DD208988A5

DD208988A5 - Verfahren zum aufbau eines chimaeren plasmids mit einer genkodierung fuer eine thermostabile alpha-amylase

Info

Publication number: DD208988A5
Application number: DD82236740A
Authority: DD
Inventors: Jonathan R Mielenz; Susan Mickel
Original assignee: Cpc International Inc
Priority date: 1981-01-15
Filing date: 1982-01-14
Publication date: 1984-04-18
Also published as: ATE17373T1; IL64741A0; EP0057976A2; DE3268340D1; ES8405070A1; MX7066E; FI79139C; EP0057976B1; YU9682A; IE52434B1; IL64741A; YU176384A; CA1170202A; DK157879C; FI820107L; JPS57139097A; SU1200853A3; HU193516B; DK13182A; IE820032L

Abstract

Die Erfindung betrifft ein chimaerisches Plasmid mit einer Genkodierung fuer eine thermostabile Alpha-Amylase fuer das Klonen des Gens in Escherichia coli oder Bacillus subtilis fuer die Verwendung der daraus resultierenden Mikroorganismen bei der Produktion eines hitzebestaendigen Alpha-Amylase-Enzyms, beispielsweise fuer die Herstellung von glukoschattigen Sirupen aus Maisstaerke. Erfindungsgemaess wird das chimaerische Plasmid mit einer Genkodierung fuer eine thermostabile Alpha-Amylase, welche durch Abschneiden von DNSvon einem Donator und Kombinieren der resultierenden DNS-Fragmente mit einem in aehnlicher Weise zerschnittenen Vektor hergestellt wird, in der Weise hergestellt, dass der Donator ein natuerlich vorkommendes Plasmid ist, dass eineGenkodierung fuer eine thermostabile Alpha-Amylase enthaelt.

Description

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Berlin, ä.en 21.7.1982 AP C 12 N/236 740/8 60 256/18

Chimärisches Plasmid

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf chimärische Plasmide, die ein ein hitzbeständiges Alpha-Ainylase-Snzym codierendes Gen enthalten sowie auf ein Verfahren zu deren Herstellung. Desgleichen beschrieben werden das Klonen des Gens in Escherichia coli oder Bacillus subtilis sowie die Verwendung der daraus resultierenden Mikroorganismen bei der Produktion eines hitzebeständigen Alpha-Amylase-Enzyms.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Große Mengen -glukosehalt iger Sirupe werden durch die enzymatisch^ Hydrolyse von Maisstärke erzeugt· Als erster Schritt dieses Verfahrens erfolgt gewöhnlich die Behandlung einer Stärke-Wasser-Mischung mit einem Alpha-Amyiase-Enzym bei einer Temperatur nahe dem Siedepunkt von Wass.er. Sine hitzebeständige Alpha-Amylase ist bei diesen Temperaturen am wirksamsten« Aus diesem Grunde besteht ein starker Anreiz, eine kostengünstige Quelle für ein derartiges hitzebe-, ständiges Enzym zu gewinnen.

Die industriell genutzten Alpha-Amylasen werden durch verschiedene Mikroorganismen erzeugt, Ss ist bekannt, daß diese Mikroorganismen genetisches Material entfalten, welches die Snackprodukt ion durch den Organismus codiert. Dieses genetische Material liegt innerhalb der Zeile in Form von Desoxyribonukleinsäure - im folgenden als DiTS bezeichnet -

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Der größte Teil des genet iseilen Materials in einem Bakterium besteht aas DiJS-Riesenmolekülen, welche als aas Chromosom der Zelle vorliegen« Sine bestimmte Menge des genetischen Materials kann jedoch aach in Gestalt kleinerer, geschlossen kreisförmiger DIiS-MoIeküle - sogenannter Plasmide - vorhanden sein«

Mittels der als genetic engineering bezeichneten Techniken ist es möglich, einen Teil der DiTS von einem Organismus zu einem anderen zu übertragen, "Verschiedene Forscher haben versucht, diese Techniken zur Entwicklung von Mikroorganismen anzuwenden, die als überragende Alpha-Amylase-Erzeuger gelten können.

Bine dieser bereits in Anwendung gebrachten Techniken besteht darin, von einem als Amvläseerzeuger bekannten Mikroorganismus die gesamte DHS - d· h» chromosomale plus Plasmid-DHS zu entfernen« Fragmente dieser DUS werden sodann mit der DIiS eines Bakteriophagen verknüpft. Der diese kombinierte DIiS enthaltende Bakteriophage wird nun dazu verwendet, einen anderen Mikroorganismus zu infizieren, wobei er dieses genetische Material auf die chromosomale DB^-S des Mikroorganismus überträgt. Jene Zellen des infizierten Organismus, die DlTS mit einem Amvlasegen in einer aktiven Form erhalten, werden zu Amylaseerzeugern, Diese Zellen können selektiert und für den weiteren Einsatz kultiviert werden.

Darüber hinaus beinhaltet das hinsichtlich hitzebeständiger Alsha-Amylasen angewendeteigenetic engineering

eine Technik, die aus dem

Extrahieren der gesamten DNS aus einem als Erzeuger solcher Amylasen bekannten Mikroorganismus besteht. Sinige Fragmente der DMS werden in einen neuen Wirts-Mikroorganismus trans-

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formiert, wobei sie in das Chromosom dieses Wirtsorganismus eingefügt γ/erden. Einige jener Zellen, in welche DlS mit aktivem amylsasecodierendem genetischem Material eingefügt worden ist, werden dann selektiert und angebaut.

Uunmehr hat es sich gezeigt, daß DIiS, welche eine hitzebeständige Alpha-Amyläse codiert, in einem natürlich vorkommenden Plasmid existieren kann. Darüber hinaus hat sich gezeigt, daß derartiges natürlich vorkommendes genetisches Material, welches ein Gen enthält, das hitzebeständige Alpha-Amylase codiert, direkt mit einem als Plasmidvektor bekannten anderen. Plasmid kombiniert werden kann, um auf diese V/eise ein synthetisches Plasmid zu ergeben, das im folgenden als chimärisches Plasmid bezeichnet wird. Dieses chimärische Plasmid kann in einen neuen Wirts-Mikroorganismus eingelagert und dort vervielfacht werden. Dies nun gestattet die Entwicklung von in überragendem Maße Alpha-Amylase erzeugenden Mikroorganismen, welche ohne weiteres auf industrieller Grundlage angebaut werden können. Die vorliegende "Erfindung richtet sich auf den Einsatz der neuentdeckten, natürlich vorkommenden, Alpha-Amylase-Gene enthaltenden Plasmide, auf die 3ildung von chimärischen Plasmiden, die deren genetisches Material enthalten, sowie auf die Entwicklung neuer Mikroorganismen,, die diese chimärischen Plasmide enthalten«

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Mikroorganismus, der ein überragender Erzeuger eines thermostabilen Alpha-Ainylase-Snzyms ist und kommerziell einfach gezüchtet werden kann.

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Darlegung dea 7/esens der Erfindung;

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Stamm eines einfach, gezüchteten Mikroorganismus zu ändern, so daß er eine große Menge eines thermostabilen Alpha - Amyläse Enzyms herstellen kann,

Erfindungsgemäß wird dieses Problem durch "genetic engineering* (künstliche genetische Modifikation) gelöst, um genetisches Material in den Bacillus subtilis einzuführen, wodurch der Bacillus subtilis große Mengen des thermostabilen Alpha-Amylase-Enzyms erzeugen kann.

Insbesondere wird erfindungsgemäß ein Verfahren sur Herstellung eines chimärischen Plasmids vermittelt, wobei dieses Plasmid ein Gen enthält, das eine hitzebeständige Alpha-Amyläse codiert. Das Verfahren besteht zunächst, aus dem Zerschneiden jener natürlich vorkommenden Plasmid-DUS, die ein die hitzebeständige Alpha-Amylsse codierendes Gen enthält, um auf diese Weise eine lineare DUS-Sequenz zu gewinnen, welche das die Alpha-Amylase codierende Gen enthält. Desgleichen wird ein Vektor zerschnitten, um eine zweite lineare DIiS-Sequenz zu erlangen. Schließlich werden die beiden linearen DlTS-Se quenz en unter Bildung des chimärischen Pias mi ds miteinander verknüpft.

