DD213590A5

DD213590A5 - Verfahren zum einfrieren und konservieren von organischem gewebe

Info

Publication number: DD213590A5
Application number: DD83257728A
Authority: DD
Inventors: Joan J Mckenna
Original assignee: Joan J Mckenna
Priority date: 1982-12-10
Filing date: 1983-12-09
Publication date: 1984-09-19
Also published as: EP0127673A4; CS922583A2; RO91902A; PT77795B; WO1984002389A1; RO91902B; NZ206408A; IT1208445B; FI85306C; EP0127673A1; CA1211981A; GR78713B; KR840007023A; ZA838998B; MX168928B; NO843193L; PT77795A; ES8500718A1; IT8349477A0; AU560371B2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren fuer das Einfrieren von organischem Gewebe, bei dem der mit dem Gewebe in Beruehrung stehende atmosphaerische Druck allmaehlich vor oder waehrend des Gefriervorganges gesenkt wird. Die Druckverminderung erfolgt mit einer solchen Geschwindigkeit und bis zu einem solchen Grade, dass ein wesentlicher Anteil des in der Zellfluessigkeit geloesten gasfoermigen Materials an die Atmosphaere abgegeben wird, ohne dass eine nennenswerte Verdunstung der Fluessigkeit selbst stattfindet. Durch die Freisetzung der geloesten Gase kann das Gewebe ohne Beschaedigung der Zellstruktur eingefroren werden, und sie ermoeglicht dadurch eine vollstaendige Wiederherstellung des urspruenglichen Aussehens und der Konsistenz nach dem Auftauen. DD#AP

Description

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Verfahren für das Einfrieren und Konservieren von organischem Gewebe

Anwendungsgebiet der Erfindung;

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für das Einfrieren und Konservieren von Obst, Gemüse, tierischen Stoffen und allgemein vor. organischem Gewebe. Insbesondere betrifft die Erfindung das Einfrieren von Zellmaterial zum Zwecke der Lagerung, Beförderung, langfristigen Konservierung und eine Vielzahl anderer Anwendungsmöglichkeiten, bei denen eine vollständige oder teilweise Unterbrechung der biologischen Aktivität erwünscht ist und die Konservierung oder Retention der Zellstruktur zur vollen Wiedergewinnung des ursprünglichen Zustandes nach Rekonstitution möglich 'ist.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen: Das Einfrieren frischer Pflanzen und von lebenden Tierzellen wird umfassend angewandt, von der Lagerung und dem Transport von Obst und Gemüse für die menschliche Ernährung bis zu Unterbrechung der biologischen Aktivität zur Erleichterung chirurgischer Eingriffe an Geweben oder zur medizinischen oder wissenschaftlichen Beobachtung. Leider können die meisten Zellstrukturen die am Netzwerk der Zellwände durch die Bildung von Eiskristallen verursachten Schaden nicht-aushalten, .weil das vergrößerte Volumen und die scharfen Kanten der Kristalle zu einem Zerschneiden der Zellwände und einem Platzen der Zellen führen. Das Ergebnis ist ein Verlust an Greweboturgor und ein Verlust an natürlichen Säften. Im Falle von Obst und Gemüse mag das Material nach dem Auftauen noch eßbar sein, aber es ist nicht mehr schmackhaft oder attraktiv. Bei Tiersystemen tritt ein ernsthafter Abbruch des Stoffwechsels auf, der häufig zum Tod führt. Außerdem können durch mitgerissene Gase beim Einfrieren gebildete Luftblasen oder Emboli während des Auftauens in den Blutstrom gelangen- Starke Schmerzen und immunologische Unterbrechung können die "Folge sein, und eine Embolie im Herzen oder dem Gehirn kann zum Tode führen.

^:- Bekannte Maßnähmen zür../Lösung dieses, /problems./umfassen im all- ;/! !/gemeinen 'die. teilweise ! :Behydri<3.ruüg_;:^: organischer' Zellen,; um./Platz ;.- /für die mit.,den? .Eiskristallbi^dung' ^verfeund'ene/Ausdehnung zu / ^: ; . y /!schaffen. ;Ein^: typisches·,:Verf;ahre'h.;wird;_:;V9n Lämb in der US-PS ;/ ' XZX'ß .21 9'. 463 X(_:23 ^^ove^et^^^b^^^^ß)-^^'^^ Lärab-Verf ahreri ist ; _: .'der Zwei-Stuf en^Vor galig'v;..de^_:e in hochgrad erfordert.

;i/.: . ' ' ( la'i B''-,zu einem .absoluten; Druck'-i von'.^%\ior:r). Um das Material!

.-!nach dem :Äu;ftauen.. wiede'r/;;braüc^;hbar "^:pü-'. rnäctteii, .muß _; das; aüsgetrie-: V.^bene! Wasser, ersetzt i/werde«./·- ;/:/^.:l· ;. '' ^' /, ..^'.' .'/ 'r ^::; '": '; - , ;· .. ; -A^: _;:ln ^komplizierten oder di^htM/Zeri^:stru;kt:uren ist es.: schwierig, ' :p- auf diese .Weise eirve. gle.ichmäßa-gei Ye/r't ellung' zu erzielen V-. · Außer- ·',' /dem- sind Gewebe mit,_: empfindlicher ;:ZelXs-t'i7.ulc^:tuT oft ,nicht in der ; Ijage ',-.' die -.SpahnungRauszuhalten j'; die; m^.t .e/iher. großen Menge . des , ^; "·; durch die Zeil wände während der. Dehydratisierung: und Rekonstitu- / ^rtl;on Vgehenden. M:_;aterials'yerbu ^.-.l·' ;, ' , . ' · : ':. ..' . ·, ', -^:

: -Ziel der Erfindung :^:/" · ;.':" ...·/ ;";'^; ·'.·. .: '.' ' : . ' ".;":: . · .· ;' '"J- ' / . : ^:: / '.'' ' ··. .. .-". ., : _: .;' '^;; !-Mit der Er findung" ,sollen -/die '. M;ä-nge.'l· ftes Standers der Technik .be- . „. .seitigt werden. · : :.; ; '. : : ./ ^; : ' ': . '. v//-;'-^: X'.'Z-V ' :'.; . " '^;: ', ' ;''^;; ~ 'X:

' '. .Darlegung des Wesens;, der, .Erfindung;':·. /.;/ ;,'. ' ,·>/ ' .; . -' '.-,- ' ' . . >Die Erfindung beruht auf.-_: der Erkenntnis.,: daß durch die Entf er- .

