DD210991A1

DD210991A1 - Indikatorsystem zur quantitativen bestimmung von askorbinsaeure neben glukose

Info

Publication number: DD210991A1
Application number: DD24127482A
Authority: DD
Inventors: Peter Mohr; Thomas Hanke; Bernd Ebert; Erwin Kahrig; Karl-Heinz Kallies; Dieter Plaschnick
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1982-07-01
Filing date: 1982-07-01
Publication date: 1984-06-27

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Indikatorsystem zur quantitativen Bestimmung von Askorbinsaeure neben Glukose in Teststreifen. Dieses Indikatorsystem enthaelt erfindungsgemaess einen Semichinonimin-Farbstoff der allgemeinen Formel I, wobei R = H oder ein Alkyl-, Aryl-, Alkoxy- bzw. Phenoxy-Rest bedeutet, sowie eines der im WP G 01 N/236500/4beschriebenen Fixiermittel. Der Farbstoffe I und d. Fixiermittel werden in einem Bindemittel (z.B. Galatine) oder einem Vliesmaterial (z.B. Papier) eingebracht und auf eine inerte Unterlage aufgetragen. Zur gleichzeitigen Bestimmung von Glukose und des Askorbatfehlers wird auf einen Teststreifen a) das Indikatorsystem zur Bestimmung von Askorbinsaeure und b) das Indikatorsystem nach WP G 01 N/236500/4 zur Bestimmung von Glukose unmittelbar nebeneinander angeordnet, nach Kontakt m. der Probe erfolgt eine Auswertung ueber eine Eichkurve.

Description

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Prof. Dr. P. Mohr ,

T. Hanke

Dr. B. Ebert

Dr. E. Kahrig

K.-H. Kailies

D. Plaschnick

"Indikatorsystem zur quantitativen Bestimmung von Askorbinsäure neben Glukose"

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Indikatorsystem zur quantitativen Bestimmung von Askorbinsäure neben Glukose in Teststreifen. Eine Anwendung der Erfindung ist vorzugsweise in der Medizin für diagnostische und Kontrollzwecke, aber auch in der Nahrungsgüterwirtschaft, der mikrobiologischen Industrie und der Landwirtschaft möglich.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Für die Bestimmung von Glukose in Harn, Blut, Serum, Plasma, aber auch Glukose enthaltenden Lösungen anderen Ursprungs sind in den vergangenen Jahren verschiedene enzymatisch« nachweisverfahren als Küvettentests (Meyer-Bertenrath: Enzymdiagnostik, Theorie und Praxis enzymatischer Analysen; Die Medizinische Verlagsgesellschaft j Marburg/Lahn 1976) oder Streifentests (H. Haeckel: Rationalisierung des medizinischen Laboratoriums, GIT-Verlag; Darmstadt, 1979) entwickelt und in die Praxis eingeführt worden. Bei vielen dieser Systeme erfolgt die Glukosebestimmung Über eine Farbbildung, wobei die erzielte Farbintensität mit der Glukosekonzentration in der Probenlösung korreliert. Allen diesen Tests 1st gemeinsam, daß zunächst gemäß Reaktion (1) Glukose mit O₂ unter dem Einfluß des Enzyms Glukoseoxidase zu Glukonolakton und HgO₂ reagiert. Letzteres wird genutzt, um in einer durch das Enzym Peroxidase katalysierten Reaktion (2) eine chromogene Verbindung in einen Farbstoff umzuwandeln:

-UÜL1982*O198,M

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Glukose + O₂ „ Glukonolakton + H₂O₂ (1) H₂O₂ + Chromogen Farbstoff (2)

Als effektives Chromogen wurden z. B. o-Tolidin (nach WP G 01 N/236 500A bildet diese Verbindung unterhalb pH 5 einen radikalischen Farbstoff, der durch Fixiermittel stabilisiert wird)} o-Dianisidin oder Kombinationen von 4-Aminoantipyrin und 3,5-Dichlorphenol bzw. !!,N'Diethylanilin vorgeschlagen. Bei letzteren erfolgt in Reaktion (2) eine oxidative Verknüpfung beider Komponenten zur farbgebenden Verbindung. Durch Substanzen wie Askorbinsäure (aber auch reduzierend wirkende Arzneimittel oder Fremdstoffmetaboliten) kann der Nachweis gestört werden, wenn diese

(a) ebenfalls mit H₂O₂ reagieren oder

(b) den gebildeten Farbstoff unter Farbänderung bzw. Entfärbung reduzieren.