Ebenso offengelegt wird das chimärische Plasmid, welches unter Verwendung eines als Donator dienenden natürlich, vorkommenden Plasmids gewonnen wurde, wobei dieses Piasmid ein Gen enthält, weiches eine hitzebeständige Alpha-Amylase codiert, Bas chimärische Plasmid wird durch Zerschneiden der Bonator-D2J3 · und Kombinieren der so erhaltenen DiTS-^ragmente mit einem in ähnlicher Weise zerschnittenen Vektor hergestellt.

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Schließlich wird in Übereinstimmung mil; der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von einer hitzebeständigen Alpha-Amylase in hohen Ausbeuten vermittelt. Mindestens ein das Alpha-Amvlase-Gen enthaltendes chimärisches Plasmid wird in einen Wirts-Mikroorganismus eingeführt. Der das chimärische Plasmid enthaltende Mikroorganismus wird in einem geeigneten Medium kultiviert. Daran anschließend wird die vom kultivierten Mikroorganismus produzierte Alpha-Amylase isoliert.

Die vorliegende Erfindung vermittelt ein Verfahren, welches es ermöglicht, in einer einseinen Zelle zahlreiche Kopien des die hitzebeständige Aipha-Amyla3e codierenden Gens zu erzeugen. Sie vermittelt desweiteren einen Weg zur Überführung des Amylase-Gens in Mikroorganismen, welche in einfacherer Weise als der Donator-Mikroorganismus angebaut werden können. Somit werden ohne Schwierigkeiten gesteigerte Enzvmausbeuten erzielt.

Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung gelten die folgenden Begriff s be st iinmungen:

1. Natürlich vorkommendes Plasmid

Der Begriff"natürlich vorkommendes Plasmid", wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf jegliche Plasmid-DiJS, die in einem in der Natur vorkommenden Mikroorganismus vorhanden ist,

2. Chimärisches Plasmid

Der Begriff "chimärisches Plasmid" bezieht sich entsprechend dem in der Fächwelt allgemein üblichen Gebrauch auf ein Plasmid aus rekombinanter DNS, welches durch eine bestimmte

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Technik der. künstlichen genetischen Modifikation aas einem Donator-Mikroorganismus und einem geeigneten Vektorplasmid gebildet wurde»

3· Hitzebeatändige Alpha-Amylaae

Der Begriff "hitzebeständige Alpha-Amyläse", wie er in der vorliegenden'Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf jedwede..Alpha-Amylase-Zubereitung, die in der Lage ist, 45 min lang bei 90 ⁰G, einem pH-Wert von 6,0 und unter Anwesenheit von Calciumionen zumindest 6o % ihrer anfänglichen Aktivität beizubehalten,

4» Alpha-Atny läse—Gen

Sin DU3-8egment, -welches die innerhalb der Zelle erfolgende Alpha-Amvlaseproduktion.codiert und:die für die Synthese einer katalytisch aktiven Alpha-Anilyase notwendige regulatorische Information beinhaltet.

Die chimärischen Plasmiden der vorliegenden Erfindung v/erden

'<&;· ' ' ' .- ·' . . "

unter -Verwendung·: der von einem natürlich vorkommenden Donatororganiamus stammenden DHS hergestellt, wobei dieser Donator-Mikroorganismus ein Gen enthält, welches ein hitzebeständiges Alpha-Amylase-Snzym codiert» Geeignete Donatororganismen werden bei jenen wärmeliebenden Bakterien gefunden, die als Bacillus stearothermoohilua (abgekürzt 3»atearothermoph.ilms) ^¹^- Thermos flavus (abgekürzt T«.flavus) klassifiziert sind« Auch Stämme von Bacillus licheniformis (abgekürzt 3, . licheniformis) sind geeignete Donator-Mikroorganismen* Als Donator-DHS-Quelle besonders geeignete Stämme von B. stearotheriabphilus sind ,jene Stämme, die der B. stearothermoohilus-GrupOe der ATCG-lTumniern 31 195, 31 196, 31 197, 31 198, 31 199 and 31 733 so?;ie deren Varianten und

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Mutanten wie auch der Submutanten jener Mutanten angehören.

S3 ist herausgefunden worden, daß in einer Reihe dieser Mikroorganismen Plasmide vorhanden sind, die ein Gen besitzen, welches ein hitzebeständiges Alpha-Amylase-Snzym codiert,

Plasmid-DliS ist in besonderem Maße als Quelle für die Donator-DIiS geeignet, weil sie snit Hilfe einer Ultrazentrifuge leicht gereinigt werden kann. Damit wird eine DITS-Quelle für das Verfahren gewonnen, bei dem die Amylase-Gene hochkonzentriert und frei von vielfältigem fremden und unerwünschten genetischen Material sind·

Qm die chimärischen Plasmide der vorliegenden Erfindung zu bilden, ist es möglich, jedweden mit dem Wirts-Mikroorganismus verträglichen Vektor au verwenden. Diese Plasmide sind vorteilhafter nachzuweisen, wenn der Vektor einen Marker beinhaltet« Insbesondere brauchbar sind jene Vektoren, die einen antibiotikaresistenten Marker enthalten* Plasmide von Sscherichia coli, im folgenden als S. coli angekürzt f- die . solche antibiotikaresistenten Marker enthalten, sind leicht zugänglich« Als geeignet gelten die mit pBR 322, pBR 325 und pWL 625 bezeichneten Plasmide» Plasmide von Bacillus sübtills, im folgenden als B. subtilis abgekürzt, wie etwa das Plasciid pG 194, welches"ein Chloramphenikolresistenz übertragendes Gen enthält, sind ebenfalls geeignet.

Ein Vorteil der Verwendung derartiger Vektoren besteht in der Tatsache, daß sie· als Vielzahl von Kopien in einer Zelle existieren können, ΐ/'ird also ein Alpha-Amvlase codierendes Gen in diese Vektoren eingeführt, dan η ist das Gen innerhalb der Seilen gleichfalls in vielfachen Kopien vorhanden. Dies resultiert in einer gesteigerten Alpha-Amyläse-Produktion

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pro Zelle. Werden E.-coli-Stämme als Wirtsorganismus verwendet, dann ist eine"weitere Genverstärkung möglich, Dies erfolgt unter Anwendung der Chloramphenikol-Genverstärkungstechnik nach. D,3. Clewell, J, Bacteriology, 110, 667...676 (1972).

Die chimärischen Plasmide der vorliegenden Erfindung werden zunächst dadurch aufgebaut, daß jene natürlich vorkommende DNS, die ein das hitzebeständige Alpha-Amylase-Snzym codierendes Gen enthält, unter Verwendung einer geeigneten Restriktions-Sndonuklease zerschnitten wird. Bei der durch die Endonuklease zerschnittenen Donator-DNS handelt es sich vorzugsweise um Plasniid-DITS» Dieses Plasmid kann entweder vor oder nach seiner Abtrennung von der chromosomalen DNS des Donators zerschnitten werden. Die Endonuklease muß von der Art^: sein, daß· sie die Donator-DiJS zerschneidet, ohne dabei das Gen zu beschädigen, welches das Alpha-Amylase-Enzym. codierto- Als für diesen Zweck geeignete Endonuklease hat sich hier das Enzym Hind III erwiesen.

Der Vektor kann jedoch auch mit jeder anderen Endonuklease zerschnitten werden, welche lineare DNS.mit solchen Enden erbringt, die in der Lage sind, sich mit den Enden der Fragmente der Donator-DNS zu verbinden.