^:; -hung wenigstens eines ,.Tell.e_;s /der. gelösten;G.ase; aus der intra-

ί /zellüiären .Plus s igkelt "eines ^'el^materlai-s'rdas. .Elnf rier.en. und "'.' ' -. 'die Rekonstitution .desvMaterlal/s o_:hne/'nennenswerte .Schädigung _: /;.;:^der- Zellstruktur .^:oder':die Bildung ^vori/Emboli möglich sind. / : .

'. //Durch das erfindungsg-e/mäßejVerf ^ eine Methode .

/.!geschaffen _r mit' deren/Hl.lfe, eine ..yOll.ständlge. Unterbrechung ; . .

{ :/;aet Lebens vorgänge bei Ve^rschiedenartlgstem organischen Gewebe! :.; /erzielt werden/kann!, ;' d:ie^:;eine/ Rückkehr der' vollen Lebensfähig- l· / :keit/nach ,dem Au-f tauen· gestattet ·_; , :'/!:/,/ -'^:/ , . ' ' - ' ; ^: . ·

.-' .'/Nach /dem !erf indungsgemäiSen\ Verfahren ;;wird organisches: Material /:ln Form eiri.es Zellgebildes einer ä'llTriahiichenVDruckvermind.er/ung :';;;unterzogen!!und bis. auf/! Gefrier-;_: und : Sübgefriertemperatur .ge-- '; ; ;. kühlt. .Die Druckverminderurig, wird bis zu. dem Punkt v'orgenom-; / '.'. men, bei. dem die .Konzentration der-In! der intrazellularen . . !

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Flüssigkeit gelösten Gase erheblich verringert ist, wobei ein wesentlicher Verlust an Flüssigkeit selbst durch Verdunstung vermieden wird. Die Bezeichnungen "Gase" oder "gasförmige Stoffe" werden hier in dem Sinne gebraucht, daß sie Stoffe bezeichnen, die unter normalen atmosphärischen Bedingungen von Temperatur und Druck im gasförmigen Zustand sind.

Durch die Verringerung des Gehaltes an gelösten Gasen wird auch eine entsprechende Verminderung der Zunahme des spezifischen Volumens, die beim Gefrieren der intrazellulären Flüssigkeit auftritt, erreicht. Der Erfindung liegt die Entdeckung zugrunde, daß die Verringerung des gefrorenen Volumens ausreicht, um eine Zellwandbeschädigung auszuschließen, die sonst mit der Bildung von Eiskristallen verbunden ist.

Die Druckverminderung wird mit einer Geschwindigkeit vorgenommen, durch die das Verdunsten von Flüssigkeit verhindert wird. Sonst ist die Geschwindigkeit nicht kritisch und kann über einen breiten Bereich variieren. Im allgemeinen wird eine im Bereich von etwa 1,0 bis etwa 1.0,0 Kilopascal pro Minuten (7,1 bis 77,0 Torr pro Minute) liegende Druckminderungsgeschwindigkeit angemessen sein. Bevorzugte Druckminderungsgeschwindigkeiten sind die im Bereich von etwa 3,0 bis etwa 7,0 Kilopascal pro Minute (23,0 bis 53,6 Torr pro Minute) liegenden, wobei etwa 5,0 bis etwa 6,0 Kilopascal pro Minute) (38,3 bis 46,0 Torr pro Minute) am meisten bevorzugt werden.

Während der Druckverminderung wird der Druck bis zu einem Punkt gesenkt, an dem eine beträchtliche Menge des gelösten Gases aus der Lösung entweichen und durch die Zellwände gehen mußte, ohne daß dabei eine nennenwerte Menge der Zellflüssigkeit verdunstet ist. Der tatsächliche Grad der Druckverminderung ist nicht kritisch und kann innerhalb eines breiten Bereiches variieren, und zwar je nach der Art des vorliegenden organischen Gewebes, dem Gehalt an gelöstem Gas, der Zellwandstruktur und der Beschaffenheit der Zellflüssigkeit. Vorzugsweise wird mindestens etwa die Hälfte des Gehaltes an gelöstem Gas beseitigt. Bei den meisten organischen Stoffen wird eine Druckverminderung bis auf einen Wert der etwa 90 bis etwa 60 Kilopascal unter dem Luft-

:;,' ;' .· :·. /:.· :,v λ '^::-'-'^:\^: yZy-^ί: Φ'Μ·-:-:^': ;: " ;.: ' ':. . _: .-. ' :."' ' 25772a ι

druck (70 : bis 300 Torr. aböo^:lut)>l;l^^ ..., -.

sen .führen , Innerhalb> dteis^s,-'Se reiches wird'.ein Bereich, von .et- .; wa.&0;_: bis' etwa65. Κΐϊο;ρ'^3;ο:ά1_;< ^nter /-dem:;. Lüf tdruck^ (J 50 :b.is- etwa 260-Torr absolut): bevorzugt;.. _: ^{:: ;v} ^: V ''i "· ^:. ·ν·^:./ ''/ .: '/.. ^;: !'. ', ' ;P'er \optimale '.Druckyerinindertin^ ni^;cht nur .mit' der

; Art des organischen Material-ö ,^: sohdervn: aiiph; mit- der Höhe öder ;

. dem ,Klima,, in d.emVdas ;orgän:rs^::ch"e' Das . :.

