DD211809A1 - Verfahren zur herstellung von alpharubicin i sowie seines aglykons - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Alpharubicin I sowie seines Aglykons, d. fuer die Chemoterapie von Tumor-, Virus- und durch Bakterien hervorgerufenen Erkrankungen bei Mensch und Nutztier von potentiellem Nutzen sind. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des neuen Anthracyclin-Antibioticums, Alpharubicin I, seiner Salze sowie seiner hydrolytischen Abbauprodukte unter Verwendung d. Mikroorganismus, ZIMET 43664, der nach Mutagenese aus Populationen der Art Streptomyces violaceus selektiert wurde. Ziel der Erfindung ist die Gewinnung eines Anthracyclin-Antibioticums mit potentiell cancerostatischen Eigenschaften sowie seiner hydrolytischen Abbauprodukte als Ausgangssubstrate fuer Mutasynthese und Halbsynthese, um die Palette derartiger Pharmaca zu erweitern. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass durch aerobe Submersfermentationen des Mikroorganismus ZIMET 43664 in Medien mit geeigneten C-, N-Quellen und Mineralsalzen Alpharubicin I gebildet, mit geeigneten Methoden aus Mycel und Kulturfiltrat isoliert und nachfolgend gereinigt und gegebenenfalls hydrolysiert bzw. in seine Salze uebergefuehrt wird.

Description

Titel der Erfindung

Verfahren zur Herstellung von Alpharubicin I sowie seines Aglykons

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer antibiotisch. wirksamen Substanz sowie deren Derivate, die bei der Chemotherapie von (Tumor-, Virus- und durch Bakterien hervorgerufenen SSrkrankungen bei Mensch und ITutztier von potentiellem Hutzen sind« Insbesondere betrifft die Erfindung die Gewinnung eines Anthracyclin-^jitibioticums, das als Alpharubicin I bezeichnet wird, seiner Salze, sowie seines Aglykons·

Charakteristik der bekannten technischen Lösung

Anthracyclinon-Glykoside (=Anthracycline) stellen antibiotisch wirksam6_._Verbinaungen dar, deren chromophorer Molekülteil ein 7s8,9,10*^Detrahydroteüracsnchinon (5₅12) darstellt, das mit Zuckern, bevorzugt: Amino zuckern verbunden ist (Brockmann, H·, 1963, Fortschr* Ohein· Organ« Naturstoffe, 21, 121)· Mehr als 100 Anthracycline sind bisher bekannt, wovon die Mehrzahl Gemische von schwer voneinander trennbaren üinzelkomponenten darstellen· Zwei Anthracyclin-Antibiotica CDoxorubicin - US-Patent 3 590 028; Daunorubicin - GB-Patent 1 003 383) sind auf Grund ihrer chemotherapeutischen Wirksamkeit gegen akute Leukämien und solide Tumoren des Menschen in klinischer Anwendung· Bin

2UQY1982*O&Qöii

wesentliches Problem bei der krebschemotherapeutischen Anwendung von Anthracyclin-Antibiotica resultiert aus deren allgemeiner, hämatologischer, digestiver und kardialer Toxizität, die eine umfassendere Anwendung in der Tumorchemotherapie einschränkt und z, B. bei Herzkranken zur Kontraindikation führt. Da sich die Herztoxizität der Anthracycline als besonders störend erwiesen hat, werden ständig neue Derivate bereits bekannter Verbindungen hergestellt und hinsichtlich einer verringerten Tosizität untersucht» Bin Nachteil ist, daß zur Gewinnung chemisch modifizierter Anthracyclin-Antibiotica zwar chemische Methoden wie UDotal- und Partialsynthese sowie biochemische Methoden zur enzymatischen Konversion verfügbar sind, deren Anwendung jedoch zu einer unzureichenden Ökonomie der Produktherstellung führt, die eine großtechnische Gewinnung dieser Derivate nicht gestattet. Bei den bisher bekannten mikrobiologischen Herstellungsverfahren für Anthracyclin-Antibiotica werden bevorzugt Gemische chemisch ähnlicher Anthracycline gewonnen, die aus den Mono-, Di-, Trioder Oligosacchariden unterschiedlicher und unter industriellen Bedingungen praktisch nicht trennbarer Aglykone (Anthracyclinone) bestehen. Das bringt Standardisierungsprobleme für das Bndprodukt mit sich, wenn in Abhängigkeit vom Permentationsverlauf Verschiebungen qualitativer und quantitativer Art im Vielkomponenten-Gemisch auftreten·