Das Zerschneiden kann auf einem Gemisch von Donator-DNS und Vektor erfolgen, die Donator-DNS und der Vektor können aber auch separat zerschnitten werden. In jedem Fall wird ein Gemisch aus linearen DNS-Sequenzen gewonnen. Einige der vom Donator-Mikroorganismus stammenden linearen Sequenzen enthalten das die Alpha-Amyläse codierende Gen«

Die durch Zerschneiden von Donator-DNS und Vektor gewonnenen

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linearen DlIS-Sequenzen werden vermischt und verbinden sich miteinander unter Bildung eines neuen Plasmids, des chimärischen Plasmids. Das Verbinden der linearen ,DlTS-Sequensen erfolgt mittels einer Ligase unter Anwendung der im Fachgebiet weithin bekannten Techniken« Sine für diesen Zweck brauchbare Ligase ist die im Fachhandel erhältliche T, DHS-Ligase.

Die chimärischen Plasmide der vorliegenden Erfindung werden biologisch aktiv gemacht, indem sie in Wirtszeilen.eines geeigneten Mikroorganismus überführt werden» Zu den geeigneten Wirten gehören die amvlasenegativen S,-_<coli-3tämme REl und C600, die am^lasennegativen 3 .-sübtilis-Stamme ATCC ITr. 31 785 und Bacillus Genetic Stock Center Ur. 1A239« Die Überführung erfolgt unter Anwendung weithin bekannter Methoden« Diese Methoden beinhalten die Absorption "von Plasmiden durch zuständige Zellen, die Protoplastfusion sowie die Absorption durch Ξ.-coli-Zellen, welche mit CaCIo behandelt worden sind.

Die Zellen, welche die gewünschten Plasmide enthalten, werden durch Screening der Zellen mit der Amylaseaktivität des Donators ausgelesen. Enthält der Vektor einen antibiotikaresistenten Marker, dann erfolgt vorteilhafterweise ein vorangehendes Screening durch Plattieren der Zellen auf Agarplatten, die das Antibiotikum im Medium enthaltene üur jene Zellen, welche die gewünschte Resistenz aufweisen, werden sodann angebaut. Die Amylaseaktivität wird ermittelt, indem den Platten lösliche Stärke zugesetzt wird« ilach dem iVachstum werden die Platten mit einer verdünnten Iodipsung behandelt oder loddampf ausgesetzt. ITur jene Kolonien, welche die ge-' vünschte Amylaseaktivität besitzen, werden helle Flächen zeigen, auf denen die Stärke abgebaut ",'orden ist und infolge-

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dessen keine Färbung mit dem Iod möglich, ist,

llexm. die die rekombinaten Plasniide enthaltenden Zellen die Alpha-Amyläse intrazellulär produzieren, dann ist es erforderlich, die Zellen.su lasieren, bevor es möglich ist, das Enzym nachzuweisen« Ξ.-coli-Zellen werden geeigneterweise mit dem Bakteriophagen"T', oder mit D-Zykloserin lysiert,

Bs hat sich gezeigt, daß bei Verwendung von B^subtilIs-St aminen als Wirt für die chimärischen Plasmiden die von den Zellen erzeugte Alpha-Amylase-Enzym von den Zellen in das Medium exportiert wird. Dieser Befund ist für die industrielle Herstellung des Bnzvni3 von Wichtigkeit, da hierbei der aufwendige Schritt der Zell-Lysierung vermieden wird. Das B.. s üb til is., ist darüber hinaus ein besonders wünschenswerter Wirt insofern, als es eine an industrielle Vergärungen gut angepaßte Art darstellt.

Chimärische Plasniide, die von den Wirtszellen erzeugt worden sind, lassen sich unter Anwendung bekannter Verfahren ohne weiteres isolieren. Bines dieser Verfahren ist das Standard-Reinlysat-Verfahren nach Clewell und Helinski, Biochemistry, £, 4428 ,,» 4440 (1970). Die Reinigung der Plasmide kann vermittels der GsGl-Dichtegradient-Ultrazentrifugation erfolgen.

Die das Alpha-Amylase-Gen enthaltenden chimärischen Plasniide können als ein Donator für diese Gene verwendet werden« Die Plasmide werden mit einer hierfür geeigneten Restriktions-Sndonuklease zerschnitten, um lineare DlS zu ergeben, welche das Alpha-Amylase-Gen enthält* Die lineare DITS kann mittels Saccharose-Gradient-ültrazentrifugation gereinigt werden, Dieses genetische Material wird dann mit einem 'anderen Vek-

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tor kombiniert, um ein differentes chimärisches Plasmid zu ergeben.

Die Alpha-Amylase, die von den das chimärische Plasmid enthaltenden Wirtszellen erzeugt wird, behält ihre hitzebeständigen Eigenschaften bei. Dies trifft selbst dann zu, wenn es sich bei dem Wirts-Mikroorganismus um einen Mesophilen handelt, also dieser selbst kein Thermophiler ist. Desweiteren scheinen die Produkte, die durch die Wirkung der von dem geklonten Mikroorganismus stammenden Amyläse auf Stärke erzeugt werden, mit jenen Produkten identisch zu sein, die durch die Amylase des Donator-Mikrioorganismus erzeugt wurden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann dazu verwendet werden, zwei oder mehrere unterschiedliche chimärische Plasmide, welche hitzebeständige Alpha-Amylase codierende Gene enthalten, in den gleichen Wirts-Mikroorganismus zu überführen. So wurde beispielsweise E. coli RRl durch die Einlagerung jener chimärischen Pläsmide modifiziert, die durch Kombinieren eines hitzebeständigen Alpha-Amylase-Gens mit den Vektoren pBR 325 und pWL 625 gewonnen wurden. Beide Pläsmide wurden inkorporiert, verdoppelt und durch die Wirtszellen dargestellt.

Ausführung^ beisρiel

Die folgenden Ausführungsbeispiele illustrieren bestimmte Verkörperungen der vorliegenden Erfindung, Sofern nicht anders angegeben, beruhen sämtliche Verhältnis- und Pro ζentangaben auf der Massebasis.

Alle ATCC-Uummern tragenden Stämme sind bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, erhältlich.

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Ausfährungsbeispiel 1

Herstellung von Plasmiden, die Alpiaa-Amylase-Gene und einen Antibiotika-Resistenzmarlcer enthalten.

Unter Anwendung der.allgemeinen Methode von Berns und Thomas, J, Molec. 3iol», 21s 476**.490 (1965), wurde aus Zellen eines Stammes von B. steärothermophilds, AICC-Nr* 31 783, die gesamte Alpha-Amylase-Gene enthaltende BNS isoliert. Im vorliegenden Verfahren indes nicht in Standard-Salszitrat, sondern in einer Mischung aus 50 mM tris(Hydj?os:yniethyl)aniinomethanhydrochlorid (im folgenden als Tris-HCl beschrieben) bei pH 8, 0,6 EiM Ethylendiamintetraessigsäure (im folgenden als EBTA bezeichnet) und 25 % Sacharose suspendiert,_:Bie Zellen wurden darüber hinaus eine Stunde lang vor der Lysis bei 0 ⁰C aiit LysοzyBi; (2 mg/ml) behandelt. Bie Plasmid-pBR-322-BUS, das Restrictionsenzytn Hind III und die T^-BUS-Ligase ?iurden von den Bethesda Research Laboratories, Bethesda, Maryland, bezogen.

Sin Gemisch aus 7»5/ig Gesamt-BHS von B. stearotherraohilus, 7 Einheiten (S) Restriktionsenzym·Hind"III und 10/ug bovinem Serumalbuinin in einer 100- ^uI-Lösung aus 50 aivl HaCl, 6 mM .Tris-HCl (pH 7,5) und 6 mM MgCl^ wurde bei 37 ⁰G 30 min lang inkubiert. 2,2 /ag Plasmid-pBR322-B3S und 7 2 Hind III wurden in 20/al einer ähnlichen Lösung eine Stunde lang bei 37 ⁰C verdaut. Bie BITS-Analyse auf Agarose-Gel aeigte, daß die Verdauung vollständig war.

