DD211808A1 - Gewinnung eines pektinolytischen enzymgemisches mittels traegerfixierter mikroorganismen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung pektinolytischer Enzyme mit traegerfixiertem Myzel von Aspergillus niger in Submerskultur. D. auf diese Weise hergestellte Enzymgemisch laesst sich in der obst- und gemueseverarbeitenden Industrie zur Steigerung der Fruchtsaftausbeuten und zur Mazeration einsetzen. Ziel der Erfindung ist eine Erhoehung der Enzymproduktion bei moeglichst effektiver Nutzung des Fermentationsraumes. Die daraus abgeleitete Aufgabe besteht im Auffinden einer geeigneten Verfahrensweise. Erfindungsgemaess wird in einem herkoemmlichen Ruehrfermentor oder in einem speziellen Spezialfermentor mit einem beweglichen oder fixierten Traeger aus sterilisierbarem Material ein Naehrmedium ueblicher Zusammensetzung mit Sporen des Schimmelpilzes von Aspergillus niger beimpft und submers bei 28 bis 32 Grad C 5 bis 7 Tage kultiviert. Dabei bildet sich auf dem Traeger zu Beginn ein Myzelrasen, der waehrend der Kultivation zu einer kompakten zusammenhaengenden Biomasse auswaechst. Bei Austausch des enzymhaltigen Naehrmediums durch frisches Naehrmedium kann das Myzel fuer mehrere Fermentationsansaetze verwendet werden.

Description

Erfinder: Christine Wardsack Bernhard Pardemann . Dipl.-Ing. Erhard Schiweck Dr. Andreas Leuchtenberger Dipl.-Ing. Dieter Körner Dr. Heino Hermersdörfer Prof. Dr. Heinz Ruttloff

Gewinnung eines pektinoIytischen Enzymgemisches mittels trägerfisierter Mikroorganismen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren aur fereentativen Gewinnung pektinolytischer Enzyme mit Aspergillus niger. Die enzymhaltige Kulturlösung wird nach entsprechender Konzentrierung und Reinigung vorrangig aur Mazeration von Obst und Gemüse eingesetzt. Sie ist desweiteren zur Steigerung der Fruchtsaftausbeute geeignet.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die submerse Herstellung pektinoIytischer Enzyme erfolgt nach bekannten Verfahren vorwiegend unter Verwendung von Schimmelpilzkulturen mit diffusem Myzelwachstum. Da bei dieser Myzelstruktur die Enzymsynthese relativ gering ist, gibt es verschiedenartige Bemühungen, durch Zugabe spezieller Mhrmedienbestandteilen sowie durch Variation der Kulturführung die Snzyoproduktion zu erhöhen. So sind Verfahren bekannt, bei denen durch Zugabe von Aluminiumsalzen (SU—US 501 055)} organischen Komplexbildnerη (SU-US 696 051) bzw. MyzelautoIysäten eine Steigerung er-

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wirkt wird. Bei einem anderen Verfahren (Hü—PS 160 532) zeigen·Kobalt- und Magnesium-Salze eine besondere Wirkung, während nach einer weiteren Verfahrensweise (Pl-PS 91 984) durch Variation der Rührergeschwindigkeit die Enzymsynthese angeregt wird.