Anthracyclinon-Glykoside, deren Aglykon dem mycinon zugeordnet werden können, sind bisher lediglich mit Hilfe der Arten Streptomyces purpurascens (Brockmann und ITiemeyer 1968, Ohem. Ber,_? 101, 1371; Brockmann, Waehnelt und Niemeyer 1969, Tetrahedr, Lett., 6, 415)j Streptomyces griaeoruber 4620 (Podojil, Blumauerova et al., 198O> Folia Microbiol·, 2g, 464), Stre-ptomyces violaceus (!fleck, Strauß, Koch, Kramer und Prauser, 1974, Z, AlIg. Mikrobiol·, J4_S 551) auf fermentativem Wege als Gemische oder in einem Palle (Brockmann) als Minorkomponente mit imbekannter chemischer Struktur und chemotherapeutischer Aktivität erhalten worden* Aus den Hhodomycin-Gemischen, die

alphao-Shodomycinon-Glykoside enthalten, wurde bisher lediglich das biologisch inaktive Aglykon aiphap-Hhodomycinon nach Totalhydrolyse isoliert und in seiner Struktur aufgeklärt· Angaben zu den physikochemischen Eigenschaften der alphap-Rhodomycinon-Glykoside sowie zu deren biologischer Wirkung wie antimikrobielle, antivirale, cytostatische, cancerostatische und toxische Wirkung liegen bisher nicht vor»

Ziel der Erfindung

Die Erfindung dient der Herstellung eines neuen Anthracyclin-Antibioticums sowie seines Aglykons wie auch der Salze des Antibioticums, um die aufgeführten Nachteile bisher bekannter Verfahren zu vermeiden und die Palette potentiell cancerostatisch, virostatisch und antimikrobiell wirksamer Anthracycline durch einen "Vertreter, der eine Einzelkomponente darstellt, zu erweitern, sowie um die hydrolytischen Abbauprodukte als Ausgangssubstrat für die Mutasynthese und Halbsynthese neuer Anthracyclin-Antibiotica verwenden zu können«

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technologisches Verfahren anzugeben, das es gestattet, das neue Anthracyclin-Antibioticum Alpharubicin I mit Hilfe eines Mikroorganismus aus leicht zugänglichen und billigen Einsatzstoff en in guten Ausbeuten herzustellen«

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß unter aeroben and, sterilen Kulturbedingungen in eineia flüssigen lTährmedium mit entsprechenden Kohlenstoff-, Stickstoffquellen und Mineralsalzen ein Mikroorganismus oder seine Varianten und Mutanten gezüchtet werden. Der Mikroorganismus, der in dem vorliegenden Verfahren zur Herstellung von Alpharubicin I verwendet wird, wurde durch Mutagenese-

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Selektionsprozesse aus Populationen der Art Streptomyces violaceus (Stamm IMSG? JA 6844) gewonnen und in der ZIMET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Jena-DDE, unter der Nummer ZIMST 43 664 hinterlegt.

Danach gehört der Alpharubicin-I-Bildner, ZIMET 43 664, zur Gattung Streptomyces und entspricht der Diagnose von gtrepto-myces violaceua (Rossi-Doria 1891} Krassilnikov 1941; Waksman 1953) wie sie nach Untersuchung des Neο-Type-Stammes ISP 5082 C=IMCE-I; SIA 656; ATGC 15 888) im »International Streptomyces Project" von Shirling and Gottlieb (Int, J, syst* Bact,, 1^, 497/1969) gegeben wird«

Der Ausgangsstamm TlVHSS? JA 6844 unterscheidet sich von der daraus abgeleiteten Mutante ZIMET 43 664 bezüglich der Anthracyclin-Biosynthese in sowohl qualitativer als auch quantitativer Hinsicht· Während der Ausgangsstamm BIST JA 6844 das in der Patentschrift (DDE-ViP 100 494) beschriebene Anthracyclin-Antibioticum Yiolaznycin zu bilden vermag, "synthetisiert die nach Mutagenese selektierte Mutante ZIMET 43 664 bevorzugt das neue Anthracyclin-Antibioticum Alpharubicin I·