STun wurden 6,75 yag der verdauten B.-stearothertnophilus-BiTS 1,8 ^ag der verdauten pBR322-DIT3 in 0,3 ml einer Lösung aus 66 mii Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mLI IvIgGl₂, 10 sM Bithiothreitol und 0,067 mM Adene'sintr!phosphat (im folgenden AtP genannt)

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vermischt und unter Verwendung von 0,28 Einheiten T,-DlS-Ligase miteinander verknüpft, Bine Analyse der DiTS nach der Ligation auf Agarose-Gelen zeigte, daß es zu einer vollständigen Ligation ohne nachweisbare Reste von linearer pBR 322-DlTS gekommen war.

Ausführungsbeispiel 2

Transformation, von Plasiniden, die Alpha-Ainylase-Gene und einen Antibiotika-Resistenzmarker enthalten, in S. coli

Eine Kultur von S. coli RRl, als Stamm PRC 399 beim Plasmid Reference Center, Stanford University Medical Center, Stanford, California, erhältlich, wurde auf dem nachstehenden Me di um ange ba ut:

g/Liter.

Trypton 10,0

Hefeexirakt 5₉O

, natriumchlorid 5,0

Glukose 1,0

Die Kultur wurde' bei 37 ⁰C über ZTaent in einem Reagenzglas angebaut. Sie wurde dann mit 9 Teilen des gleichen Mediums verdünnt und bei 37 ⁰C für weitere 135 min unter kräftigem Verrühren inkubiert. Die Zellen wurden durch Sentrifugation geerntet und mit kalter 0,1 M ITaCl-Lösung gewaschen. Die geernteten S.-coli-Zellen wurden für die Transformation mit Hilfe der'Calciumchloridmethode nach Cohen et al,, Proc. Hat. Acad. Sei., U.S.A., _o9., 2110...2114 (1972) präpariert.

Sine Hälfte der in Ausführungsbeispiel 1 hergestellten verknüüften DHS vmrde in die Seilen von 3.coli RRl transformiert.

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Die Zellen wurden auf Platten kultiviert, die das gleiche Medium enthielten,, auf des auch, die S.-coli-Zellen angebaut worden waren, mit Ausnahme dessen, daß hier das Medium Anrpizillin in einer Konzentration von 50 /ig/ml enthielt. Auf diese Weise warden nur solche Zellen von E. coli gewonnen, die das Plasmid pBR322 (mit ampizillinresisten"Genen) enthielten.

Als Hilfsmittel sur Bestimmung der Anzahl von Zellen, die rekombinante MS enthielten, wurden die ampizillinresistenten Zellen hinsichtlich ihrer Widerstandsfähigkeit gegenüber 'Tetrazyklin kontrolliert« Da die Insertion eines DES-Stückes in die durch Hind III zerschnittene Stelle von pBR322 das für Tetrazvklin-Resistenz zuständige Plasmid-Gen gewöhnlich inaktiviert, ergibt sich die Anzahl der in der Zellpopulation vorhandenen rekomb inant en DiTS-halt igen Zellen aus der Häufigkeit der Tetrazyklin-Sensitivität, Die Transformation erbrachte 3j6 χ 10 ampizillin-resistente Zellen pro Milliliter sowie 3,0 χ 10 tetrazvklin-resistente Zellen pro Milliliter. Polglich waren etwa 16 % der Zellen gegenüber Tetrazyklin sensitiv, woraus hervorgeht, da3 die Plasmide aufweisen, welche rekomb inant e DlIS enthalten«

Ausführungsbeispiel 3

Isolation von Alpha-Amylase produzierenden a,-coli-Kolonien« Zubereitet wurde ein Medium, der gleichen Zusammensetzung wie jenes, das für den Anbau von JS. coli verwendet worden war, wobei allerdings noch 15 g/Liter Agar plus Ampizillin (50yUg/ml) zugesetzt wurden« Dieses Medium 7/urde in 130 Petrischalen eingebracht und mit verdünnten transformierten . 5, coli inokuliert, die in der in Ausführungsbeispiel 2 dargestellten Weise präpariert worden waren. Diese Schalen erbrachten eine Ausbeute von durchschnittlich 113 Kolonien pro

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Schale. Die Kolonien durften bia zu einer Größe von etwa 1,.·2 nun Durchmesser wachsen, bevor sie auf ein Stärkemedium der folgenden. Zusammensetzung gebracht wurden:

Ha₂HPO₄

KH₂PO₄ HaCl

g/Liter	6
	3
	0,5
	1
	1
	0
1	5
1	0
1

Hefeestrakt

Pepton

Agar

Lintner's Stärke

liach dreistündigem 7/achstum wird der Bakteriophage T., - .als ATCC-Itfr. 11303-B4 erhältlich - den Schalen in einer stärke-, haltigen Überschichtung zugesetzt. Um die wachsenden Ξ. coIi zu lysieren, v/erden etwa 1 χ 10 T^ pro 8_Ghale verwendet5 auf diese W_eise werden etwaige intrazelluläre Snzyme freigesetzt, Hach Wachstum und Lysis über Nacht wurde eine 2,5 %ige Lösung von Lugol^f3 lodlösung auf die Schalen geschüttet, um irgendwelche durch Amylaseaktivitat erzeugte helle Zonen nachzuweisen.

Von den ungefähr 15 000 vorhandenen Kolonien erzeugten 18 Kolonien helle Zonen, dergestalt auf die Anwesenheit von Amylase hinweisend. Die Amylaseaktivitat enthaltenden Kolonien wurden abdruckplattiert und erwiesen sich erneut als amylaseaktivitäthalt ig. Die Amylaseaktivitat zeigte sich allerdings lediglich nach dem Zusetzen von T₄ zur Zeil-Lysis, woraus hervorgeht, daß die Amylase intrazellulär erzeugt wurde. Im weiteren Versuchsverlauf zeigte sich, daß für das Lysieren der Zellen D-Sykloserin die gleiche Wirksamkeit wie

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T4 besitzt, wenn die Droge dem überschichtmedium in einer Konzentration γοη 600 ^ug/ml zugesetzt wurde·

BinΞ.-^oli-RHI-Stamm, der den Plasmidvektor pBR322 mit einem Amyläsegen"enthält, ist als AICC-Nr. 31 789 erhältlich«

Aasführungsbeispiel 4

Transformation von Plasmiden, die Alpha-Amylase-Gene und einen Antibiotikaresistenz-Marker enthalten, in einen zweiten Stamm von So coli.

Eine Kultur 3. cpli C600 der AICC-IIr. 23 724 wurde angebaut, die Zellen wurden geerntet und entsprechend der Vergehensweise von Ausfuhroagsbeiapiel 2 für die Transformation vorbereitet.

Fünf in Ausführangabeiapiel 3 gewonnene unterschiedliche Amylaseklone wurden angebaut, und die recombinanten Plaamide wurden unter Anwendung der Standard-Reinlysat-Methode nach GIewell und Helinski, Biochemistry, ^, 4423...4440 (1970) extrahiert. Die teilweise gereinigte'Plasmid-DNS wurde vor der Transformat ion in die CaCl^-behandelten B.-coli-Zellen in einer Mischung aua 1OmM Tris-HCl und 1,0 inM SKDA bei pH 7j5 suspendiert. Diese DHS wurde analysiert und erwies sich als steril, so daß also iceine amylaseproduzierenden Kolonien vorliegen dürften, deren Existenz auf die Darstellung von Zellen, die mit der DiTS eingeführt wurden, zurückzuführen wäre. Die transformierten Zellen wurden auf ampizillinhaltigesi Medium angebaut, um das Wachstum lediglich jene? Zellen zu gestatten, die Plasmide enthalten. Bei der Kontrolle der Kolonien hinsichtlich Amylaseaktivität zeigte sich eine 100%ige Korrelation zwischen dem Vorhandensein von Plasmiden und Asiylaseaktivität. Somit erweist sich Plasmid-DIiS ein-