.gilt" vor. allem; im Falle.v'.Ypn .;j};Eiattzi'l·^ öder Früchten /die-iri |φβέη_: !Höher!:.^bder:-.in verhältnismäßig ka.1-, ten oder warmen Umgebungen angebaut Vurdeiii. Durch ^: die verhält-, ,nlsmäßig ' zerbrechlrchen,: ;.bßi!.;ih großen· Höhen^:-angebauten Pflanzen vorhandenen; .ZeI !wändet, -neigt ;.Ei:e Zejlstruktur' stärker .zum Zer~ : brechen, uridrs_vie .wird,: für, ^:di,6' ' ' ^:φ.11. fusion von ' Grasten.'.'und Dämpf en_; '." ^starker; durchlässig .V In^sio^ciciierilFal^en :.muß besonders.' darauf -geachtet werden _v daß! Dehydrat'isi&rung^ wird. .·'

und auch¹ .die !Zellsirukt^;ut;;'u:nbe;sc;häd_:igt: b^ durch.

..eine Verringeruhg ,des';'p^;ia'des'-^;:d'er\'DVupkv:.e'ipmind;e.r'unⁱg und der. Geschwindigkeit , mit;^;d._:ea?, die- Druckverminderung ^vorgenommen wird, . ' zu.^:-.er-re.iahenV. Ähnlich^ Maßnahmen 'si rid., häuf ig auch für Pflanzen erforderlich, ; -d"i.e: in _;k^lt:e.ni; "o'der -'waiitiem :'KIi ma angebaut .wurden , \we.il es.Veränderungen^ der Zellflüssigkeit .^

.vorhandenen-¹. gelÖ:sten;:::Gas:e:;^gibt ·.-.-.:, :'.'.-ί'-^ν" Γ-\. .y^' -C: '\ '- ^; ' ' '.' iWenh ^besonders. .dicke öder stark.e 'ZbIIwände beteiligt sind, kcinn, :· /die Z eil reaktion auf ^dIe .',Dr uc.kv-e.rmi.n_:de rung- durch einen ν or aus ge— henden 'Druc^Vermlnderungs^D^^ Anpassen .. ν :

der .Zellwände νevb&ssev't 'uex,den l\ Die.' .Abschnitte- des ' Druckver- .! '. : minderungs- und' Dru'ck.erh'öhupgszyklus-.w beide bei -den .oben-

^genannten ^G-esOhwirid igke^ it en ;yorgenommenv .-obwohl": auch ein. geringe--, rer Druckabfall an^!iifä^^t^wivä\''im\:-all§ene±nen: kann ein. erfolg- , reiches Anpassen d'urch-_; ^;.D^^ auf -.einen im Be- ·.-. ;

reich von etwa "20 ,bis..;e:t^ä;;4O::,Kilopascä . ;

450 hi.s 6Θ0 Tqr.r absolut ^lißgeÄden Druck-erz'i.elt·.werden . ^: Die .Druökverminderung kahp ;entwede:r ;V;pr öder während. des Kühl- . Prozesses erf olgen;i\ ^Orzugsweis:e werden_; Druckvefminderung .und ,Abkühlung glei-chzeitig vorgenommen.,:-um .eine optimale. Steuerung .für die entweichenden 'Gäke ,bei,/Unterbindung von Wässerverlüst -:-

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zu erzielen. Wenn beides gleichzeitig erfolgt, müssen die relativen Geschwindigkeiten für Abkühlung und Druckverminderung so gewählt werden, daß Momenterhitzung verhindert und auch die Bildung von Eiskristallen, bevor das Gas entweichen konnte, vermieden wird. Geeignete Geschwindigkeiten lassen sich leicht durch Routineversuche ermitteln. Nach dem Auftauen und der Rekonstitution des gefrorenen Materials läßt sich dasjenige mit zerbrochener Zellstruktur leicht durch den Mangel an Turgor bestimmen, während das, bei dem Entwässerung aufgetreten ist, eine merkliche Veränderung in der Konsistenz und einen teilweisen Verlust an Turgor zeigt.

Durch den Einsatz herkömmlicher Kühleinrichtungen und bei einer Druckverminderung mit den oben -angeführten Geschwindigkeiten lassen sich befriedigende Ergebnisse unter Ausschaltung von Zeilserreißen und Dehydratisierung leicht erzielen. Die endgültige Temperatur wird jede Temperatur sein, bei der intrazelluläre Flüssigkeiten zu gefrorenen Feststoffen werden. Sie wird mit der Beschaffenheit der gelösten Stoffe und der Konzentration des gelösten Stoffes und daher auch mit der Art des betreffenden organischen Gewebes variieren. Im allgemeinen wird eine Temperatur zwischen dem normalen Gefrierpunkt von Wasser und -10 C reichen.

Das Kühlen kann mit Hilfe jeder herkömmlichen Technik vorgenommen werden. Wenn das Abkühlen und die Druckverminderung gleichzeitig erfolgen, dann ist es erforderlich, wie oben bereits erläutert wurde, die Kühlgeschwindigkeit zu mäßigen, damit die Gase aus der Flüssigkeit entweichen können, bevor eine beträchtliche Eiskristallbildung erfolgt. Daher wird Blitzfrosten am besten ausgeschlossen.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Kühlen und Druckverminderung von Schütteln und/oder Vibration des Zellgewebes begleitet, um die Bildung von Massen kleiner Eiskristalle im Zellinneren anstelle von großen Kristallen zu unterstützen. Kleine Kristalle nehmen weniger Raum ein, verursachen eine geringere Verzerrung der Zellform und haben weniger scharfe Kanten oder Spitzen, die

>'".;;, "die.;;'Z el !wände ;zerr_;gi^e:ri^fcion;kt.eri';;; .BievG'e^schwihdigkeit.'tihd. der- : '- /, .; „Grad des : SchütteΙηΐ?, ,oäer/--:d©r>;/l/%^ . ·.