So ist z. B. bekannt, daß Askorbinsäure mit H₂O₂ reagiert, wobei unterschiedliche Produkte wie Dehydroaskorbinsäure und radikalische Derivate gebildet werden. Die Reaktion läßt sich daher in ihrer Stöchiometrie nicht immer eindeutig beschreiben. Hierdurch aber sind diese Tests mit einem Fehler behaftet, der auch als Askorbatfehler bezeichnet wird und der sich auf die Genauigkeit und Zuverlässigkeit des Testergebnisses selbst dann noch negativ auswirken kann, wenn es sich um eine halbquantitative Bestimmungsmethode handelt. Um diesen Fehler erfassen zu können, hat man insbesondere bei verschiedenen Teststreifen für die Harndiagnostik zusätzlich zu dem für die GlukosebeStimmung vorgesehenen Bereich einen weiteren für den Nachweis von Askorbinsäure und anderen störend wirkenden, reduzierenden Substanzen geeigneten Testbereich aufgebracht (H. Kohl, Laboratoriumsblätter 2χ (1977) 103). Auch hier liegt dem Nachweis wiederum eine Farbreaktion zugrunde, wobei durch reduzierend.ι wirkende Substanzen eine Farbbildung oder -vertiefung, zumeist jedoch eine Farbabnahme

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(ζ. B. partielle Entfärbung von 2,6-Dichlorphenol-indophenol« ,('Tillmann's Reagenz)) bewirkt wird. Oer Grad der Farbänderung korreliert hier mit der in der Probe vorhandenen Menge an reduzierenden Substanzen.

Bei Farbstoffen, die durch oxidative Kupplung gebildet werden, Bind Verbindungen (Farbbildner und Kuppler) empfohlen worden, bei denen die Farbbildung nach Reaktion (2) schneller erfolgt als die Reaktion von Askorbinsäure und anderen reduzierenden Substanzen mit H₂Og (R. H. White-Stevens Clin. Chem. 28, 578 (1982); R. H. White-Stevens and L. R. Stover Clin. Chem. 28, 589 (1982)). Die Farbstoffe selbst sind jedoch nicht reduzierbar.

Nachteilig bei allen diesen Verfahren ist, daß sich die zum Nachweis von Glukose bzw. Askorbinsäure verwendeten Reaktionen grundsätzlich voneinander unterscheiden und damit der ökonomische und technologische Aufwand bei der Herstellung entsprechender Streifen ansteigt. Darüber hinaus muß die Glukosebestimmung und die Ermittlung des Askorbatfehlers, wenn es sich um einen quantitativ auswertbaren Test handelt, bei verschiedenen Wellenlängen vorgenommen werden, woraus zusätzliche Anforderungen an die Auswertetechnik gestellt werden.

Bei schnellreagierenden Farbbildnern und Kupplern handelt es sich zumeist um schwerzugängliche, chemische Substanzen, deren Störanfälligkeit unter den erforderlichen Testbedingungen auch noch nicht hinreichend bekannt ist.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, das Verfahren zur Ermittlung des Askorbatfehlers in Ergänzung zum Glukosenachweis mittels Teststreifen so weiterzuentwickeln, daß für beide Nachweise die gleiche Indikationsreaktion genutzt werden kann und damit bessere Voraussetzungen für eine quantitative Auswertbarkeit gegeben sind.

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Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Testsystem zu entwickeln, das neben der quantitativen Bestimmung von Glukose in Harn, Blut, Plasma, Serum usw. auch eine präzise Erfassung des Askorbatfehlers erlaubt.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß auf eine inerte Unterlage in einem Bindemittel (z. B. Gelatine) oder einem Vliesmaterial (z. B. Papier) ein Biphenylderivat wie z.B. o-Tolidin und eines der in WP G 01 H/236 500/4 beschriebenen Fixiermittel eingebracht werden. Durch Behandeln mit einer H₂Q₂-Losung, die außerdem das Enzym Peroxidase enthält, wird unterhalb pH = 5 gemäß (3) ein Semichinonimin-Farbstoff der Formel I (z. B. Tolidinblau) gebildet, welcher durch das Fixiermittel chemisch stabilisiert und in Abhängigkeit von dessen Struktur durch wäßrige Probenlösungen nicht ausgewaschen werden kann. Der Farbstoff läßt sich in bekannter Weise auch elektrochemisch durch anodische Oxidation von Biphenylderivaten darstellen. Durch Askorbinsäure oder andere im Untersuchungsmaterial vorhandene reduzierende Substanzen erfolgt eine Reduktion des Farbstoffes gemäß (4), wobei die Farbabnahme mit der Größe des Äskorbatfehlers in der Probe korreliert.