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deutig in der Lage, beide Ξ, coil Stäme zu transformieren,, um Amylaseerzeuger zu ergeben; "'damit zeigt sich, daß das Phänomen nicht stammabhängig* ist, daß es jedoch hierzu des recombinanten Plasmids bedarf»

Sin Stamm von S. coli CöOO, der den Plasmidvektor pBR322 mit einem' Amyläsegen enthält, ist unter der ATGG-Ur. 31 788 erhältlich,

Ausführungsbeispiel 5

Hitzebeständigkeit der Alpha-Amvlase. Unter Verwendung des Kulturmediums aus Auaführungsbeispiel' wurden vier in Ausfuhrungsbeispiel 3 gewonnene Amylaseklone und eine B.-coli-RRl-Kontrollkultur in 15-ml-KuItüren angebaut . "

Die Zellen wurden durch Zusetzen von D-Zykloserin lasiert, daran anschließend wurden die Zellbruchstücke durch Zentrifugation entfernt. Den überstehenden !Flüssigkeiten wurde Uatriumazetat und Calciumchlorid zugesetzt, um eine Konzentration von 50 mM bzw. 2,5 mM zu ergeben, der pH-Wert wurde auf 6,0 eingestellt. Die Snzymlösungen wurden in mit Schraubverschluß versehene und mit Teflonband ausgekleidete Reagenzrö'hrchen eingebracht. Die Lösungen wurden vor und nach einem 45 minütigen Erhitzen auf 90 G hinsichtlich ihrer Amvlaseaktivität untersucht. Die Amylaseaktivität wurde durch die Geschwindigkeit der Stärkehvdrolyse bestimmt, die sich ihrerseits in der Geschwindigkeit der Abnahme der lod-?ärbei£apazität widerspiegelte; die Messung erfolgte spektrofotometrisch in Übereinstimmung mit der allgemeinen •Methode nach 3.7/. Smith und J.H. Rowe, J. Bio!'. Ghm., 179> 53 (1949). 3as Kontroll-S,- coli zeigte üeine Amylase-

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aktivität. Gereinigte Amylasen von B>stearothermoph.ilus, ÄTCC-iJr, 31 783, B. sabtilia (erhältlich von der Pa, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri unter der Bezeichnung Sigma A6380 ^) und Termamyl (eine hitzebeständige Alpha-Amylase (erhältlich bei der i'a. SFovo Laboratories, Ine,, Wilton, Conn.) wurden dem Kontroll-S« -coli-Lvsat zugesetzt, um als Standards für die Hitzebeständigkeit zu dienen^· Die Ergebnisse der Analysen sind in Tabelle I dargestellt.

Wenn.auch der Katalog der Fa. Sigma Chemical Company dieses Knaym als eine Alpha-Amylase von B, sub til is führt, so haben doch H. Chung und J?. Freiberg, Biöchem. Ji., 185, 387...395 (1930) den Nachweis erbracht j daß: es sich hierbei um ein Enzym von Bacillus amyloliquefaciens handelt.

236740 8

21.7.1982

A? C 12 H/236 740/8

60 256/18

Tabelle I werte der Hitzebeständigkeit'

Quelle des Zell-Lysata	ü-nfangs- aktivität, E/ml	Aktivität nach 45 min«, 90 ⁰G E/ml	% Ver blei bende Aktivi tät
S. coli RHI (Kontrolle)	0	0	__
Kontrolle + " B. stearothermoühilus
Alpha-Amylase (von AiGC 31783)	0,21	0,15	71,4
Kontrolle + Termamyl	0,39	0,34	87,2
Kontrolle + B.subtilis		-
Alpha-Amylase (sigma A638O)	0,21	0,01	4,8
Kontrolle + Klon 1	0,45	0,38	84,4
Kontrolle + Klon 2	0,22	0,18	81,8
Kontrolle + Klon 3	0,36	0,29	81,0
Kontrolle + Klon 4	0,42	0,35	83,3

Die durch die Klone erzeugte Amylase erweist sich als mindestens .genauso hitzebeständig als das durch den Donator B. stearothermophilus produzierte Enzym. Sie ist hinsichtlich der Hitzebeständigkeit der handeiserhältlichen hitsebeständigen Alpha-Amylase, 'Terniamyl, vergleichbar, und sie übertrifft die Alpha-Amylase von eines kommerziellen 3, subtills in bezug auf die Hitzebeständigkeit in eindeutiger Weise,

Ua die erzeugten Zucker, welche niedrige relative Molekülmassen aufwiesen, vermittels der Dünnschichtchromatografie identifizieren zu können, wurden Hydrolysate gewonnen, indem Stärke mit jeder der Araylasen verdaut wurde. Die relativen Llengen der durch die AmyIssen von 5.-coli-Klonen gebildeten Sucker niedriger relativer Molekülrnassen ähnelten den Mengen jener Zucker, die durch die als Kontrollvarianten benutzten

236740 8

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bekannten Alpha-Amylasen gebildet worden waren.

Diese Ergebnisse zeigen, daß da3 von einem extrem tiaermopb.ilen Bakterium ge?/onnene Gen für ein hitzebeständiges Enzym in zuverlässiger Weise in einem mesophilen bakteriellen Wirt ausgedrückt worden ist, um ein Mtzebeständiges Snzymprodukt zu erbringen» Auf diese Weise hat sich herausgestellt, daß unter Anwendung rekombinanter D2T3-Methoden ein'Gen aus einem in hohem Maße thermophilen Bakterium in einem mesophilen Bakterium ausgedrückt werden" kann, Darüber hinaus kommt die Synthese des aktiven hitzebeständigen Enzyms bei normalen mesophilen Temperaturen (ungefähr 20,'«.40 ⁰C) zustande.

Ausführungsbeispiel 6

Isolation von natürlich vorkommenden Plasmiden, die Alpha-Amylase-Gene enthalten.

Unter Anwendung der in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise wurde die gesamte DlTS von den Zellen von B. 3tearo-thermophilus ^r der ATCC-Ur.'31 783 isoliert. Die Plasmid-DSTS wurde von der Gesamt-BitfS vermittelt CsCl-Bthidiumbromid-Ultrazentrifugation nach der Methode von R. Radioff, W. Bauer und J. Vinograd, Proc. Hatl, Acad. Sei«, U.S.A., j57, 1514... 1521 (1967) separiert. Durch die nachstehende Yorgehensweise wurde'gezeigt, daß diese Plasmid-DITS ein Alpha-Amylase-Gen enthält,

Wie in Ausführungsbeispiel 1 wurde die Plasmid-DilS unter Einsatz des Restriktionsenzvms Hind III zerschnitten. Durch Bin-

' führen dieser DiTS in 3. coli (entsprechend den Ausführungsbeispielen 1.. .3) wurden Klone gebildet. Die Analyse des tetrazyklinresistenten Phänotyps zeigte, aa3 3,3 % der Zellen tetrazyklin-sensitiv waren und demzufolge geklonte DIiS

L. ό U / A U Ö _21_ 21.7.1982

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enthielten« Das Screening nach Zellen mit Alpha-Amylaseaktivität zeigte, daß 0,42 % oder etwa 1 von jeweils 8 geklonte DImS enthaltenden Zellen das Amylase-Gen aufwies. Das Zerschneiden der B,-st earothermopb.il us-?lasmide mit Hind III erbringt lineare DHS-Stücke, die sich bei Slektrophorese auf Agarose-Gel in 8 leicht nachweisbare Banden aufteilen* Die Häufigkeit des Klonens des Amylasestückes (1/8) entspricht etwa dem Erwartungswert, da eine der 8 vorherrschenden Banden das Amylase-Gen aufwies« Darüber hinaus zeigt die Analyse dieser Plasmid-Banden, daß eine der Banden etwa 3_}6 Md ist; die gleiche Größe wies jenes geklonte DHS-Stück auf, das bei der Analyse der Plasmide aus Ausfuhrangabeispiel 1 gewonnen wurde.