';.;;,;_;V: /und^können ΐιη/έεϊ:/ de;i-:|_:orausse"t^ , '·/

;;; ' .; Abrieb ^vÖjier .spnstige^vfe .

/ /- werden und trotzdem, /d'ie.« £eiö":st^

; /V/v'..';/variiere ti;.-" Jedes Gerät',:. da.?; ;ff oleküihewegüng innerhalb des Ge- ;/;;./ owebes in /einem .Ausmaß,/ dur::c/h/^:das rdiVe^ZKiristallbildung unter- ;.,..;/' brpche.n öder umorga^lsi.e/rj.Vwipd^y /a;u-slB^;en kann, kann dazu yer- - ,/ / /;/. wendet werden> Diese .Be:Weigattg//kanhV^ bi^;s

/^;/'/ zu Schwingungen mi^t' /Sc/hal^re^uen^ .-Er;ge.b-

.;/;';/ /nis'se: werden /durch//leichtes ):^h1ittdinie"r/reicht j/ .das mit einer : -J \.\, //' /kbntinuierlicheh';.,Ges/öhwind^igkeitl· fbiitgesetzt /w -bis die' ge-

-/./;. samte/·;Plüssig-keit ^;inAderfZieiisfeuk/t^ ;

/: ; ν-/' ist.; Ih den' rnei&ten_: -Änwe_:n /-·.. -

, ; · . ;:Z.;-Se'h^;!wingti^ ^;etwaij.25. xtri(i 'etwa; 100 Zyklen ' pro ' ' .

; ;i r Minute be tragend eh/_;/&^;&ch^ind^ .'

[;^r\%: plitude /yPh etwa;. 1 ,;0 :,bi;S.;/,etwia;/.1;0^:v0; Zbil^>:;:(^;2, 5/ bis//25 ,Ό cm) ;die '

·; //,:, besten; Er'gebniss.e ../^; v/^v; -. \^'i-/c ;//.-//./;--/.v -.V-.;-..-;.-.;:/::.,./;-.;;. / ;// :/ ' -. .:.;_; .- . .; ·· ... · / '-'^: ; Wenn ,dichte Pder/.-s.fter/^ige; ^t of fe.,;h:ach ;d.e;^m erf'indungsgemäßen. ^;

/; / /.Verfahr eh vbehandel/t/w^^en daß das

1/..:v Gefrieren,in der ge/s°amterijMa^se erfblgtv. Infolge Be'schrän— . . · ^;'^://;:^:;. kun^gen bei /der^WartoeiiHeitt^agung, kr;is-tatl'lisi.eren innere- Teile, / / ν wie ^: das . Her ζ yön^Kppf salat ,^;/;viel^; ;l;aJägs,a,m^:er als /Teile :an oder :..;/ ^: ;;^;n;ahe der. äußeren Zellschi-eht/./ Daher/iist/es , sobaLd die end- /

/ ' ,/gültige . Temp er 3ΐμ^ /urid^/der e^dgültige;i)ruckyermihderungsgrad; . _:. i'v //^erreicht/.sind|/ hauif^ig-np/twendig, d:ie-se/^;Be.dingungen beizübehal^ ;: //,./' ten; und auch mit/i^em /Sc'hütikl^iVWert^^ .noch

//; ".· eine Weil e ' f ort zufg.hr ertr ^uni e in- y oll s/tändigeö ' Ge f r i er en zu/- ga- ;. ;/' vi;::.rarttiere.n. ;, . ; / // ./i^:;'-_::^:V //:. ;/^:/ ^i;:'·. ':'/;;/// //'^:., : '. .'/ .-' ν.-. . .'"' .',' ./ ·

K v/Als, weitere M;öglichkei;täk^:änn_:: f.e/uc/hte/Oder gesättigte Luft- um ; . /;· . // den zu frostenden Gegen_:stari;d: zirjculieren, ^wodurch- ein weiteres ' ' :

//;/ /Mittel gegen De^hydratisierüng· ge.scha'f .fen wirdv, /Geeignete Zir-· ; ν ,- -. . ;./' : kulationseinrichtungen/ werden häufig' in ; :

/r./;/.Kühlanlagen mit eingeb/aüt. JMäenfalls · sollte ^Kühlen, in, einer ' λ": V e/xtrem. trockenen Ümgebaihg/^ ' -. ; .: . /

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Wenn bei lebenden Tieren eine Unterbrechung der Lebensfunktionen durch Einfrieren und. Druckverminderung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgenommen wird, kann Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes gasförmiges Anästhetikum eingesetzt werden, um die Unannehmlichkeiten weitgehend auszuschalten und die Freiheitsbeschränkung zu erleichtern. Das Anästhetikum wird dann während der Druckverminderung freigesetzt, so daß sich das Tier nach dem Auftauen wieder vollkommen erholen kann. Außerdem kann die schnelle Kühlung von Geweben durch·die Anwendung eines Helium-Sauerstoff-Gemischs zum Belüften der Kühlkammer erhöht werden.

Wenn die vorgesehene Menge von gelösten Gasen entwichen konnte und die Gewebe vollständig gefroren sind, kann das organische Material unbegrenzt lange im gefrorenen Zustand entweder bei atmosphärischem Druck oder unter dem Partialvakuum, unter dem die gelösten Gase freigesetzt wurden, gelagert werden. Die Zellstruktur wird unversehrt erhalten bleiben, vorausgesetzt, daß einem Auftauen kein erneutes Einfrieren folgt. Wenn das organische Material wieder in seinen ursprünglichen

Zustand zurückversetzt werden soll, dann kann das Auftauen'

ohne Schwierigkeiten durch allmähliches Erwärmen des Materials auf Umgebungstemperatur geschehen. Während sich das Material erwärmen kann, schmelzen die Eiskristalle innerhalb der Zellstruktur und atmosphärische, Gase lösen sich wieder in der Zellflüssigkeit bis zu ihrer Gleichgewichtskonzentration. Die Wiederherstellung des vollen Turgors und die Rückkehr in den ursprünglichen Zustand kann durch Anlegen eines leicht über dem Luftdruck liegenden Druckes an das Material unterstützt werden. Das wird besonders dann bevorzugt, wenn es sich bei dem organischen Material um Tierzellen oder ganze Tiere mit zeitweiliger Unterbrechung der Lebensvorgänge handelt. Am meisten bevorzugt man in der Praxis, die Anlegung eines über dem Luftdruck liegenden Druckes vor dem Auftauen vorzunehmen, um den intrazellulären Druck wieder herzustellen, bevor das Innere der Zellen wieder den flüssigen Zustand erreicht hat. Die Höhe des Überdruckes ist nicht kritisch, wenn er nicht

.selbst zu einer Beschädi^ting .d;er'^ellsibrüktUT führt. Ein . .

