DD215537A1

DD215537A1 - Verfahren zur synthese von angiotensin i

Info

Publication number: DD215537A1
Application number: DD25049883A
Authority: DD
Inventors: Peter Henklein; Wolf-Rainer Halatsch; Annerose Klose; Hartmut Niedrich; Christina Grosse
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1983-05-02
Filing date: 1983-05-02
Publication date: 1984-11-14

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Angiotensin I (AT I) /1/ Asp-Arg-Val-Tyr-IIe-His-Pro-Phe-His-Leu /1/. Das neue Herstellungsverfahren besteht in der Verknuepfung des N-terminalen Tetrapeptids mit dem C-terminalen Hexapeptid. Als Tetrapeptid wird das Z-Asp(OBzl)-Arg(NO tief 2)-Val-Tyr-OH und als Hexapeptid H-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-ONb eingesetzt. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die pharmazeutische Industrie.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur HerBtellung von

Angiotensine (AT I),

Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-iieu /1/

das sich für den Einsatz in RIA-Kits eignet· Einsatzgebiet der Erfindung ist die pharmazeutische Industrie·· " ^; . .'. · * . ' .". · .. ^; .' ' ·

ι ' '. '· ' ' '·, ' ' ' . . .'

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Die Herstellung von·Angiotensins I ist bereits mehrfach beschrieben worden· Zum Einsatz gelangten sowohl Pestphasenmethoden (M·. C. Khosla et al», Med. Chemistry 20, (2) 315 (1977)) als auch klassische Verfahren in Lösung (Ή· Aoyagi, Bull. ChenuSoc· Japan 41, 433 (1968))· H· Aoyagi synthetisierte AT I aus zwei Fragmenten 5 +5, wobei zur Kondensation beider Fragmente die Azidmethode eingesetzt wurde· Beide Histidinreste wurden durch Benzylgruppen in der Imidazolseitenkette geschützt·

Beiden Verfahren wohnen eine Reihe von Nachteilen inne, die einen Einsatz für industrielle Synthesennient vorteilhaft erscheinen lassen (aufwendige Reinigung und oftmals schwierige Reaktionsführung)·

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein Dekapeptid der 'Formel;1 zu synthetisieren, das für den Einsatz in der RIA-Technik geeignet ist, das eine hohe Reinheit besitzt und dessen Synthese die Nachteile der angeführten Verfahren vermeidet·

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von Angiotensin I zu entwickeln· Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß Angiotensin I aus zwei Fragmenten 1 - 4 und 5 - 10 nach folgendem Schema aufgebaut wurde: .

Asp

Arg

VaI

OBzI -OPfp H

OBzI

ÖBzl

UO,

Tyr

lie

Boo Boo

OH H

OH

DCei/HOHB

His

Pro Phe

OH

Bo c Bo c

His

OH

Bo c

Bo c H-

H-

Bo c

^

blip

Buc / '

leu

H -j- leu OB

ONb

ONb ONb

ONb ONb ONb

ONb

ONb ONb

Ciir ornat ο gr aphi β

Das N-terminale Tetrapeptid wird dabei stufenweise, das C-terminale Hexapeptid durch Kombination der Fragmente 5 - 6, 7 i- 8 und 9 - 10 synthetisiert· Dabei wird das C-terminale Dipeptid erfindungsgemäß durch Aktivesterkupplung von Boc₂-His-ONp an leucin-p-'-nitrobenzylester (hergestellt nach Mc Laren, Austr» Jv Chem· 31« Cl978) 1865) in guten Ausbeuten erhalten· Nach Abspaltung der Boo-Schutzgruppen wird das Dipeptid entweder mittels Komplex ¹¹P'¹ (J* Kovacs und L· Kisfaludy,J· Amer. Chem· Sbc· JJi₄. (1967) 183) oder unter Verwendung von DCCI/HQNB mit dem Dipeptid Boc-Pro-Phe-OH zum Tetrapeptid Böc-Pro-Phe-His-Ieu-OiJb umgesetzt· Die Boc-Gruppenabspaltüng mit HCl in Eisessig ergab das dünnschichtchromatographisch einheitliche Tetrapeptiddihydrochlorid, das anschließend mit Boc-Ile-His-QH durch Anwendung von D C CI/HÖliB zum He xape pt id verlängert wurde· Zur Kondensation der beiden Hauptfragmente Z-Asp-Arg(NO₂)-Val-Tyr-OH und H-Ile-His-ProPhe^His-ieu-OIib wird Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI) und N-Hydrpxynorbornendicarboximid (HOWB) im Verhältnis 1 : 3 angewandt, um die Racemisierung möglichst gering zu halten· Durch die Wahl der Schutzgruppen, li-terminal Benzyloxycarbonylj, C-terminal p-Nitrobenzylester und Nitro- für die Argininseitenkette wird eine problemlose Abspaltung aller Schutzgruppen ermöglicht· Das so erhaltene ι Rohprodukt besitzt bereits einen hohen Reinheitsgrad und kann durch Chromatographie an Carboxylmethyl-Cellulose weiter gereinigt werden·

Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren an Beispielen erläutert:

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1: :. '< ' ';. . .. ,;.. ^ ; ·. BOC₂HiS-IeU-ONb (MG 603,658)

2,47 g H-Ieu-ONb'HCl (8 mMol) werden in 15 ml DMF gelöst, es werden 0,4 ml NMM addiert und auf +5 ⁰C abgekühlt. Danach gibt man 3,9 g BOC₂HiS-ONp dazu und rührt über Nacht* Aufarbeitung:

Das DMF wird abrotiert und das Öl in 30 ml Essigester aufgenommen. Die organische Phase wird bis zur Enffärbung mit

: " ' · .." ' ; . . ' ... , Λ . 5-, ././ ν

gesättigter Na«COo-LÖsung ausgeschüttelt· Danach wird mit NaCl/H₂O 2x gewaschen und die organische Phase über MgSÖ. getrocknet, Essigester wird abrotiert und der verbleibende ölige Rückstand mehrfach mit Hexan verrieben· Das halbfeste Produkt wird mit wenig -Äther^: versetzt und das weiße gelartige Produkt mit Hexan verrieben· Pp·: 92-94⁰C weißes Pulver ßj^f = -.7,59 °

Ausbeute: 4 g » 83 % c = 1 Methanol -

Beispiel 2; ' ',: ' " '·'''.' ['. . . : ' .' - ^;'

BOC-Pro-Phe-His-Leu-ONb (MG: 747,858)

1,73 g (4,78 mMol) BOC-Pro-Phe-OH wurden in 15 ml THP gelöst, 0,88 g (4,9 mMol) HONB hinzugegeben, auf 0 bis -5 ⁰C gekühlt, 1,1 g (5,39 mMol) DCCI addiert und 45 Min· in der Kälte und 30 Min· bei Raumtemperatur gerührt· Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wurde abgetrennt, mehrfach mit THP gewaschen und das mit den Waschlösungen vereinigte Piltrat am Rotationsverdampfer eingeengt· Das entstandene gelbliche öl wurde in 10 ml DMP aufgenommen und mit in 15 ml DMP gelöstem 2,19 g (4,59 mMol) H-His^Leu-ONb:aus dem DihydroChlorid - mit 1,51 ml (13,6 mMol) N-Methylmorpholin freigesetzt - versetzt· Die Reaktionszeit betrug 15 Std· bei Raumtemperatur· Die Reaktionslösung wurde filtriert und eingeengt· Das entstandene öl wurde in Essigester aufgenommen und nacheinander mit Natriumhydrogencarbonät, NaCl-gesättigter KHSO^,-Iösung und NaCl-gesättigtem Wasser ausgeschüttelt· Die Essigesterphase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, eingeengt und das verbliebene öl mit Hexan fest «,ge rieben· Ausbeute: 3 g 88,2 # Pp.: 129 - 32 ⁰C focj |.³ = - 38,06

(c = 1, DMP) DC: (A) S3 einheitlich R_p - 0,71,

SBN: Rj₁ = 0,71

BAW: Hj₁ = 0,66 einheitlich

Beispiel 3; , .'.;;- ,·: ;..' · ' :' } ' : . ^;. \ - ',;^:': ' ^; .' ^; BOC-IIe-HiS^PrO-PhB-HiS-LeU-ONb (MG: 998,124) ·

530 mg (1,5 mMol) BOC-Ile-His^OH und 225 mg (1₅65 mMol)