Sehr selten sind Literatur- und Patentangaben, die sich mit der Bildung pektinolytischer Enzyme bei Vorliegen von kompakteren Myze!strukturen befassen. A.A. Martakov und O.P. Dianova (Izv. Akad. Nauk Xaz. SSR, Ser. Biol. 5 0967) 6, 54-99) berichten, daß mit schwammartigem Myzel eine wesentlich höhere Bildung pektinolytischer Enzyme erreicht wird als mit diffusem. Nachteilig für die im Labormaßstab praktizierte Verfahrensweise ist, daß zum Zwecke der Enzymbildung die in Standkultur angezüchtete Myzeldecke in kreisende Bewegung versetzt werden muß, was technisch schwer realisierbar ist. Eine für die technische Dimension geeignetere Verfahrensweise wird von F. Baum, A.. Leuchtenberger, H. Ruttloff, E. Schiweck und Ch. Wardsack (DWP 145 027) angegeben.. Nach Anzucht einer Myzeldecke von Aspergillus niger in einem Spezialfermentor mit großer Oberfläche wird diese mittels einer Siebplatte untergetaucht und 5 bis 7 Tage belüftet. Ss entsteht eine schwammartige Myze!struktur, die gegenüber Diffusmyzel zu einer deutlich höheren Enzymsynthese befähigt ist. Der Nachteil dieses Verfahrens besteht in der durch den Fermentordurchmesser bedingten begrenzten Myzeldeckengröße. Zur Erzielung einer guten Enzymaktivität ist die Einhaltung eines bestimmten Verhältnisses zwischen Myzelmasse und Kulturflüssigkeit erforderlich, woraus eine relativ schlechte Ausnutzung des Permentorräumes resultiert. Eine verbesserte Variante der Fermentation mit kompaktem Myzel,· die nicht an einen Spezialfermentor gebunden ist, wird von Ch. Wardsack, A. Leuchtenberger, F. Baum und H. Ruttloff vorgeschlagen. Danach wird in einer 1 * Kulturstufe diffuses Myzel von Aspergillus niger in Submerskuitur angezüchtet und dieses dann in einem oder mehreren Behältnissen aus sterilisierbarem Textil- oder Drahtgewebe bestimmter Durchlässigkeit von der Kulturlösung abgetrennt, wodurch es

zwangsweise zu einer für die Pektinasebildung vorteilhaften Verdichtung des Myzels kommt. Einer oder mehrere dieser myzelhaItigeη Behältnisse werden zum Zwecke der Enzymproduktion in einer 2. Kulturstufe unter Verwendung von Kulturmedien üblicher Zusammensetzung kultiviert. Der Vorteil gegenüber dem vorherigen Verfahren besteht darin, daß durch Ablassen des enzymhaltigen und durch Zugabe von frischem Kulturmedium das Myzel für mehrere Fermentationen genutzt werden kann. Nachteilig bei dieser Variante ist die beschränkte Behältergröße und die daraus resultierende relativ geringe Oberfläche sowie die technisch etwas korn« plizierte Reinigung und Neubefüllung der Behältnisse.

Das Prinzip der Trägerfisierung von Mikroorganismen zum Zwecke der Enzymgewinnung bzw. zur Durchführung von enzymatischen Reaktionen ist aus dem Schrifttum bekannt. Nach der Art der Immobilisierung unterscheidet man dabei zwischen Adsorptions«, Bindungs- und Sinschließverfahren. Aus japanischen Patentschriften sind Verfahren bekannt, nach denen verschiedene Enzyme, wie Urease, Invertase und Glucoseosidase (J 262 9693) sowie Glucoseisomerase (GB 1 443 269) mit trägerfisierten Mikroorganismen produziert werden bzw. mit diesen verschiedene enaymatische Utnwandlungsreakticnen durchgeführt werden. Ohne Nennung spezieller Enzyme werden nach einem Verfahren von Divies (DE-OS 2 633 0?6) mittels Mikroorganismen, die in eine Polymerisatschicht eingeschlossen sind, verschiedene Umwandlungsreaktionen durchgeführt. Mit Euitivationsformen von immobilisierten Mikroorganismen, die durch Adsorption an Träger gebunden sind, befaßt sich ein von W. Engelbart, und F. Engelbart beschriebenes Verfahren (DWP 108 322). Eine zur Abwasserbehandlung verwendete Prinziplösung mit trägerfisierten Mikroorganismen ist von B, Atkinson, G-.M. Black, A. Pinches und P.J,S. Lewis (DE-OS 2 845 552) bekannt. Es handelt sich um eine Vorrichtung, bei der in einem Reaktionsgefäß für die Anhaftung des biologischen Materials ein Träger installiert ist. Angaben über die Gewinnung pektineIytischer Enzyme mittels träger-

fixierter Mikroorganismen liegen "bisher nicht vor.