Druck",, der etwa'5 % ;-bis :etwä^;-I§}.' % /ü^i/vd^m-./Ümge-'bun-g's'clr-uck ;

/.liegfeV reicht für;, die .--.VmsigH/,^ . /

Aschwindigkeit der Jruökwiiede-riiiersteJlung ist gleichfalls . .'.'. ;ni.cht .kritisch/^:.und für .;S;ie^: ?gelt:en_;:aü;ch' nicht die.während ' "·' der: Druckverminderung erfötder!^:ichen ;Ein^:s_;chrankungen . So ist . :ei'ne'· etwas höhere Geschwindigkeit' als -die für::die- Druckver- . /minderung. angewandte zulässig, ..wobei, eine typische ^derartige .5;es,e.hwindi;g:k;eit im ^:Bereich;':v;on et.wa'^v5^:-. ;bis' etwa M.0-Kilopascal ;' ; ::pro; Minute: X38'bis ,77:^ das. Auf-

itau^n voll ständig er;f oigii ist;?· kann dks .Material -wieder Umge- : .bungstemperatur ausgesetzt. :^.e^den',';^WQiäü.£-/üb-e#ä.9.hüssige^: .Gase innerhalb d'er Zellwände^f.Tyeigesetzt^'iverden..: ;. ^! . „^: ' .. ^;Oas' erf Indürigsgemaße; Verfah'r'eh': ist-ißi;-' das^: .Einfrieren und die _: 'Wiederbelegung jedes pf lanzlrchen urid^: tierischen Materials, .^: _:: ' z.B.. von Früchten-,- Gemüsen.,, .ungenießbaren^^ .Pf lanzen,' Samen, .

leicht verderblichen; iiei'schsQ^ Zellen und -.Ge-.

/Weben,, tierischen und jnens.chliclien.vOrganen,' ganzen. Tieren und . _: Henschen anwendbar .^;:' Weririv :ve;ge^atlveö-7Material::wie .Früchte und .' ., G_;emüs.e.benutzt, wird,tiv^eräeriidie bes%eh:,_:E .''.'; .

;^enn .diese^;, Stofie so\ rasch- wie,; mögiich:';nach^: der. Ernte/verar^ ,. beitet w e^r den ..'Das ;e rf irtd;Ungögerliäße;^; Verfahren -hat" seine-Nütz;- ν lichkeit in einer verbess-eriren. ^::Lagerung:,un:d Be;f örderung.:yön -. '. 'vegetativem und tierisc:hem.;;Material:,::: in dfer. m^:edizinisehen und , .. 'wissenschaftlichen Köriöerjlerung·von.,Zellen, -G:eweberi, Orgäneri.. oder, komplizierten Organismen..,^;^In'der niedizlnischen Ruhestel- ; .. •lung .von beschädigten oder- &io;h: autlcjsenden Geweben und organischen Systemen .zurii^ Zwecke enirurigisöher.. oder: allgemeinme— _: ; dizinischer Maßnahmen: 'und ,für·: den .SoH_;einto.d lebender ,Zellen und . ,komplexer ..Systeme.;.- fM;^^d;ie:l)ii-6i;agi^cKe>Kori$'-exv;i erwie- -.: .·, .^:

A.usführungsb.elsplele":. i--_:; .^:._;-:t;;' . -.' .- "·; :; '.- ^:;:V_: ;; '. ' .': , '.' ; "',...: .· '"' .-, ; -...· ".·'. '" iiie .folgenden Beispiele ö:olleni zurO EfI aut-erung. dienen und sind .Weder zur Einschränkung nooh-.zur; Definierung, der ,Erfindung in , irgendeiner ¥eise gedacht,./:. ^; ;::'.\ ^:';-v_: ^;K/v 'S-V. _: ^: ."". ) ^;\-, ... :' '. _; ^;:

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Beispiel 1 . · ' '. ' :'. "'-/;'. · ^: ; ':: : ·. " '"'-ν ':' ; .'·.' :.' ' '. ' Sechf. iibliehe LabOratDriünis-Ma.use und sechs Kopfe Lattich wurden in einen offenen trarisportäbTeri^ G^^ bikf^ß (0,06 Kubikmeter) ,, der auf -4 °C eingestellt war, gegeben, der sich seinerseits in einem'Hö^ensimulator mit Vibrationsmöglichkeit befand... Durch eine belüftete Hoöhväkuumpumpe wurde der Drück in dem^^ Simulator auf: einen einer Höhe von. 37 000 Fuß (164 Torr; absolut oder -78:>2 Kilopascal) entspre- ' chcndoii Di'uck mit einer gleichbleibenderi Geschwindigkeit im. Laufe von etwa 2.0 Minuten gesehki;. Während, der Druckvermlnderung erfolgte seitliche; /Schwingung des , Syst; ems, mit einer Verschiebung von etwa drei Zoll (7i6· cm): und 'einer -Geschwindigkeit von 60 bis 70 Zyklen prp Minute.-Sobald das vorgesehene Vakuum erreicht war, wurdeder Gefrierapparät geschlossen und die Vibration wurde noch eine Stunde und 4.5· Minuten iang fortgesetzt. ' '-..; •.^:''^:-'-.--ⁱ- 'V"':-: '--'^:.-:"."-'.'^-..-.V ^;^:· ..'ν.-· \'':' .. .' '". '. ' .' '.V Die Vibration wurde dann eingestllt;. der Gefrierapparät wurde wieder geöffnet, und _:den. Brück -ließ man· mit einer mäßigen Genchwi ndigk/ait im Laufe von. :20 Minuten wieder auf Luftdruck ans Leimen. Bann würde ein' ; zusätzlicher -pruck von 0,1 Atmosphären in dem Simulator erzeugt ,um die iDichtung zu lösen und das öffnen der Türen zu erleiphtern. Die ICiäüsie^ und der Salat wurden danach/-:herauB.gen'.O]^ ; ', Die M^us.e zeigten keinerlei Lebensregürtgen und fühlten sich steif an, ein klarer; Beweis, daß sie. gefroren:waren. Die Mäuse wurden aus ihren Käfigen' zusammen ^mij;; den zum Abdecken dös Kafigbodens benutzten Tüchern'entferrit. Die _;Mause und die Tücher wurden dann zur Beobachtung in Pappkartons gegeben., Annähernd 45 Minuten nach der Entfernung aus der Dekompressiohskammer begann eine der: Mäuse^^ wieder'Luft, ζμ holen. Im Laufe . der nächsten fünfzehn. Minuteri;Waren bei vier, der übrigen Mäuse geringfügige Bewegüngeh festzustelieri, Anzeichen für die Rückkehr der Lebensfunktiphen. Die sechste. Maus bewegte sich etwa 1 0 Minuteri später .. ;| ^; ' .::;::.. λ;"···"' ^;; '. -V -·^:·; ' . ' · .'.' . -.. '/ '·' Wassrr und Putter erhielten, alle· Mäuse, arinäherrid. eine Stunde nach der Bntnabtne aus der Dekompressioriskämmer. Während der .

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nächsten Stunde schienen alle sechs Mäuse in gutem Zustand zu : bleiben, sie zeigten normales Verhalten und normale Freßgewohnheiten. ' . _: ,

Der Snltat war nach der Entnahme aus der Vakuumkammer gleichfalls steif und vollkommen gefroren. Die Köpfe wurden auf \ Löschpapier gelegt, um etwaiges Auslaufen von Flüssigkeit [ durch Zerreißen der Zellen nach dem Auftauen beobachten zu können.

Innerhalb von fünfzehn- Minuten war der Salat im wesentlichen aufgetaut und es konnte keine Auslaufen von Zellinhalt beob-/ achtet werden. Kleinere Bereiche, die sich nicht erholten^ blieben an den Rändern verschiedener Blätter zurück. Vermutlich war das auf Zerdrücken der Blätter vor dem Einfrieren zurückzuführen. Die Hauptmasse des Salates, kehrte jedoch wieder zu vollem Turgor zurück. . \

Beispiel 2

Die in den Beispielen 2 bis 6 eingesetzte Apparatur bestand aus einer durchsichtigen Vakuumkammer auf einer chemischen Schütteleinrichtung, die sich alle innerhalb einer begehbaren Gefrierapparatur· befanden. Die Druckverminderung wurde durch den Einsatz einer kleinen Vakuumpumpe erzielt, wobei die Druckablesungen an einem Manometer oben auf der Kammer vorgenommen wurden. .' . , Ein Kopf Gartensalat wurde auf eine Ohaus-Waage in der Vakuumkammer gelegt, und die Waage zeigt an, daß der Salat zu Beginn des Versuches 505 Gramm wog. Die Kammer wurde allmählich : im Laufe von 20 Minuten auf ein Vakuum von -77 Kilopascal unter gleichzeitiger Kühlung der Probe gebracht, wobei die . Schütfceleinriohtung mit etwa 50 Zyklen pro Minute mit einer . seitlichen Auslenkung von annähernd drei Zoll (7,6 cm) arbeit tete. Die Temperatur des Gefrierapparates betrug etwa -7 C .V Während der Druckverminderung nahm das Gewicht des Salates um 10 Gramm - 2 ab. ' :· ..· '" ' ' Wenn die verlangte Vakuumhöhe erreicht war, wurden die Bedirt-'". gungen weitere vier Stunden lang beibehalten. Die Vakuumkam-

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mer wurde dann allmählich belüftet, um den Druck zu erhöhen und wieder auf Luftdruck zu kommen. Die Rekompressionsgeschwindiftkfiil betrug 5 bjp 6 Kilopascal pro Minute. Der Salat wurde anschließend aus der Vakuumkammer und aus der Gefrierapparatur entnommen und im Laboratorium auf Löschpapier gelegt, auf dem er auftauen könnte. Die Temperatur im Laboratorium betrug 68 ⁰F (20 ⁰C).

Für Vcrgleichszwecke wurden, zwei weitere Köpfe der gleichen Salatart in ähnlicher Form'als Kontrollen behandelt. Einer davon wurde aber einfach in den Gefrierapparat ohne Druckverminderung oder Schütteln gelegt und der andere wurde Druckminderung unterzogen und ohne Schütteln gefrostet. Ansonsten waren die Bedingungen identisch.

Innerhalb von zehn Minuten nach der Entnahme aus dem Gefrierapparat zeigte sich bei der ersten Kontrollprobe (ohne Druckminderung oder Schütteln eingefroren) ein Verfärben des Lösehpapieres, was auf Zellzerreißen und Beschädigung hindeutet

Die zweite Kontrollprobe (mit Druckminderung aber ohne Schütteln eingefroren) zeigte keine Verfärbung des Löschpapiers, .[ aber einen Verlust an Turgor, war schlapp und erinnerte an Seegras oder Seetang. Die übr.ige Probe (unter Druckminderung und Schütteln eingefroren) behielt nach dem Auftauen den vollen Turgor bei und zeigte kein Austreten von Flüssigkeit. Ein kleines Stück eines Blattes erholte sich auch hier nicht wieder, wahrscheinlich infolge Drückens und eines kleinen Bruches in den Kapillaren, die diesen Abschnitt versorgten.

