DD215319A1 - Verfahren zur anreicherung von interferonen - Google Patents
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Abstract
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine moeglichst proteasefreie Anreicherung von Interferonen unter industriellen Fertigungsbedingungen zu erreichen. Erfindungsgemaess wird zu einer Interferonloesung vorbehandelte hochdisperse Kieselsaeure gegeben. Nach einer Einwirkungszeit des Proteins auf die vorbehandelte Kieselsaeure von 1-20 h wird diese vom Ueberstand getrennt. Anschliessend wird die hochdisperse Kieselsaeure mit verschiedenen Pufferloesungen gewaschen, wobei verunreinigende Makromolekuele entfernt werden, an der sich die Elution des Interferons in Gegenwart von Kaliumthiocyanat bzw. Glyzerin bzw. Aethylengykol oder Tetraaethylammoniumchlorid in dem erwaehnten Trispuffer anschliesst.
Description
Schadow
Steinborn
Eichmann
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung von Interferonen.
Anwendungegebiet ist die Biochemie, speziell bei der Her· stellung von Präparaten hoher spezifischer Aktivität·
Zur Reinigung von Proteinen; sind Verfahren bekannt« die auf der Trennung nach dem Molekulargewicht der Molekülgröße bzw· der hydrophoben Wechselwirkungen zwischen Protein und Matrix beruhen· Hierzu benutzt man in den meisten Fällen Molekularsiebe (Sephadexe), die im Falle des <L -Interferons die Eigenschaft haben« solche Makromoleküle nach ihrer Größe zu trennen* (N. Fuchsberger: Acta biol. raed. germ. 38, (1979), 795-800)
Des weiteren sind Verfahren bekannt, die auf hydrophobe Wechselwirkung der Proteine mit substituierten Agarosemolekülen (z»B· Octyl- oder Phenyl-Sepharose) beruhen um damit die stark hydrophoben Proteine, wie beispielsweise das 4. -Interferon von den weniger stark hydrophoben Proteinen zu separieren· (S. Yonehava, 3. Biol. Chem. 256,8 (1981) 3770-3775) Dazu gehört auch die Anreicherung von Interferon mit Hilfe
der CPG-Glas-Säulenchromatographie. (3·Ε· Whitmann: Dm Interferon Res·1,2 (1981) 305-313; K.C. Chadka: Preparative Biochein. 11 (4), 1981 467-482; M. Wiranowska-Stewart; Mol. Immunol. 17 (5) (1980) 625-633; M. Rosenbergova: Acta virgl· 25 (1981), 31-35).
Auf anderen Wirkungamechanismen beruhen die Affinitätschromatographien, bei denen als Ligenden Polyribonukleinsäurereste bzw. Dextranmoleküle Verwendung finden. Die Methode der Hochdruckflüssigkeitechromatographie (HPLC1), kann ebenfalls fur die Trennung von Proteinen herangezogen werden, doch sind nur wenige Säulentypen zur Anreicherung hydrophober Proteine, wie z.B. das tlL-lnterferon geeignet. (D.S. Hobbs: 0. Biol. Chera. 257,8 (1982), 4071-4076; M. Rabenstein: Methods in Enzymol. 78, 464)
Nachteile dieser Verfahren sind einerseits die komplizierte Herstellung der Trägermaterialien, die geringe Ausbeute der gereinigten Proteine sowie die stark begrenzte Anwendbarkeit dieser Verfahren auf bestimmte makromolekulare Stoffe.
Andererseits sind Verfahren bekannt, die auf der unterschiedlichen Beweglichkeit der Makromoleküle in Acrylamidgelen unter dem Einfluß des elektrischen Feldes beruhen. Der begrenzende Faktor ist hier ebenfalls die Menge an Proteinen, die mit derartigen Methoden gereinigt werden können.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Anreicherung von Interferonen zu entwickeln. Das Verfahren soll ermöglichen, unter industriellen Fertigungsbedingungen Interferone ,die in geringen Konzentrationen vorliegen, anzureichern.