Dieses Experiment weist eindeutig darauf hin, daß mindestens ein Alpha-Amylase-Gen auf einem natürlich "vorkommenden Plasmid in dem verwendeten Stamm von B.stearothermoOhilus

lokalisiert ist. :

Atis'f ühruhgsbeispiel "-' 7

Präparation und Isolation von S.-coli-Staminen, die unterschiedliche chimärische Plasmide enthalten.

A. Bine Kultur des in Ausführungsbeispiel 3 isolierten ämylaseproduzierenden B«coli - ATCG-Hr. 31 789 - wurde über IJaent in dem in Ausführungsbeispiel 2 verwendeten Medium angebaut. Die Plasmid-DiiS wurde vermittels der Methode nach Clewell, D.3., J. Bacteriology, 110, 667...676 (1972) verstärkt, wobei 170 iUg Chloramphenicol pro ml verwendet wurden« Für die Verstärkung wurde das nachstehende iisdium benutzt:

236 7 40 8 _₂₂_ _21i7._l932

A? C 12 IT/236 740/8 60 256/18

g/Eiter

ITa₂HPO₄	2 H₂O	6,0
SH₂PO₄	7 H₂O	3,0
ITaCl	^B1	0,5
HH₄Cl	1,0
	5,0
	2,0
	0,015
	0,246
Kasein-Aminosäuren	0,001
Glukose
CaCl₂,♦
MgSO₁ .
Vitamin

Die Plasmid-D2TS wurde sodann unter Anwendung der Standard-He inly sat-Met node nach Clewell und Helinski, Biochemistry _9, 4428,..4440 (1970) isoliert. Die isolierten Plasmide wurden vermittels der CsCl-Ethidiunibromid-Methode aus Ausführungsbeispiel 6 und daran anschließend durch Extraktion mit Isopropanol und ausgedehnte Dialyse in 1OmM Iris plus 1 mM EDTA bei pH 7,5 gereinigt.

Eine Kultur von S.coli RSl, PRC 399, welches das 3,9 Md Plasmid pBR325 enthält, wurde angebaut, und die Piasmid-DHS wurde vermittels der in den vorangegangenen Abschnitten beschriebenen Yorgehensweisen verstärkt, isoliert und gereinigt

Plasmid-DiTS der beiden Quellen wurde mit Restriktionsenzym Kind III zerschnitten. Lösungen der zerschnittenen Plasmide wurden vermischt und durch die allgemeine Methode nach Ausfuhr ungsbeispiel 1 bei 0 ⁰C über 18 h hinweg miteinander verknüpft.

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Die verknüpfte DiIS wurde vermittels der in Ausfuhrangabeispiel 2 beschriebenen Methode in S₄ coli RRl transformiert. Die Zellen wurden verdünnt und auf Agarplatten plattiert, welche Chloramphenicol in einer Konzentration von 25 /ig/ml enthielten. Auf diese V/eise wurden nur solche Zellen von B. coli gewonnen, die das Plasmid pBR325 (mit chloramphenikolresistenten Genen) enthielten· Kolonien auftauchender Zellen wurden einem Screening hinsichtlich ihrer Amylaseaktivität unterzogen, hierzu wurde die in Ausführungsbeispiel 3 beschriebene Methode unter Einsatz von D-Zykloserin zum Lasieren der Zellen angewendet.

Die rekombinante Plasmid-DHS von drei Kolonien, welche Amylaseaktivität zeigten und chloramphenikolresistent waren, wurde vermittels des Rein-Lysat-Verfahrens aus Ausführungsbeispiel 4 extrahiert« Die Separation der recombinanten Flasmide auf Agaose-Gelen zeigte, daß diese die richtige Größe für eine Kombination von Plasmid pBR325 plus ein das Amylase-Gen enthaltendes 3,6-üid-Pragment hatten. Die Verdauung de3 Plasmids mit Kind III Enzym ergab ein 3j6-Md-j?ragment und die lineare Form von p3R325. Dieses Beispiel zeigt, daß das Amylase-Gen auf einem unterschiedlichen Vektor - p3R325 - einer Reklonung unterzogen werden kann, ohne dabei seine amylaseerzeugende Aktivität zu verlieren. Der resultierende E.-coli-Starnm ist als ATCC-JIr. 31 792 erhältlich.

3. Das in Teil A. hergestellte chloramphenicol- und ampizillinresistente chimärische Plasmid wurde als Donator .jenes DKS-Fragjnentes verwendet, welches das Alpha-Amylase-Gen enthält. Dieses Fragment wurde unter Anwendung der allgemeinen Vorgehensweise von Teil A mit dem 10-Md-Vektorplasmid pWL625 kombiniert. Das Plasniid p'^:iVL625 wurde von W.Goebel et al., Molec. Gen. Genet., 157, 119...129 (1977) beschrieben. Es

£ O U / *♦ U ° _24- 21.7.1932

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kann vermittels der in Teil Δ dieses Ausführungsbeispieles angewendeten Plasmid-Isolationsmethode aus einer Kultur eines Stammes von E. coli. der ATGC-I¹Tr. 31 737 isoliert werden,'Dieser Vektor überträgt die Resistenz gegenüber den Antibiotika Ampis illin und Kanamysin, Die Insertion von DHS in pWL625 an der Hind-IH-Steile zerstört die KanamysinResistenz,

Zellen von Ξ, coli.RRl, welche mit der recombinant en DNS transformiert worden waren, wurden auf ampizillinhalt igen Agarplatten angebaut, Pur die Analyse wurden jene Kolonien ausgelesen, die gegenüber Ampizillin resistenz waren, infolge von 0BR325 nicht resistent gegenüber Chloramphenikol waren und Amylaseaktivität zeigten. Von den Kolonien wurde Plasmid-DiTS isoliert, Die .Analyse auf Agarose-Gelen vor und nach der Verdauung mit Hind-IIl-Enzym zeigte, daß jenes DBo-Fragment, welches das Arnylase-Genenthält, unter Hervorbringung eines neuen Plasmids auf dem p7/L625-?lasmi& geklont wurde. Der dieses chimärische Plasmid enthaltende B.-coli-Stamm ist als ATGG-Hr. 31 791 erhältlich,

AusführuQgsbeispiel 8

Transformation zweier different er chimärischer Plasniide in einen Stamm von S, coil«

Der in Ausführungsbeispiel 7B hergestellte amylaseerzeugende B.-ooli-otamm wurde angebaut und gemäß Vorgehens7/eise nach Ausführungsbeispiel 2 zur Transfor isation vorbereitet. Das in Ausführungsbeispiel 7A hergestellte gereinigte Plascnid wurde in diese Zellen transformiert. ΐ/uräen die resultierenden Zellen auf.chloramphenikolhaltigen Agarplatten angebaut, so zeigten sämtliche Kolonien Amylaseaktivität, Von einer der Kolonien wurde ?lasrnid-Dii3 isoliert und auf Agarose-

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Gelen analysiert. Ea zeigte sich, daß sowohl das in Ausführungsbeispiel 7A als auch das in Ausführungsbeispiel 73 beschriebene chimärische Plasmid vorhanden war. Dieses Experiment zeigt, daß S. coli gleichzeitig zwei unterschiedliche Alpha-Amylase-Gene enthaltende chimärische Plasmide zum Wachstum bringen und erhalten kann. Die LangzeitStabilität dieser Kombination von Plasmiden ist nicht ermittelt worden, jjer diese zwei chimärischen Plasmide enthaltende Ξ.-coli-Stamrn ist als ATCG-Hr. 31 790 erhältlich.

Ausführungsbeispiel 9

Transformation von Plasmiden, die Alpha-Amylase-Gene und einen Antibiotika-Resistenzmarker enthalten, in einen Stamm von B. sübtilis.