Als wesentlichste Mängel der bisher bekannten Verfahrensvarianten zur Gewinnung pektinolytischer Enzyme erweisen sich die zu geringe Aktivität, die einmalige Verwendung der Biomasse bei den Verfahren mit diffusem Myzel im Rührferment or sowie das ungünstige Verhältnis von Biomasse zu Kulturflüssigkeit bei Verwendung kompakter Myzelformen in Rühr- oder Spezialfermentoren«

Ziel der Erfindung

Bs ist das Ziel der Erfindung, durch Immobilisierung von Aspergillus niger an inerte Träger in einem einfachen Permentorsystem eine hohe- Syntheserate pektinolytischer Enzyme zu erreichen. Dabei sollen die vorher angeführten !achteile bekannter Verfahren weitgehend eliminiert und einzelne Vorteile dieser in einem Verfahren möglichst vereint werden.

Darlegung; des Wesens der Erfindung

Das Wesen des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht nun darin, daß auf der Oberfläche eines innerhalb eines 3?ermentors vom Kulturmedium umgebenen freischwebenden oder fixierten inerten Trägers eine kompakte Myzelstruktur mit dem Stamm Aspergillus niger - hinterlegt in der zentralen Stammsammlung der DDR im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie in Jena unter ZILlET 43 692 angezüchtet wird.

Dabei ist von Bedeutung, daß die Oberfläche der kompakten Myzelstruktur gegenüber dem Volumen des Kulturmediums im Hinblick auf eine hohe Enzymausbeute im richtigen Verhältnis steht. Zur Anzucht des Myzelrasens, d. h. dem Auswachsen der Sporen auf dem inerten Material mit poriger Oberfläche sind die folgenden Bedingungen einzuhalten: - Die Konzentration der Sporen im iiährmedium beträgt un-

ρ '*· mittelbar nach Zugabe der Sporensuspension 10" bis Sporen/ml»

- Das Verhältnis der Menge des Nährmediums zur Oberfläche

des inerten Materials beträgt 0,3 bis 10 ml Nährmedium

2 je 1 cm des Trägers.

« Dia Luftzufuhr beträgt 1 bis 3 1 je min bezogen auf 1 Nährmedium. Eine Umwälzung des Nährmediums ist zu ver-~ meiden.

- Die Kultivierung erfolgt bei Temperaturen im Bereich , von 28 bis 32 ⁰C über 2 bis 3 Tage.

Die für den Stoffaustausch erforderliche Bewegung des Mediums kann dadurch erreicht werden, daß sich der Träger durch die eingetragene Luft frei bewegt (Rührfermentor), daß das Medium zwangsweise am Träger vorbeigeführt wird (Spezialfermentor) oder indem der Träger einer routierenden Bewegung ausgesetzt wird (Rührfermentor). Durch Ablassen des enzymhaltigen und durch Zugabe von frischem Nährmedium ist die Biomasse mehrmals verwendbar. Außerdem ist durch die Trägerfisierung bekanntlich auf sehr einfache Weise eine Trennung der enzymhaltigen Kulturlösung von der Biomasse möglich.

Erfindungsgemäß werden zur Herstellung pektineIytiseher Enzyme Schimmelpilze, vorzugsweise der Art Aspergilius niger, vor allem der bereits genannte Stamm verwendet, Zu Beginn werden in einem herkömmlichen Rühr- oder in einem Spezialfermentor unter Verwendung eines Nährmediums üblicher Zusammensetzung Sporen des Stammes an einem freischwebenden oder fixierten Träger aus hitzebeständigem Material sum Wachsen gebracht. Dabei wird unter schonender Belüftung bei 28 bis 32 ⁰C über 2 bis 3 Tage ein zusammenhängender Myzelrasen angezüchtet, der nachfolgend zum Zwecke der Snaymproduktion innerhalb von 3 bis 5 Tagen in dem Anzuchtoaedium oder in einem Medium anderer Zusammensetzung kultiviert wird.