Die Kultivierung des Alpharubicin I-Bildners, ZIMET 43 664, sowie seiner Mutanten und Varianten erfolgt unter aeroben Bedingungen« An Erde lyophil getrocknetes Sporenmaterial des Stammes wird in geeignete Agarnährböden und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Nahrmedien geimpft und das entstehende Mycel wird in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 25 und 37 ⁰G, vorzugsweise bei 28 0, über einen Zeitraum von 2 bis 6 Tagen, vorzugsweise 4 Tagen, bei einer Acidität kultiviert, die zu Beginn des Peraentationsprozesses zwischen pH 6,2 und 7_}0 und am Snde des Prozesses zwischen pH 7_S5 und pH 8,3 liegt. Das Nährmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie aus anorganischen Salzen* Als Kohlenstoffquellen können Stärke, Glukose, Glyzerin, Mannit. Dextrin, Saccharose, Sojaöl'und Sojamehl verwendet werden· AI3 Stick-

stoffquellen eignen sich außer den oben erwähnten stickstoffhaltigen Substraten auch Trockenhefe, Fleischpepton und Casein»

Gute Fermentationsergebnisse können bei Zusatz von Mineralsalzen erzielt werden* Letztere begünstigen den Verlauf der Fermentation je nach dem verwendeten HTährmedium· In komplexen Medien, die verschiedene Mehle enthalten, haben sich Zusätze von Kalziumkarbonat, ITa-Phosphat bzw. Kalium-Phosphat als vorteilhaft erwiesen« Die Fermentation des Alpharubicin I-Bildners, ZIlBT 4-3 664, kann in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Inhalts, im Glasfermenter sowie in V2A-Stahltanks durchgeführt werden·

Die Isolierung des Alpharubicin I wird in der Weise durchgeführt, daß das Antibioticum aus dem KuIturfiltrat mit organischen, mit Wasser nicht oder nur wenig mischbaren, und aus dem Mycel mit organischen, mit Wasser mischbaren und anschließend mit Wasser nicht oder nur wenig mischbaren Lösungsmitteln extrahiert, nach Konzentrieren der Extrakte mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel reextrahiert, durch 3nialiges Waschen des Eeextrakts mit salzsaurem Wasser in die wässrige Phase übergeführt, nach Einstellen des pH-Wertes mittels verdünnter Natronlauge auf pH 7j5 erneut mit einem mit Wasser nicht oder nur wenig mischbaren Lösungsmittel reextrahiert, im Vakuum konzentriert, durch Versetzen mit Petrolether unter Rühren ausgefällt, vom Lösungsmittel durch Filtration befreit, mit Petrolether gewaschen, nachfolgend getrocknet, anschließend in niederen Alkoholen gelöst, vom unlöslichen Rückstand filtriert, mit Hilfe säulenchromatographischer Methoden von Beimengungen befreit, mit niederen Alkoholen eluiert, im Vakuum konzentriert, durch wiederholte Säulenchromatographie und Elution mit niederen Alkoholen weiter gereinigt, auf üblichem Wege konzentriert, in mit Wasser nicht oder nur wenig mischbaren Lösungsmitteln aufgenommen, mit Petrolether gefällt, gewaschen, getrocknet, anschließend in Wasser aufgenommen, filtriert, lyophilisiert, danach in schwach alkalischem Wasser aufgenommen, mit Chloroform extrahiert, mit wasser-

freiem natriumsulfat getrocknet, vom Unlöslichen filtriert, im Vakuum konzentriert, in organisch-wässrigen Lösungsmittel-Gemischen aufgenommen und mit Hilfe der Hochdruckflüssigkeits-Ohromatographie von Begleitkomponenten abgetrennt, danach als Binzelkomponente mit Hilfe- üblicher chromatographischer Methoden angereichert und gereinigt wird·

Alpharubicin I ist eine amorphe, rotbraune Substanz, die sich gut in niederen Alkoholen und mäßig in Chloroform löste In Wasser, Petrolether und Oyclohexan ist das Anthracyclin-Antibioticum nahezu unlöslich· Das Antibioticum besitzt Indi« katoreigenschaften und ist in sauren Lösungen rotgelb, in alkalischen dagegen blauviolett< Alpharubicin I bildet bei der Umsetzung mit der äquivalenten Menge methanolischer Salzsäure in Ohloroform/ESther ein kristallines Hydrochlorid mit einem Up« 181/184 ⁰G· Bas Hydrochlorid ist im Gegensatz zum basischen Antibioticum gut löslich in Wasser, dagegen nahezu unlöslich in Chloroform und Ether· Alpharubicin I bildet bei der Acetylierung mit Acetanhydrid in Pyridin ein gelbes Pentaacetat OogH^JTO^c (M⁺ 753» Massenspektrum),»