A, Donator-DHS-Herstellung.: Als Donator des das ' Alpha-Amylase-Gen enthaltenden DlTS-Fragmentes wurde das in Auaführungsbeispiel 7B erzeugte chimärische Plasmid verwendet, Ss wurde nach dem Rein-Lysat-Verfahren nach Clewell und Helinski, Biochemistry, 9, 442S...4440 (1970) extrahiert. Diese Plasmid-iMs 7/ura.e mit dem Restriktionsenzym Hind III zerschnitten« Das Yerdauungsprodukt wurde mit einer kleinen Menge Ethidiumbromid vermischt und unter Anv/endung der Saccharose-Gradientmethode nach 31-Gewely und Helling, iinal. Biochem., 102, 423...42S (1980) separiert. Das das Alpha-Äßivlase-Gen"enthaltende 3,6-Md-Pragment wurde zweimal mit η-Butylaikohol extrahiert, mit einem gleichen Volumen Isopropylalkohol ausgefällt, bei pH 7,5 in 10 aüi Tris plus 1 eü 3DTA suspendiert und bis zur Verwendung bei -20 ⁰G gehalten.

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B, Vekt or~Präparation; äin vom Bacillus Genetic Stock Center, Dept« of Microbiology, Ohio State University, Columbus, Ohio bezogener und mit der Stamm-Br. 1817 versehener B,-sübtilia-Stamm, welcher das 2,0-Md-Plasmid pC194 enthält, welches seinerseits ein die Ghloramphenikol-Resistenz übertragendes Gen enthält, wurde streifenweise auf einer Platte angelegt, die tryptischen Soja-Ager (erhältlich von der Pa, Difco Laboratories, Detroit, Michigan - im folgenden als Difco abgekürzt) und 50/ig/ml Chloramphenikol enthielt. Sodann wurden die Zellen in 150 al Penassay-Bouillon (Difco) in einem 1-Liter-Kolben inokuliert und über lacht bei 37 ⁰C unter Schütteln angebaut. Die Zellen wurden pelletiert und in 10 ml Protoplast-Puffer (25 % Saccharose, 0,1 M UaGl--0,05 M -Tris.HCl bei pH 7,5 und 0,05 M EDTA bei pH 8,13) resuspendiert. Über 30 min hinweg wurden bei 37 ⁰C 5 mg EiweiS-Lysozyni .(Sigma Chemical Company) zugesetzt. Sodann wurden 13 ml 2 %iges iiatriumdodezylsulfat in 0,7 M ilaCl sowie danach 2,4 ml 5MiJaCl vorsichtig beigemischt. Die Mischung wurde in Siswasser abgekühlt und bei 12 100 χ g 20 tain lang zentrifugiert.

Die DNS wurde mit einem gleichen Volumen Isopropylalkohol ausgefällt. Der Peststoff wurde 60 h lang in Siswasser aufbewahrt, bevor er mittels Sentrifugation gesammelt und in einer Lösung aus 0,01 M Tris-Hydrochlorid und. 0,001 M EDTA bei pH 7,5 suspendiert wurde. Die Abscheidung der Piasmid-DHS erfolgte unter Anwendung der CsCl-Sthidiuinbromid-ültrazentrifugation nach der Methode von Radioff et al., Proc. iJatl, Acad. Sei,, ü.S.A,, 57, 1514. ..1521 (1967). Das 2-Md-Plasmid wurde durch Extraktion mit Isopropylalkohol und ausgedehnte Dialyse in 10 aM 'Iris plus 1mM SDTA bei pH 7,5 behandelt.

J υ / H U Ö __2T- 21.7.1982

AP C 12 M/236 740/3 60 256/18

C, Herstellung des chimärischen Plasmids: Der 2-Md-Vektor aus Teil B wurde mit dem Hind-III-Restriktionsenzvm zerschnitten und mit dem 3,6-Md-Prägment aus Teil A vermischt. Die Konzentrationen der Vektor- bzw, Donator-DUS's betrugen 6 bzw, 17 ^ug/ml. Die Ligation erfolgte unter Anwendung des allgemeinen Verfahrens aus Ausführungsbeispiel 1, Das Fehlen jeglichen linearen 3,6-Md-Fragmentes nach der Ligation, das sich mittels Agarose-Gel-Elektrophorese zeigte, weist darauf hin, daß die Ligation vollständig erfolgt war,

D, Transformation des chimärischen Plasmids in B. subtilis: Sine kein Amvlase-Gen enthaltende B.-aübtilja-KuItur (ATCC-ITr. 31 735) wurde über Sacht auf einer Platte angebaut, welche Tryptose Blut Agar-Base (Difco) und 1 % lösliche Stärke enthielt. Der Platte wurden 2 ml des nachstehenden Nährmediums zugesetzt:

Prozent

(HH₄O₂SO₄ 0,2

K₂HPO₄ 1,4

KH₂P0_A 0,6

liatriumzitrat.2 H₂O 0,1

MgSO₄.7 H₂O 0,12 '

Glukose 0,5 Kaseinaminosäuren(Difco) 0,02

L-Tr^ptophan 0,005

Etwa 0,1 ml der so gewonnenen 2ellsuspension wurden zu 10 ml des gleichen Mediums in einem 250-oil-Kolben hinzugegeben und 4h lang bei 37 ⁰C inter kräftigem Umrühren inkubiert. Sodann wurde 1 ml der Kultur bei 37 ⁰C zu 9 ml vorgewärmten Transformal ionsmedium hinzugegeben, worauf die Inkubation unter Schütteln für 90 min fortgesetzt wurde. Das Transformat ions-

O _₂₈_ 21.7.1982.

AP C 12 U/236 740/8 60 256/18

medium hatte die gleiche ZusammenSetzung wie das Wachstumsmedium, außer daß es 0,01 % Kasaminisäuren und 0,0005 % L-Tryptophan enthielt. Zu 0,25 ml Zellsuspension mit einem

Gehalt von etwa 1 χ 10 Zellen/ml wurden 5/il der Lösung des chimärischen Plassids aus Teil C hinzugegeben, welche 0,12yug des Piasini ds enthielt. Das Gemisch wurde 30 min lang bei 37 G vorsichtig geschüttelt. Sodann wurde die Mischung mit einem gleichen Volumen Penassay-Bouillon (Difco) verdünnt, und das Schütteln wurde bei 37 ⁰C über weitere 90 min hinweg fortgesetzt. Zellen, 0,1 ml Aliquote, wurden auf Platten verteilt, welche Tryptose-Blut-Agarbase (Difco), 1 % lösliche Stärke und 20/ug/ml Ghloranrphenikol enthielten. Zur Kontrolle wurden auf dem gleichen Medium B.-subtilis-Zellen ohne zugesetztes Plasmid sowie 3«-subtilis-Zellen mit dem Vektorplasmid pG194 plattiert.'

Auf den Platten, auf denen die Zellen kein zugesetztes Plasmid enthielten, waren keine Kolonien zu sehen» Auf den Platten, auf denen die Zellen das Plasoiid pC194 enthielten, waren drei Kolonien zu sehen, keine dieser Kolonien indes zeigte Amvlasesktivität.

Sine Kolonien war auf jenen Platten zu beobachten, die mit Zellen versehen waren, welche die DiTS des chimärischen Plasmids aus Teil C enthielten. Diese Kolonie ergab bei Ioddampf-Exposition eine helle Zone, woraus hervorgeht, daß durch diese Zellen estrazelluläres Amyläseenzym erzeugt worden war. Die Zellen scheinen zur Stabilität der Anwesenheit von Ghl0rampheniköl zu bedürfen. Diese Kultur ist unter der ATQC-Ur. 31 786 erhältlich..

236740 8

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Eine Probe der DFS von der amylasehalt igen Kolonie wurde vermittels Agarosegel-Blektrophorese separiert. Dabei wurde ein Plasmid-Band von etwa 5,6 Md beobachtet. Dies entspricht der Größe des chimärischen Plasniids von Teil G.