Das Nährtnedium enthält Salze, Kohlenstoff« und Stickstoff» quellen. Dies sind vorzugsweise Pektin 0,1 - 0,5 % oder pektinhaltige Rohstoffe, wie Zuckerrübenschnitzel·» bzw.

Rübenschnitzele2trakt etwa 4 %, Glukose oder Saccharose 1 - 7 %, Mi₄HO₃ 0,5-1 %, KH₂PO₄ 0,1 - 0,75 % sowie NaCl, CaCO₃ und IeSO₄ 0,01 - 0,1 %.

Der für die Anhaftung des Myzels erforderliche sterilisierbare Träger besteht aus Textil-, Sinter- oder Steingutmaterial sowie,Cr-Ni-»Stahl—Gewebe und besitzt eine poröse oder maschenartige Struktur, Die Größe der Trägeroberflache sowie das Volumen des Nährmediums werden aufeinander abgestimmt, um einerseits bei Inokulation mit Sporenmaterial eine ausreichende Anhaftung von Sporen zu gewährleisten und andererseits eine effektive Enzymsynthese su ermöglichen* Erfindungsgemäß liegt dieses Verhältnis zweckmäßiger Weise im Berei^hvon 0,5 - 10 ml Nährmedium

ο je cm Träger. Die Beimpfung des Nährmediums sollte mit

der jeweiligen Sporensuspension von Aspergillus niger in der Weise erfolgen, daß in dem Nährmedium eine Eonzentra«

2 4 tion von 10 - 10 Sporen/ml erreicht wird»

Da die Bildung von diffusem Myzel zu einem Aktivitätsrückgang führt, sind Belüftung und Bewegung des Mediums gegenseitig so abzustimmen, daß ein möglichst fester Myzelrasen erhalten wird. Die Strömungsgeschwindigkeit des Mediums an der Myzeloberfläche sollte im Bereich von 0,05 - 2 m/s liegen, Die günstige Luftmenge liegt bei 0,01 -. 3 1 Luft je min und je 1 Medium.

Die auf dem Träger angezüchtete Myzelmasse läßt sich für mehrere Fermentationsansätze nutzen, indem nach 3 bis 5 Tagen Fermentationsdauer das enzymhaltige Nährmedium abgelassen und durch frisches Nährmedium ersetzt wird. Ua das Zuwachsen von speziellen Fermentoren durch das Myzel zu verlangsamen, kann nach Ablassen des enzymhaltigen Nährmediums masiaal eine eintägige Unterbrechung erfolgen, in der -die Biomasse unter schwacher Luftzufuhr auf eine dünne Schicht zusammentrocknet. Nach Zuführung von frischer Nähr» lösung kommt es zu erneutem Myze!wachstum und hoher Snzymsynthese.

Nachfolgend wird in einigen Ausführungsbeispielen die Erfindung näher erläutert.

Ausführungsbe i sp ieIe Beispiel 1

In 200 ml Kulturflaschen werden 50 ml Standardmedium (5 % Glukose; 0,1 % Pektin; 0,75 % NH₄NO₃; 0,5 % KE₂PO₄; 0,03 % PeSO₄ . 7H₂O; 0,03 % MgSO₄ . 7H₂O; 0,03 % CaCO₃; 0,03 % NaCl auf 100 ml Aqua dest. , pH 4,5), in das ein 20 cm großer sterilisierter Träger gegeben wird, mit 0,5 ml einer Sporensuspension (ΙΟ-⁷ Sporen/ml) von Aspergillus niger des bezeichneten Stammes beimpft und 5 bis 7 Tage bei 28 bis 32 ⁰C auf einem Rotationsschüttler (220 U/min) geschüttelt. Nach 48 h ist der Träger mit einem Myzelrasen überzogen, der sich bis zum 4, Tag zu einer festen Myzelstruktur ausbildet. Nach 6 bis 7 Tagen ist eine Enzymaktivität von ca. 400 bis 450 PG~E/ml nachweisbar. Etwa 10 PG-E/ml werden vergleichsweise mit diffusem Myzel des gleichen Stammes erreicht. Die Enzymaktivität wird mittels viskosimetrischer Meßmethode bestimmt (DWP 145 027).

