandlung wird allerdings die therapeutische ./irkung der Immunglobulinpräparate nachteilig beeinflußt.

Die biologische Qualität der Präparate ist gemindert und die biologische Halbwertzeit der Immunglobuline verkürzt.

Ein weiteres zum Stand der Technik gehörendes Verfahren nach welchem intravenös verträgliches Immunglobulin hergestellt wird umfaßt eine Abtrennung der Aggregate durch selektive Adsorption an Kieselsäure oder an Mineralien, bei denen es sich im Wesen.-!; Hohen Wn Alumosilikate handelt in Gögehwart von Hydroxyethylstärke.

Zum Stand der· Technik gehören auch Verfahren, die zur intravenösen Anwendung bestimmtes Immunglobulin von dem antikomplementären Aggregatanteil durch wasserlösliche, ungeladene, kettenförmige Polymere in Gegenwart von künstlich zugesetzten hochmolekularen Proteinstabilisatoren (Hydroxyethylstärke, Kohlehydrate, Albumin) befreien.

Diese Verfahren zeichnen sich dadurch aus, daß die Immunglobulinmoleküle chemisch unverändert bleiben und so ihre volle biologische Wirksamkeit behalten.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, die Abtrennung der un-

^ erwünschten Immunglobulinaggregate vom nativen Immunglobulin unter Zusatz einer möglichst kleinen Menge künstlicher Substra te zu erreichen, indem als letztere lediglich vernetztea polymeres Albumin und ein geringer Zusatz eines indifferenten wasserlöslichen Polymeren eingesetzt werden.

Darlegung des V/esens der Erfindung^

Bei einem bekannten Verfahren zur Gewinnung von intravenös verträglichem Gammaglobulin, bei dem die antikomplementär wirkenden Aggregate mittels Polyethylenglycol 6000 in einer Menge von 4.5 - 7 g/100 ml Lösung einer 3%igen Gammaglobulinlösung ausgefällt werden sollen (GB-PS 1372953), wird keine absolute Abtrennung der Polymeren erreicht. Ursache dafür ist die unzureichende Selektivität des PEG als Fällungsmittel,

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wobei auoh ein zusätzlich angefügter Pällungsschritt kein aggregatfreies Iminunglobulin G liefert.

In der Patentschrift DE - 2856939 wird ein besseres Resultat bezüglich der Aggregatfreiheit erzielt, indem neben dem PEG Humanalbumin in einer Konzentration von 0.3 bis 3 Gew.-% der Gammaglobulinlösung zugesetzt wird. Das Albumin bewirkt einen Schutz der nicht aggregierten Immunglobulinmoleküle vor der Ausfällung. Nach Zusatz von, 10% PEG werden in einem ersten Fällungsschritt die antikomplementär wirkenden Aggregate ausgefällt und abgetrennt. Der Überstand wird mit 20% PEG versetzt, wobei das Gammaglobulin ausfällt. Der Niederschlag wird in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und steht nach Sterilfiltration zur therapeutischen, intravenösen Anwendung bereit.

Es stellt sich die Aufgabe, den aggregierten Immunglobulinanteil mit hoher Selektivität zu entfernen, ohne dabei eine Mitfällung monomerer Immunglobulinmoleküle zu verursachen, wobei eine möglichst geringe Menge an Premdsubstanzen zum Einsatz kommen sollte. Das wird mit dem vorgeschlagenen Verfahren erreicht, indem die Gammaglobulinfallung mit PEG in Gegenwart von vernetztem Albumin in Form eines unlöslichen Gels vorgenommen wird. Das polymere Albumin bewirkt dabei eine Bindung der aggregierten Immunglobulinmoleküle durch hydrophobe Wechselwirkung, die schon bei PEG-Konzentrationen

>5 von unter.5 Gew.% eintritt. Durch einfache Filtration ist das mit aggregiertem Immunglobulin angereicherte polymere Albumin abtrennbar.

AusfÜhrun^abe isp iel:

Zur Herstellung der Gammaglobulinlösung, aus welcher die Aggregate abgetrennt werden sollen, wird steriles Humanplasma in einer ersten Fraktionierungsatufe mit 8 Gew.% Ethanol bei einem pH-'./ert von 7.2 bei -3⁰G versetzt. Dabei fällt die sogenannte Fraktion I nach Cohn aus.

Der Überstand wird bei -5⁰G und einem pH-V/ert von 5.8 auf !5 einen Ethanolgehalt von 19 Vol.% gebracht, wobei sich die sogenannte Fraktion II-III absetzt, die in der Hauptsache aus Humangammaglobulinen besteht.

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Dor Niederschlag wird angelbst. Nach Abtrennen eines Niederschlages, der sich bei pH 5.0 und 8 Vol.% Ethanol bildet, wird auo dem Überstand bei einem ISthanolgehalt von 25 Vol.% und einem pH-Wert von 7*0 bis 7.2 das Gammaglobulin als Niederschlag abgeschieden. Dieser Niederschlag besteht aus mindestens 90/5 Gammaglobulin.

Dieser Rohniederschlag v/ird in einem Citratpuffer angelöst und 4 Gewichtsprozente mit Glutaraldehyd vernetztes Humanalbumin als Gel sowie 4 Gew.% PEG 4000 zugesetzt. Nach 2~stlindisem Rühren wird das Humana Ib um in-Gel abgetrennt.

Aus dem Überstand ist das aggregatfreie Humangammaglobulin in bekannter V/eise zu gewinnen und als 5/Sige Lösung intravenös verwendbar.

Das nach dem beschriebenen Verfahren gewonnene Gammaglobulin ist ein natives Produkt, d.h. die Immunglobulinmolekiile sind gänzlich unverändert und entsprechen damit der im Serum vorliegenden Molekülf'orm. Die geringe Komplementaktivierung siohert eine gute intravenöse Verträglichkeit.

Claims (4)

Ζ4ΙΠ3 Erfindungsanapruoh,

1. Verfahren-zur Herstellung eines intravenös verträglichen unmodifizierten Humangammaglobulins dadurch gekennzeichnet, daß Humangammaglobulin zur intramuskulären Anwendung oder eine Zwischenfraktion der üblichen Fraktionierungsmethoden von Immunglobulinaggregaten befreit werden, indem diese an vernetztes Humanalbumin in Gegenwart eines indifferenten wasserlöslichen Polymeren adsorbiert werden.

2. Verfahren nach Punkt 1 dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Albumin durch Vernetzung der Monomeren mit aus der Proteinchemie bekannten bifunktionellen Substanzen, vorzugsweise mit Glutaraldehyd oder durch Hitzebehandlung, gewonnen wird und in einer Konzentration von 1-6 Vol.% als Gel eingesetzt wird.

3· Verfahren nach Punkt 1 dadurch gekennzeichnet, daß ein pH-iVert von 6 bis 8 eingehalten wird.

4« Verfahren nach Punkt 1 dadurch gekennzeichnet, daß als Polymer Polyethylenglycol 4000 oder Polyethylenglycol 6000 in einer Konzentration von 3 bis 7 Gew.% eingesetzt werden,