Bei Hydrolyse mit verdünnter Säure in der Wärme liefert das Antibioticum Alpharubicin I je ein Mol al^hag-Bhoaomyclnon und Ehodosamin» Durch verschiedene spektroskopische Untersuchungen (U7/7IS-, IE-, MS- und ÜIMR-Spektroskopie) sowie durch vergleichende dünnschichtchromatographische Untersuchungen konnte das Aglykon des Antibioticums Alpharubicin I mit dem alphao-Shodomycinon (Brockmann und Niemeyer 1968, Chem· Ber«, 101, 1341) und die Zuckerkomponente mit Hhodosamin (Brockmannj Spo&ler und Waehnelt, 19^3? Chem* Ber», 2925) identifiziert werden· Auf Grund der chemischen Abbau- und Derivatisierungsreaktionen sowie durch umfassende spektroskopische Untersuchungen (UY/7IS-, IS-, MS-, NMR-Spektroskopie) am intakten Antibioticum gilt es als gesichert, daß es sich bei dem Alpharubicin I um ein in der Literatur bisher nicht beschriebenes Mono-Shodosaminylalpha2-^hodomycinon handelt* (Abb, 1),

Sowohl frische Ferment at ionslösunge η des Alpharubicin-I-Bildners, ZIMET 4-3 664, als auch das aus ihnen isolierte Alpharubicin I besitzen antibiotische Aktivität. Alpharubicin I hemmt bevorzugt das Wachstum von grampositiven Bakterien und Mycobakterien* Gegen Vertreter gramnegativer Bakterien, der Hefen oder filamentösen Pilze entfaltet Alpharubicin I dagegen keine wachstumshemmende Aktivität, '

Bei der Bestimmung der antibakteriellen Wirksamkeit des Alpharubicin I im Vergleich zur entsprechenden Wirksamkeit der klinisch als Xrebschemotherapeutica eingesetzten Anthracyclin-Antibiotica Daunorubicin und Doxorubicin zeigte sich, daß das in Wasser lösliche Alpharubicin I-Hydrochlorid unter standardisierten Bedingungen des Agardiffusionstests gegen den Sporenbildner Bacillus subtilis SG 119 eine um mehr als die Hälfte geringere Hemmwirkung entfaltet.

Im Vergleich zu den cytostatisch und cancerostatisch wirksamen Anthracyclin-Antibiotica Daunorubicin und Doxorubicin zeigt Alpharubicin I-Hydrochlorid qualitativ vergleichbare Wirkungen bezüglich der Wechselwirkung mit der DHA in vitro und dem DHA-Stoffwechsel in der Zelle, die für die cytostatische Wirkung der Anthracyclin-Antibiotica in Mikroorganismen und Säugerzellen sowie für die cancerostatische Aktivität im Tierversuch verantwortlich gemacht werden« Alpharubicin I unterdrückt zudem in selektiver Weise die Vermehrung von DHA-Viren in gramnegativen Bakterien (z„ B. von temperenten Lambda-Phagen in Bscherichia coli G 600) bei Konzentrationen, die nicht gleichzeitig den Stoffwechsel und die Vermehrung der Wirtszellen beeinträchtigen·

Alpharubicin I kann als ein bisher nicht verfügbares Anthracyclin-Antibioticum angesehen werden, dessen biologische Wirkung eine potentielle Anwendung als Chemotherapeuticum gegen Tumor-, Virus- und durch Bakterien hervorgerufene Erkrankungen bei Mensch und Hutstier ermöglichte

Ausführungsbeispiele

Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu erläutern, ohne sie hierauf zu beschränken,»

1e Zwei 500 ml-Steilbrustflaschen enthalten je 80 ml des folgenden Vorzuchtmediums:

Glucose 1,5 %

Sojamehl 1,5 %

Na-Chlorid 0,5 %

Ga-Karbonat 0,1 % '

primäres K-Phosphat 0,03 %

in Leitungswasser

Sterilisation: 35 Min. bei 110 ⁰G* Acidität nach Sterilisation liegt bei pH 6,3» Jede Steilbrustflasche wird mit einer Sporen- oder Uycelsuspension des Alpharubicin I-Bildners ZIMET 43 664 beimpft, welche mit steriler, isotonischer Kochsalzlösung von einer im Reagenzglas auf folgendem Anzucht-Nährboden gezüchteten, 10 bis 14 Tage alten Kultur des Alpharubicin I-Bildners hergestellt wird:

Hafermehl 1,0 %

Haferflocken, gemahlen 1,0 %

Agar-Agar 2,0 %

in Leitungswasser

Sterilisation; 35 Min* bei 120 ⁰G, natursauer· Die beimpften Yorzuchtkultüren werden 48 Std, bei 28 ⁰G auf einem Schüttelgerät mit einer Frequenz von 180 TJ/min bebrütet» 8 ml einer so bebrüteten Yorzuchtkultur dienen zur Beimpfung von 500 ml-Steilbrustflaschen, die je ml des folgenden Produktionsmediums enthalten:

Glucose 3,0 %

Sojamehl 1,0 %

Na-Ghlorid 0,5 %

Ga-Karbonat 0,3 %

in Leitungswasser

Sterilisation: 35 Min· bei 115 ⁰G. Die Acidität beträgt nach Sterilisation pH 6,3· Die Temperatur ??ährend der

Fermentation liegt "bei 28 ⁰O und die Schüttelfrequenz bei 180 U/min,

2· Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß das Produktionsmedium folgende Zusammensetzung hat:

Glukose 3,0 %

Sojamehl 3,0 %

Na-Chlorid 0,3 %

Ca-Karbonat 0,3 %

in Leitungswasser

Sterilisation: 35 Min· bei 115 ⁰G. Die Acidität liegt nach dem Sterilisieren bei pH 6,3«

3· Mit einer Kultur des Alpharubicin I-Bildners von einem festen Nährboden wie in Beispiel 1 beschrieben, beimpft man 80 ml des in Beispiel 1 angeführten flüssigen Yorzucht-Mediums, welches in einer 500 ml-Steilbrustflasche enthalten ist. Man bebrütet 48 Std. bei 28 ⁰C auf einem Schüttelgerät mit einer Schüttelfrequenz von 180 TJ/min« 12 ml der so erhaltenen Kulturbrühe dienen aur Beimpfung von 400 ml des gleichen Yorzucht-Mediums, welches in einem 2 1-Glaskolben enthalten ist. Man bebrütet weitere 24 Std„ bei 28 ⁰O bei einer Schüttelfrequenz von 180 U/min«, ehe die so erhaltenen 400 ml Kulturbrühe zur Beimpfung von 20 1 des im Beispiel 1 beschriebenen Produktions-Mediums dienen. Letzteres ist in einem 32 1-Glasfermenter enthalten» Während der Fermentation, die mit einer Rührgeschwindigkeit von 400 ü/inin· und mit einer Luftzufuhr von 15 l/min* ausgeführt wird, kann die Schaumbildung durch Zusatz kleiner Mengen von Sonnenblumenöl oder anderer, silikonhaltiger Schaumschutzmittel kontrolliert werden*

400 1 auf diese Weise gewonnene Kulturlösung werden mit Salzsäure auf pH 5?0 eingestellt und nach Separieren des Mycels werden 360 1 Kulturfiltrat und 40 kg Mycel erhalten. Durch 3m2Llige3 Ausrüfcren des MyCeis mit Methanol bzw, Ηΰΐ-eaurem Methanol wird ein Methanol-Extrakt gewonnen, der mit NaOH neutralisiert und nachfolgend

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auf üblichem Wege konzentriert wird· Das erhaltene Mvcel«- extrakt konzentrat wird mit Wasser aufgenommen und mit Butanol reextrahiert, der gewonnene Butanolextrakt wird danach im Vakuum konzentriert und mit dem aus dem Kulturfiltrat gewonnenen Butanolextraktkonzentrat vereinigt. Das EuIturfiltrat wird mit Butanol im Verhältnis 3%1 extrahiert und nach dem üblichen Konzentrieren des Extrakts werden die aus lycel und Kulturfiltrat erhaltenen und vereinigten Butanolextraktkonzentrate (je 10 1) 3mal mit HGlsaurem Wasser bei pH 5»5 ausgerührt, die wässrige Phase wird danach mit ITaOH auf pH 7_}5 eingestellt und mit Butanol erschöpfend reextrahiert und konzentriert, so daß nach Zufügen des 3fachen Volumens an Petrolether 80 g Rohprodukt ausgefällt, filtriert, mit Petrolether gewaschen und getrocknet erhalten werden können·