Beispiel 2

15ΟΟ ml Standardmedium werden nach Zugabe eines 800 bis

2 1000 cm großen testilen Trägers in einem 2 1 Glasfermentor mit 15 nil Sporensuspension (ΙΟ-⁵ Sporen/ml) von Aspergillus niger des bezeichneten Stammes beimpft und 24 h bei 30 C und einer Luftzufuhr von 2 bis 3 l/min kultiviert. Zur besseren Entwicklung eines geschlossenen Myzeirasens wird die Luftzugabe für etwa 1 bis 2 Tage auf 1 l/min reduziert und danach wieder auf die anfänglichen Werte gesteigert. Nach 6 Tagen erzielt man eine. Enzymaktivität von ca. 140 PG-E/ml.

Beispiel 3

In einem 30 1 Glasfermentor wird ein textiler Träger fisiert, dessen Oberfläche 3000 cm beträgt. Nach Zugabe

von 15 1 Standardmedium wird mit I50 ml Sporensuspension (1Cr Sporen/ml) von Aspergillus niger beimpft und bei bis 32 ⁰C mit einer Luftzufuhr von 30 l/min kultiviert. Nach'Anhaftung der Sporen (etwa nach 12 h) wird die Luftzufuhr zur besseren Ausbildung der %ze!struktur für 48 h unterbrochen. Danach wird die Belüftung wieder auf 10 bis 20 l/min erhöht. Es wird eine Enzymaktivität von 60 bis 100 PG-E/ml unter diesen Bedingungen erhalten.

Beispiel 4

In einem 2 1 Spezialfermentor (Glasrohr mit den Maßen: 0 70 mm, Höhe 700 mm) wird eine Trägerplatte aus nichtrostendem Stahlgewebe (65 Esa 2 350 mm) fest installiert

(Oberfläche 460 cm ). Der Fermentor wird mit 2 1 Standardmedium gefüllt und mit einer solchen Sporenmenge beimpft, daß ein Titer von 10-^ Sporen/ml Kulturlösung eingestellt ist. Die Kultivation erfolgt bei 28 bis 32 ⁰C .... mit einer Luftzufuhr von 1 bis 3 1 Luft/min. Die Belüftung bzw. die Bewegung der Kulturlösung erfolgt^: nach dem Mammutpumpenprinzip· Nach 48 h hat sich eine starke, stabile Myzeldecke am Gewebe ausgebildet. Die Abtrennung der enzymhaltigen Kulturlösung erfolgt nach 6 Tagen mit einer Aktivität von I50 bis 200 PG-S/ml, Bei der Zuführung von frischem Medium werden nach 6 Tagen vergleichbare Aktivitätsausbeuten erzielt. Der Medienwechsel kann bis zu 5®al mit dem gleichen Ausbeuteergebnis durchgeführt werden.

Beispiel 5

In einem 50 1 Spezialfermentor (0 25O mm, Höhe 1000 mm) wird ein Trägerzylinder aus nichtrostendem Stahlgewebe (0 150 mm, Höhe 700 mm) mit einer Oberfläche von 6600 cm" fest installiert. Der Fermentor- wird mit 50 1 Standardmedium Sefüllt und mit 500 ml· Sporensuspension mit IQ-⁷ Sporen/ml beimpft. Zur Anzucht des Myzelrasens wird der Permentor zunächst nur belüftet (5 1 Luft/min). Uach

2 Tagen beginnt die Zwangsumwälzung des Mediums. Die tivation erfolgt; bei 28- bis 32 ⁰C mit einer Luftzufuhr von 0,5 1 Luft/min. Die Luftverteilung bzw. das Vorbeiströmen der Kulturlösung am Myzel erfolgt mit Hilfe einer Kreiselpumpe, durch die das Medium am Boden des Fermentors angesaugt und am Kopfteil wieder zugeführt wird. Nach einer Kultivationsdauer von 6 Tagen kann die Kulturlösung mit einer Ausbeute von 100 bis I50 PG—E/ml abgelassen werden. Ein mehrfacher Wechsel des Mediums ist mit gleichen Enzymausbeuten möglich.