Erfindungsgemäß wird eine Interferone, z.B· t<L-Interferon enthaltende Lösung (2-lOOinl) mit einer Proteinkonzentra-
—15 —3 tion von IO -10 mol/1 im Batch- oder Säulenchromatographieverfahren mit 0,5-10 g vorbehandelter hochdisperser Kieselsäure (0,2-10 m /g) versetzt· Die Vorbehandlung der Kieselsäure erfolgt mit 2-50%iger heißer Salpetersäure und anschließendem Neutralwaschen·
Nach einer Einwirkungszeit der Interferonlösung auf die Kieselsäure von ca» 1-20 Stunden unter zirkulierenden Bedingungen wird die Kieselsäure abzentrifugiert und der Proteingehalt des.OberStandes bestimmt· Nach weiteren Waschungen mit einer Pufferlösung im pH-Bereich 6-8 wird das angereicherte Interferon durch 0,6-3,5 M KCN-Lösung bzw« 20-50%iges Glycerin bzw. Polyäthylenglycol oder 0,2-0,4 M Tetraäthylammoniumchlorid in einem Puffer pH 6-9 eluiert. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Interferon 10-100 fach angereichert·
Ein großer Vorteil des Verfahrens liegt darin, daß amn auch im Batchverfahren zu hohen Ausbeuten gelangt. Anschließend soll die Erfindung an einem Beispiel näher erläutert werden
Ausführungsbeispiel 2 ml einer interferohhaltigen Lösung mit einer Extinktion
Ε280β1""2 unc* einer Masse an pt-Interferon von lQpg bis 10 #ug, V wird zu 0,5-0,7 g vorbehandelter Kieselsäure gegeben. Man verwendet hochdisperse Kieselsäure vom VEB Chemiewerk Bad Köstritz, Die Vorbehandlung der Kieselsäure erfolgt durch:
1. Kochen in 5%iger Salpetersäure, lh
2. Neutralwaschen mit destilliertem Wasser
3. Waschen mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,2.
lierenden Bedingungen der hochdispersen Kieselsäure ausgesetzt. Nach Zentrifugation wird der Oberstand verworfen und das Kieselsäurepellet unter tnedium-zirkulierenden Bedingungen mit o«g· Phosphatpuffer so oft gewaschen, bis die Extinktion E280^O,05 ist« Danach wird die Kieselsäure mit 0,1 M Tris-Puffer pH 8,0 2-5 mal gewaschen. Die Elution des gebundenen hydrophoben Proteins 4»-Interferon erfolgt durch 2-4fache 3-60minütige Einwirkung von 0,25 M Tetraäthylammoniumchlorid in 0,1 M Tris-HCl-Puffer pH 3,0 unt&r mediumzirkulierenden Bedingungen. Der Nachweis der interferonspezifischen Aktivität und die Proteinbestimmung mit Fluram des dialysierten Elustes erbrachten eine 10-1GOfsehe Anreicherung des hydrophoben Proteins JL-Interferon sit einer Ausbeute von 60-80%.
2» Ausführungsbeispiel
2 ml einer proteinhaltigen Lösung mit einer Extinktion E280 = 1^2 uncl einer Masse anhydrophober Proteine, beispielsweise oC-lnterferon von 10 pg bis 10 ,ug wird zu 0,5 - 0,7 g .vorbehandelter hochdisperser Kieselsäure gegeben· Man verwendet aktiven Füllstoff Suprasil vom VEB Chemische Fabrik Fährbrücke Langenbach/Sa.
Die Vorbehandlung der Kieselsäure erfolgt durch: 1· Kochen in 5 %iger Salpetersäure, lh 2. Neutral waschen mit destilliertem Wasser 3· Waschen mit 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,2 Die proteinhaltige Lösung wird 3-12 h unter medium-zirkulierenden Bedingungen dem Suprasil ausgesetzt· Nach Zentrifugation wird der Oberstand verworfen und das Kieselsäurepellet unter medium-zirkulierenden Bedingungen mit o. g. Phosphatpuffer so oft gewaschen, bis die Extinktion E2SO ^ °*£'§ ist. Danach wird die Kieselsäure mit 0,1 M Trispuffer pH 8,0 2 -5 mal gewaschen· Die Elution des gebundenen hydrophoben Proteins o(-Interferon erfolgt durch 2 - 4fache 3 - 60minütige Einwirkung von 0,25 M Tetraäthylammoniumchlorid in 0,1 M Tris-HCl-Puffer pH 8,0 unter medium-zirkulierenden Bedingungen· Per Nachweis der interferonspezifischen Aktivität und die Proteinbestimmungen mittels Aminosäurenanalyse des Eluates erbrachten eine lOOfache Anreicherung des hydrophoben Proteins cC-Interferon mit einer Ausbeute von «**- 90 %.
Claims (1)
- ErfindungsanspruchVerfahren zur Anreicherung von Interferonen , dadurch λ gekennzeichnet ι daß im Batch- oder Säulenchromatographieverfahren eine interferone enthaltende Lösung vom pH 6-8 mit hochdisperser Kieselsäure« die zuvor mit heißer Salpetersäure gewaschen Und neutralisiert wurde, 1-2Oh unter zirkulierenden Bedingungen versetzt» anschließend die Kieselsäure abzentrifugiert, das angereicherte Interferon mit einer Pufferlösung gewaschen und mit Hilfe von Kaliumthiocyanat bzw. Glycerin oder Äthylenglykol oder Tetraäthylammoniumchlorid eluiert wird.
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