T + ZH*

I gefärbt (stabilisiert durch Fixiermittel)

JOL

NH_n

II ungefärbt

wobei R=H oder ein Alkyl-, Aryl-, Alkoxy- bzw. Phenoxyrest sein kann. Der Glukosenachweis selbst kann nach Zusatz der Enzyme Glukoseoxidase und Peroxidase in bekannter Weise nach WP G 01 H/236 500/4 gemäß Reaktion (3) vorgenommen werden.

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Zur gleichzeitigen Ermittlung des Glukosegehaltes einer Probe und des Askorbatfehlers wird die Erfindung zweckmäßigerweise so ausgestaltet, daß auf einem inerten Streifen (z. B. PYC oder Polyester)

(a) eine Schicht aus transparentem oder Vliesmaterial, in der die Verbindung II (z. B. o-Tolidin), das Fixiermittel sowie die Enzyme Glukoseoxidase und Peroxidase eingebracht wurden und unmittelbar daneben

(b) eine Schicht aus gleichem Material, die den gemäß Reaktion (3) gebildeten Farbstoff I und ein Fixiermittel enthalten, angeordnet wird (Abb. 1).

Testbereich (b) enthält nur den stabilisierten Farbstoff, dient der Bestimmung des Askorbatfehlers

inerter

Streifen

(Träger)

Abb. 1

Testbereich (a) ungefärbt: dient der Glukosebestimmung

Prinzip des Teststreifens zur Bestimmung von Glukose unter gleichzeitiger Korrektur des Askorbatfehlers

Testbereich (a) dient der Bestimmung von Glukose, Testbereich (b) der gleichzeitigen Ermittlung des Askorbatfehlers. Die quantitative Auswertung erfolgt für beide Bereiche kolorimetrisch bei gleicher Wellenlänge (bei o-Tolidin z. B. bei 625 mm) unter Verwendung von Eichkurven, die mit Hilfe von Standardlösungen ermittelt werden. Die in der Probe gemessene Glukosekonzentration ist beim Vorhandensein von Aäkorbat oder anderen reduzierenden Substanzen entsprechend zu korrigieren.

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Der Vorteil des erfindungsgemäßen Indikatorsysteme, insbesondere in der beschriebenen Ausführung zur gleichzeitigen Bestimmung von Glukose und des Askorbatfehlers besteht in seiner Zuverlässigkeit (anwendbar für quantitative Bestimmungen) und Einfachheit (Auswertung beider Bereiche bei gleicher Wellenlänge).

Claims

24127 4 Erfindanpaanspruch

1) Indikatorsystem zur quantitativen Bestimmung von Askorbinsäure neben Glukose in Teststreifen, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Semichinonimin-Parbstoff der allgemeinen Formel I

I, wobei R«H oder ein Alkyl-, Aryl-, Alkoxy-

~X" JL bzw. Phenoxy-Rest

sowie ein*
Fixiermittel enthält.

2) Anwendung eines Indikatorsystems nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß Farbstoff I und Fixiermittel in einem Bindemittel (z. B. Gelatine) oder einem Vliesmaterial

(z. B. Papier) eingebracht und auf eine inerte Unterlage aufgetragen werden.

3) Anwendung des Indikatorsystems nach Punkt 1 und 2 zur gleichzeitigen Bestimmung von Glukose und des Askorbatfehlers, dadurch gekennzeichnet, daß auf einem Teststreifen a) das Indikatorsystem nach Punkt 1 zur Bestimmung von Askorbinsäure und b) das Indikatorsystem nachWp G 01 N/236 500/4 zur Bestimmung von Glukose unmittelbar nebeneinander angeordnet sind und nach Kontakt mit der Probe eine Auswertung über Eichkurven erfolgt.