Beispiel 6

In einem 2 1 Fermentcr wird an der Rührwelle ein Gewebezylinder (0 50 ram, Höhe I50 mm) aus nichtrostendem Stahlgewebe befestigt. Der Fermentor wird mit 1 ,5 1 Standardmedium gefüllt und mit I5 ml Sporensuspension mit 10-³ Sporen/ml beimpft. Die Kultivationstemperatur beträgt 28 bis 32 ⁰C, die Belüftungsmenge 0,5 bis 1,0 1 Luft/min. Der Gewebezylinder dreht sich in der Kulturlösung mit 200 U/min. Nach 5 bis 7 Tagen kann die Kulturlösung mit einer Enzymausbeute von 100 bis I50 PG-E/ml abgelassen und durch frisches Medium ersetzt werden.

Claims (7)

Brfindungsanspruche

1. Yerfahren zur Gewinnung eines pektinolytischen Enzymgemisches mittels trägerfixierter Mikroorganismen durch submerse Kultivierung eines Schimmelpilzes in gebräuchlichen Rühr- oder in Spezialfermentoren unter Verwendung bekannter Nährmedien dadurch gekennzeichnet, daß die Sporen des einzusetzenden Mikroorganismus auf einem freischwebenden oder stationären Träger aus inertem Material mit poröser oder gewebter Struktur zum Auswachsen gebracht werden, wodurch ein Myzelrasen entsteht, der in dem lährmedium gleicher oder gewünschter Zusammensetzung weiter kultiviert und dadurch zu einer hohen Enzymsynthese angeregt wird.

2. Yerfahren nach Punkt 1 dadurch gekennzeichnet, daß für die Kultivierung der Stamm Aspergillus niger, hinterlegt in der zentralen Stammsaminlung der DDR im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie in Jena unter ZIMST 43 692 verwendet wird»·

3· Yerfahren nach den Punkten 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß zum Auswachsen des Myzelrasens ein Träger aus Textil- oder CrUi-Stahl-Gewebe oder aus Sinter- oder Steingutiiiaterial eingesetzt wird»

4· Yerfahren nach den Punkten 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, daß zur Anzucht des Myzels an den Träger

- die Sporenkonzentration im iahrmedium auf 10 bis

1Cr Sporen pro ml eingestellt wird,

- die Hährmedienmenge 0,5 bis 10 ml je cm" Träger beträgt,

- die Luftzufuhr auf einer Intensität von 1 bis 3 2ß min je 1 Uährmedium erfolgt,

- eine Umwälzung des ITährmediums mittels Rührer oder Pumpen vermieden und

- eine Temperatur von 23 bis 32 ⁰C eingestellt wird.

5· Verfahren nach den Punkten 1 und 4 dadurch gekennzeichnet, daß der Träger oder das Nährmedium bewegt werden.

6. Verfahren nach den Punkten 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, daß die Strömungsgeschwindigkeit des Nährmediums im Permentor 0,05 bis 2 m/sec und die Luftzufuhr 0,01 bis 3 l/min je 1 Medium beträgt.

7. Verfahren nach den Punkten 1 bis 6 dadurch- gekennzeichnet, daß das fixierte Myzel für 3 bis 5 Fermentationsansätze genutzt wird, indem nach 3 bis 5 Tagen Fermen— tationsdauer das enzymhaltige Nährmedium abgelassen und durch frisches Nährmedium ersetzt wird, wobei gegebenenfalls eine Trocknungsphase für das Myzel bis zu 24 Stunden eingeschaltet wird.