Beispj el 3 ' '

Drei Köpfe Gartensalat wurden für die Versuche ausgewählt, einer war am Tage des Versuchs aus dem Garten geerntet worden, und die anderen stammten von einem Gemüseverkäufer und wären nach dem Pflücken mindestens vier Tage alt. Alle drei Köpfe wurden sorgfältig in die Dekompressionskammer von Beispiel 2 gelegt. .·-;. .:

Die Köpfe wurden allmählicher Druckverminderung und Schüttelbe werbung in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise unterzogen.

Nach einer.Schütterze:i.t'. von ' 45_/'/Minuteh:.:;wtircle;'-;b'ei''d^r- stabilisierten Pärtiälväkuurahöhe"eine·.visuelle Überprüfung vorgenommen, die ergab, daß die :Köpf e nicht; vollständig gefroren waren. Die Schüttel.b.ewegün.g/wurde Vbei dem niedrigen.Druck dann 2 Stunden und 15 Minuten/lang fortgesetzt, worauf vollständi- . ges Gefrieren erzielt /war','; / // ' ." ' ^^;: ^. .' ' ;; ^:....'': ·,-,' ' '' .' / · · Die allmähliche Druckerhöhüng konnte därift in einem Zeitraum, von 20 Minuten erfolgeti-. ^Äl;lei^drei^: Köpf e: würden dann aus der DekompresGionskammer und dem G-e.fi^^ierapparat^^ eritnommeh und wie oben beschrieben im · Jj^bbratorium ' -äulf: Löschpapier gelegt. Beim Auftauen' 'des ; Salates war 'das;Äiistr e.tön';^: ton Zellflüssigkeit aus den Blättern, die mit der /Seite der ^Kammer. In Berührung gestanden hatten, festzustellen,.;' Blätter'4m· Inneren zeigten kein.. ; Auslaufen¹.; ' / ^:; '.-.;'. ''"'' ^:-'\. ;-.·; .-';"_: ' ;;'. '; ";/ ;/ : ;/... ;-·.;_:. "Ϊ ^;. „' '·. ' . .:'^;; Der am Tage ''''des,''.yersuchs . gepf^lückte::Kqp;f erlangte den vollen . Turgor wieder.: Die vier _:Tage vorher \ypm Feld geholten Köpfe kehrten nur zu teiiwei^em; Türgor,"wieder zurück'. „ .

Beispiel 4 ' " ;'; ^:.' "' '.-. ';;. ;';:" ..··; ' :-; ' ; ";; ;. '-\ '; ..". .. '.'·.; ' ';.. v·". ·.-; ^: ' . ·. Eine Reihe von ^-Zoil-Töpif eh" (10 · 2 pm) , in denen sich jeweils . swei lebende ChrysänthemenpfTanzen mit;: sowohl .offenen Blüten als auch Knospen befanden,./wurden in· die Dekompressionskammer . gesetzt und nach der Verfahrensweise von Beispiel 2 behandelt. Eine Pflanze/in dem einen Topf._e hatte einen Stengel, der etwas höher äl's die Innenhonen d er;/Kammer war ν. so daß er mit der'Ober- . seite der Kammer während des Einfrierens "in Berührung stand. ': Die endigültlg.en^: .Pärtialvaküümbedihgungen wurden unter Schüt-. ' t el b e wegung:.zwei- Stunden· ,lahg/beibehai ten,: worauf die Pf lanzen der Druckerhöhüng ausgesetzt und aus ^:;der Kammer, und dem Gefrierapparat zum. Auftauehv im'iabor^oriuni entf ernt würden. 'Innerhalb einer Stunde waren alle Pflanzen ^ol.tständig aufgetaut. Die . / / Blätter, zeigten die/_;gleiehe. Textur..und.''den gleichen. Torgor wie vor dem Versuch, wenn auch- ihre ^: Farbe/etwas, dunkler war. Die ^: Pflanzen wurden/dann, über einen/Zeitraum/von vier Wochen beob-' ' achtet, und bis auf_; den Stengel ,der mit der Kammeroberseite / ·' · in Berührung ge st anden-.-hai^iie ,^:: .wuchs eh _: alle weiter mit einwandfrei en Blüten und z« Blühen ikömmeridenr;JEnosp^;en. ' . ^v,. . .

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Beispiel 5

Vier Kirsch-Tomaten, drei Beefsteak-Tomaten und zwei italienische Tomaten _r alle frisch gepflückt, wurden in die Dekompressionskammer von Beispiel 2 gegeben und wie beschrieben behandelt. Außerdem wurden .zwei Kirsch-Tomaten und zwei italienische Tomaten, ebenfalls frisch gepflückt, auf die Schütteleinrichtung, aber außerhalb der Dekompressionskammer, zu Vergleichszwecken gelegt. Schließlich wurde noch eine 4 bis 6 Tage früher geerntete Endivie in die Dekompressionskammer gegeben. Die endgültigen PartialVakuumbedingungen wurden unter Schüttelbewegung vier Stunden lang wegen des hohen Wassergehaltes der Tomaten aufrechterhalten. Die Gemüse wurden dann einem erhöhten Druck ausgesetzt, aus der Kammer und dem Gefrierapparat entnommen und im Laboratorium auf Löschpapier zum Auftauen gelegt. Nach dem Auftauen zeigten die Kontrolltomaten (geschüttelt, aber keiner Druckminderung unterzogen) Anzeichen von Zeilzerreißen und Hautschrumpfung, und sie hatten eine weiche, matschige Konsistenz. Die übrigen Tomaten erlangten ihre ursprüngliche Form und Festigkeit wieder zurück, wobei sich Wassertröpfchen auf der Oberfläche infolge der plötzlichen Einwirkung von warmer Luft befanden. Einige der reiferen Tomaten hatten eine dunklere Farbe als sie ursprünglich gehabt hatten.