4« 80 g !Rohprodukt werden in Methanol gelöst, vom Unlöslichen wird abfiltriert und das Filtrat wird auf eine Sephadex lH-20-Säule aufgetragen, mit Methanol eluiert und in die biologisch aktiven Eluate I und II sowie in das biologisch inaktive Aglykon-Sluat getrennt. Mit dem Sluat I wird nach Konzentrieren im Vakuum eine 2· Feintrennung auf einer LH-20-Säule angeschlossen, das vom Sluat II und den Aglykonen befreite Eluat I wird konzentriert, mit Butanol aufgenommen, von Methanol durch Destillieren befreit _f mit Petrolether gefällt, abgesaugt, mit Petrolether gewaschen und getrocknet, Anschließend wird das Petroletherfällungsprodukt des Sluats I in Wasser gelöst,· mittels einer G5-Fritte filtriert und nachfolgend als !-Fraktion lyophilisiert» Ss werden auf diese Weise 22 g der I-Fraktion erhalten«

5« 4 g I-Fraktion werden in schwach alkalischem Wasser (ITaHGO ^-Lösung) aufgenommen und mit Chloroform extrahiert, unter Zusatz von Na₂SO^ getrocknet_t filtriert und im Vakuum zur Trockne eingeengt* Bs werden 3,7 S I—Base erhalten* Letztere wird im Slutionsmittal (ChlorofonnZMethanol/Eisessig/Wasser=;SO;i8i7i3) ge-

löst und vom Unlöslichen abfiltriert· Das Piltrat wird auf eine HPLC-Säule aufgetragen, deren Säulenlänge 800 mm, Durchmesser 50 mm beträgt,, Als Trägermaterial dient Kieselgel H und der durch Druckgas erzeugte Druck beträgt 7 bis 8 atü· 50 Bluäte zu je 50 ml werden mit Wasser ausgeschüttelt· Die wässrige Phase wird mit NH^OH neutralisiert und mit Chloroform reextrahiert. Bach Trocknen des Chloroform-Sxtrakts über HaoSO^ und nach Filtrieren werden alle erhaltenen Fraktionen dünnschichtchromatografisch überprüft, die das Alpharubicin I enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum zur Trockne eingeengt· Die Ausbeute an rohem Alpharubicin I beträgt 210 mg· Sine Feinreinigung des Alpharubicin I erfolgt nach Lösen in Methanol und Auftragen der Lösung auf 1 mm-Kieselgel-Dünnschichtplatten und Entwicklung in o. g· Elutionsmittel. Die entstandene Hauptzone auf der DC-Platte wird abgeschabt, aus dem Kieselgel mit Methanol extrahiert und nach Zusatz von mindestens dem 5fachen Volumen einer 5%igen Lösung von HaHGOn wird filtriert und der erhaltene wässrig-alkoholische Extrakt mit Chloroform reextrahiert, mit Ha^SO^ getrocknet, erneut filtriert und zur Trockne eingeengt· Zur Feinstreinigung wird die Heinigungsoperation wiederholt, Die Ausbeute beträgt 30 mg Alpharubicin I·

HO \V^CH3 N

Abb.1

Claims (1)

1. Erfindungsanspruch

   1» Verfahren zur Herstellung von Alpharubicin I sowie seines Aglykone, gekennzeichnet dadurch, daß die Mutante ZIMET 43 664 aus der Art Streptomyces violaceus unter aeroben Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff und Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur zwischen 25 und 37⁰G während eines Zeitraumes von 2 bis 6 Tagen kultiviert wird und das gebildete Anthracyclin-Antibioticum Alpharubicin I sowohl aus dem Mycel als auch aus dem Kulturfiltrat bei einer Acidität zwischen pH 3jO und pH S₉Q mittels üblicher Lösungsmittel extrahiert, nachfolgend mit üblichen Methoden konzentriert, ausgefällt und unter Anwendung der Hochleistungs-Chromatografie gereinigt und als Base gewonnen oder in Salze übergeführt wird«

   2_e Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das gewonnene Alpharubicin I durch Hydrolyse in sein Aglykon umgewandelt wird«

   3* Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der IPermentationsprozeß bei einer Temperatur von 28 ⁰G über einen Zeitraum von 4- Tagen durchgeführt wird.

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