Das gereinigte chimärische Plasmid wurde mit Hind-III-Restriktionsenzym zerschnitten und einer Agarosegel-Slektrophorese unterzogen. Dabei wurden zwei Fragmente von etwa 2,0 Md und 3,6 Md gewonnen. Diese entsprechen den Größen der Donator-DiJS-von Teil A und der Vektor-DUS von Teil B.

E. Transformation des chimärischen Plasmids in einen zweiten Stamm von B.subtilis

Das das Amylase-Gen enthaltende chimärische Plasmid wurde aus den Zellen der amylaseproduzierenden Kolonie, von Teil D mit Hilfe jener Vorgehensweise isoliert, die zur Isolation des pC194-Plasmids in Teil 3 benutzt worden war. Das isolierte chimärische Plasmid wurde in einen anderen aüiyläsenegative'n Stamm von B. subtilis transformiert, der als Stamm Hr. 1A289 vom Bacillü.3 Genetic" Stock Genter, Dept, of Microbiology, Ohio State University, Columbus, Ohio, erhältlich ist. Die Transformation erfolgte unter Anwendung der Protoplsst-Fusionsmethode nach S. Chang und 8.IT. Cohen, Molec- Gen. Genet., VI8, 111..,115 (1979). Wurden die Zellen wie in Teil D auf Plätten angebaut, dann waren auf den nicht chlorampheni-

kolhaltigen Platten etwa 1 χ 10 Kolonien/ml zu sehen. Auf den chloramphenikolhaltigen Platten waren etwa 1 χ 10 Kolonien/ml zu beobachten. Alle dieser Kolonien zeigten im Stärke-lod-Test das Vorhandensein von Amyläse. Dieser amylasehaltige B, subtilis ist unter der ATGC-Ir. 31 734 erhältlich.

236 7 40 8 _₃₀. _2li7.₁₉₈₂

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Ausführung be J3piel 10

Hitzebeständigkeit aer Alpha-Amylase, die durch das das chimärische Plasmid enthaltende B ♦ subtilis erzeugt wurde. Das B. 3übt ills, welches das chimärische Plasmid aus Ausführungsbeispiel 9Ξ - ATCG-Ir. 31 734 - enthält, wurde in einein Liter Medium in einem 2,8-1-Fernbachkolben angebaut, wobei das nachstehende Medium eingesetzt wurde:

Prozent

Maisstärke	9,0
Maiseinweichflüssigkeit	6,0
Hefe-Autosvlat ^x'	0,35
(ΗΗ_Λ)₂ΗΡΟ₄	1,0
SH₂PO₄	0,1
CaCl₂i2 H₂O	0,06
MnCl₂.4 H₂O	0,05
Maisöl	1,0
Termamvl	(0,05 3/ml)

154, erhältlich bei Amber Laboratories, JuneaUy Wisconsin.

Das Medium wurde 30 min lang bei 121 ⁰G im Autoklaven behandelt - dies zerstört die Termamylaktivität - und daran anschließend auf Zimmertemperatur abgekühlt. Sodana wurden dem Medium vor der Inokulation mit den Zellen 0,01 mg Chloramphenikol pro ml zugesetzt. Die Bouillon wurde zentrifugiert, der Hitzebeständigkeitstest wurde an einer verdünnten

236 7 40 8 _₃₁_

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Probe der überstehenden Flüssigkeit vorgenommen, wobei die allgemeine Vorgehensweise von Ausführungsbeiapiel 5 angewendet wurde. Zum Vergleich wurde die Hitzebeständigkeit von Anblasen von B. stearothermophilus und 3, aubtilis wie· auch von kommerziellem Termamyl in einem 50 mM iJatriumazetat und 2,5 mM GaGl₂ enthaltenden Medium ebenfalls gemessen, (Dies waren die gleichen Vergleichsamvlasen, wie sie auch in Ausführ ungabe !spiel 5 verwendet wurden). Die Prüfergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt.

Tabelle II werte der Hitzebeständigkeit

Anfangs- Aktivität % aktivität,nach 45 min, verbleibende

90 ⁰G, Aktivität Snzvmprobe a/ml S/ml

B. stearothermophilus 1,81 1,16 64

B. sübtilis 1,34 0 0

Termamvl 1,26 0,79 63

Enzym von ATCG-Iu-. 31 784 1,58 1,07 68

In diesem Test erweist sich die durch den B.-subtilis-Klon der ATCC-ITr. 31 784 erzeugte Anrylase als zumindest ebenso hitzebeständig wie das vom Donator B.stearothermophilus erzeugte Bnzvm. Ss ist hinsichtlich seiner Hitzebeständigkeit der technischen hitzebeständigen Alpha-Amylase - Termamvl vergleichbar, und es übertrifft eindeutig die Hitzebeständig keit der Alpha-Amyläse von 3, 3übtilis«

236740 8

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A? G 12 IT/236 740/0 60 256/18

Somit wird, offenbar, daß erfindungsgemäß ein Verfahren geschaffen worden ist, mit dessen Hilfe es möglich ist, chimärische Plasmide herzustellen, die ein ein hitzebeständiges. Alpha-Amylase-Enzvm codierendes Gen enthalten, wobei diese Plasmide dazu verwendet werden können, eine hitzebeständige Alpha-Ainylase zu erzeugen,, die den oben genannten Merkmalen, Zielstellungen und Vorteilen in voll befriedigender W_eise entspricht. Da die Erfindung im Zusammenhang mit spezifischen Verkörperungen ihrer selbst beschrieben worden ist, ergibt sich daraus, daß'dem Fachmann angesichts der vorangegangenen Beschreibung eine Vielzahl von Alternativen, Modifikationen lind Variationen möglich sein werden. Alle diese alternativen Lösungen, Modifikationen und Variationen können einbezogen werden, ohne daß dabei von dem in den nachfolgenden Ansprüchen erhobenen Schiit ζ umfang und Grundgedanken der Erfindung abgewichen wird.

Claims

Erfindungsanspruch

1. Verfahren zum Aufbau eines Chimären Plasmids mit einer Genkodierung für eine thermostabile Alpha-Amylase, wobei

a)eine Donator DiIS zerschnitten wird, um eine lineare DUS-Sequenz zu erhalten, die ein eine Alpha-Amylase kodierendes Gen enthält;

b) ein geeigneter Vektor zerschnitten wird, um eine zweite lineare DHS-Sequenz zu gewinnen und

c) die linearen DHS-Sequenzen der Schritte (a) und (b) verbunden werden;

gekennzeichnet dadurch,' daß die Donator-üNS 1, ein natürlich vorkommendes Plasmid ist, das eine Genkodierung für eine thermostabile Alnha-Amyläse enthält oder2. ein anderes chimärisches Plasmid ist, das ein DHS-Fragment mit einer Genkodierung für eine thermostabile Alpha-Amylaae enthält, wobei das DUS-Fragment aus dem natürlich vorkommenden Piasaid gewonnen wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Vektor ein Plasmid ist, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus E, coli-Plasmiden, pBB322, pBR325 und pWL625 und 3, subtilis-Plasmid pC194 besteht,

3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das natürlich vorkommende Plasmid von einem B.stearothermophilus-Starrun abgeleitet wird.

236 7 40 8 «

4« TerfaJaren nach Punkt 3, gekennzeichnet; dadurch, daß der B+stearothermophilus-Stamm aus der Gruppe, ausgewählt wird, die aus B,stearothermophilus,. A£C,C.-ffuinmern 31, 195; 31, 196; 31, 197; 31, 198; 31, 199 und 31, 783 sowie aus deren Varianten und Mutanten und Subimrtanten der Mutanten zusammensetzt·

-%- 4,11.1982

AP C 12 H/236 740/S 60 256/18

5. "Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Zerschneiden mittels der Restriktionsendonuklease, Hind III, erfolgt und das Verbinden durch TJHS-Ligase realisiert wird,

6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das aufgebaute chimärische Piasaid in einen geeigneten Mikroorganismus eingeführt wird, der Mikroorganismus in einem geeigneten Medium gezüchtet vvird und die vom ·Mikroorganismus erzeugte Alpha-Amylase isoliert wird.