Die Endivie zeigte nach dem Auftauen eine gemischte Reaktion. Einige Blätter welkten, ohne sich wieder zu erholen, während andere von vollen Turgor wiedererlangten.

Beispiel 6

Vier Köpfe mexikanischer Salat, und zwar Köpfe Lattich und zwei rotblättrige, die in einer Höhe von 2500 bis 4000 Fuß (760 bis 1220 Meter) angebaut worden waren, wurden wie in Beispiel 2 beschrieben behandelt. Nach dem Auftauen der Köpfe war kein Zerreißen von Zellen oder Auslaufen von Flüssigkeit zu beobachten. Der Tugor war jedoch geringer und die Blätter hatten eine gummiartige Textur und einen ursprünglich nicht vorhandenen Oberflächenglanz.

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Weitere vier Köpfe der gleichen Salatarten wurden in ähnlicher Weise behandelt, nur erfolgte die Druckverminderung nur bis zu einem Wert- von -70 Kilopascal (217 Torr absolut) und nicht von -77 Kilopascal. Diese Köpfe erlangten nach dem Auftauen den vollen Turgor, und die Textur und das Aussehen der Oberfläche viaren mit denen vor dem Einfrieren identisch. Die obige Beschreibung soll nur Erläuterungszwecken dienen. Die Erfindung soll nicht auf bestimmte beschriebene Merkmale oder Ausführungsbeispiele beschränkt sein. Zahlreiche Modifikationen und Abänderungen des Obigen, die noch im Rahmen und Geltungsbereich der Erfindung liegen, werden dem Fachmann ohne weiters deutlich werden.

Claims

- 15- . 257728 Erfindungsanspruch:

1. Verfahren für das Einfrieren und die Konservierung von organischem Gewebe, gekennzeichnet dadurch, daß es folgende Verfahrensschritte umfaßt:

a) Senkung des Druckes der mit dem Gewebe in Berührung stehenden Atmosphäre, um aus dem Gewebe zumindest einen erheblichen Anteil des darin gelösten gasförmigen Materials freizusetzen, ohne daß eine nennenswerte Verdunstung von Wasser aus dem Gewebe erfolgt, und

b) Kühlen des Gewebes auf eine bei oder unter dessen Gefrierpunkt liegende Temperatur.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Schritte (a) und (b) im wesentlichen gleichzeitig ausgeführt werden.

3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Schritte (a) und (b) im wesentlichen gleichzeitig ausgeführt werden, und daß das Gewebe gleichzeitig bewegt oder geschüttelt wird, um eine Molekülbewegung innerhalb des Gewebes zu erzeugen, die ausreicht, um die Kristallbildung beim Gefrieren zu stören.

4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Schritte (a) und (b) im wesentlichen gleichzeitig ausgeführt werden, und daß das Gewebe gleichzeitig mit einer Geschwindigkeit von etwa 25 bis etwa 100 Zyklen pro Minute geschüttelt wird.

5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der in Schritt (a) erreichte Mindestdruck etwa 90 bis etwa 60 Kilopascal unter dem atmosphärischen Druck liegt.

6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der in Schritt (a) erreichte Mindestdruck etwa 80 bis etwa 65 Kilopascal unter dem atmosphärischen Druck liegt.

7. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß Schritt (a) mit einer Geschwindigkeit von etwa -3 bis etwa -7 Kilopascal pro Minute ausgeführt wird.

8. Verfahren nach Punkt a, gekennzeichnet dadurch, daß Schritt (a) mit einer Geschwindigkeit von etwa -5 bis etwa -6 Kilopascal ausgeführt wird.

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9· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß zumindest die Hälfte des in ,dem Gewebe gelösten gasförmigen Materials freigesetzt wird.

10. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch,- daß es sich bei dem organischen Gewebe um vegetatives Material handelt, und daß das Verfahren etwa innerhalb eines Tages nach der Ernte ausgeführt wird.

11. Verfahren nach Punkt 1 für das Einfrieren von organischem Gewebe, gekennzeichnet - dadurch, daß der Druck der mit dem Gewebe in Berührung stehenden Atmosphäre mit einer Geschwindigkeit von etwa -3 bis etwa -7 Kilopascal pro Minute auf einen Mindestdruck von etwa 90 bis e.twa 60 Kilopascal unter dem atmosphärischen E'ruck gesenkt wird, um aus dem Gewebe wenigstens die Hälfte des darin gelösten gasförmigen Materials ohne nennenswerte Verdunstung von Wasser aus dem Gewebe freizusetzen, wobei das Gewebe auf eine Temperatur von etwa -10 C bis etwa 0 C gekühlt und das Gewebe mit einer Geschwindigkeit von etwa 25 bis etwa 100 Zyklen pro Minute geschüttelt wird.

12. Verfahren nach Punkt 1 für das Einfrieren von vegetativem Material, gekennzeichnet dadurch, daß der Druck der mit dem Material in Berührung stehenden Atmosphäre mit einer Geschwindigkeit von etwa -5 bis etwa -6 Kilopascal pro Minute auf einen Mindestdruck von etwa 80 bis etwa 65 Kilopascal unter dem atmosphärischen Druck gesenkt wird, um aus dem Material wenigstens die Hälfte des darin gelösten gasförmigen Materials ohne nennenswerte Verdunstung von Wasser aus dem vegetativen Material freizusetzen, wobei das vegetative Material auf eine Temperatur von .etwa -10 C bis etwa 0 C gekühlt und das vegetative Material mit einer Geschwindigkeit von etwa 25 bis etwa 100 Zyklen pro Minute geschüttelt wird, wobei das Verfahren etwa innerhalb eines Tages nach dem Ernten des vegetativen Materials ausgeführt wird.