^: · .. ^;-:' ^: . - '' · . -· ^; ·,. - ' ', . ' : ·'.,

HOWB wurden in 10 ml ΦΗΙ¹ gelöst, auf - 5 ⁰C gekühlt, mit 309 ing (1,5 tDMol)l)GCI versetzt und 45 Min* "bei dieser Temperatur nach.gerünrt· Nach dem Abtrennen und mehrmaligem Waschen des Harnstoffs wurden die mit dem Piltrat vereinigten Waschlösungen eingeengt und das verbleibende öl in 10 ml XlIiF aufgenommen und mit 872 mg (1>35 mMol) H-Pro-Phe-His-LeU-ONb x 2HCl versetzt und 0,45 ml (4 mMol) N-Methylmorpholin addiert« lach 18 Std · Rühre Ja bei Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung am Rotationsverdampfer eingeengt, das verbleibende öl in Chloroform aufgenommen und nacheinander mit NaCl-gesättigter EHSO.-, WaHCO₃-Losung und WaClgesättigtem Wasser ausgeschüttelt· Wach dem Trocknen über MgSO. wurde eingeengt und das verbleibende Öl mit Hexan festgerieben· Röhausbeute: 1,09 g(74 #) Pp.: 160 - 63 ⁰C ß*J |⁴ = > 47,58

Die Substanz zeigte im DC (B) neben einem kräftigen Hauptfleck noch zwei Webenflecken·

Beispiel 4: ' _:; . . .·. . .. . . . ; · . Ile-His-^ro-Phe-His-Leu-Oilb χ 2HCl (MG: 1007,405) 889 mg (0,89 mMol) BÖC-Hexapeptid wurden in; 10 ml 3 W HCl/ AcOH gelöst und 40 Min· gerührt· Wach 35 Min· war die BOC-Abspaltung laut DC in S 3 vollständig. Die Reaktionslösung wurde in 40 ml iSther gegossen, der ausgefallene flockige Wiederschlag abgetrennt und mehrfach auf der Pritte mit Ether verrieben· Wach kurzer Lufttrocknung erfolgte die Entfernung des rest!· Lösungsmittels über EOH u· P₃O₅ im Vakuum«

Ausbeute: 760 mg(84 # )

Pp, j 168 - 70 ° pxj ψ = - 35,03 (c = 1,

. -.·; ' . -;-^: .· ' .,· Λ ...' . MeOH)

DC: (B) BAW Rj₁ =0,64

Beispiel 5: .

Z-Asp(0Bzl)-Arg(N0₂)-Val-Tyr-0H (MGs 820,83) 1,43 g (4 mMol) Z-Asp(0Bzl)-0H werden in 15 ml OJHP gelöst* mit 920 mg (5 raMöl)Pentafluorphenol versetzt und auf - 5⁰C gekühlt· Wach der Zugabe von 825 mg (4 mMol) DCCI wurde ·

30 Min· bei dieser Temperatur und 20 Min· bei Räumtempera-f tür nachgerllbxt· Der gebildete Harnstoff wird abgetrennt, gewaschen, die Waschlösungen .mit dem Piltrat vereinigt und eingeengt· Das entstandene öl wurde in 20 ml DMF aufgenommen und mit 2,75 g (5 mMol)H-Arg(N0₂)-Val-Tyr-0H x 1,16 HBr in 10 ml DMP unter Zusatz von 1,35 ml (2,2 mMol) N-Methylmorpholin versetzt und 5 Std· bei Raumtemperatur gerührt. (Der pH-Wert muß bei pH 7 - 8 liegen)· Die lösung wird filtriert und bis auf ca· ¹/3 des ursprünglichen Volumens eingeengt und iii eiskalte 1 N HCl (HaCl gesättigt) getropft· Der entstandene weiße Niederschlag wird abgetrennt, mehrfach mit Wasser gewaschen, an der Luft und anschließend im Vakuum über KOH und ^₂ ⁰S setrocknet·

Ausbeute: 3,09 g(94 %)

DC: (A) einheitlich in S3 &J ψ = - 3,74

Beispiel 6:

Z^Asp(OBzl)-ATg(HO^Val-Tyr-Ile-Hi s-Pro-Phe-His-Leu-OHb

(MG: 1700,895)

780 mg(0,95 mMol) Z-Asp(OBzl)-Arg(HO₂)-Val-Tyr-OH und 292 mg (1,35 mMol) HONB in 5 ml DMP gelöst, auf - 5 ⁰C gekühlt und 247 mg (1,2 mMöl) DCCI addiert·' Anschließend wurde auf Raumtemperatur erwärmt und 4 Std· nachgerührt· Dann wurden 850 mg (0,84 mMol) H-Ile-His-Pro-Phe-His-leu-ONb χ 3HCl und 0,36 ml (3,36 mMol) N-MethylmoTpholin in 5 ml DMP hinzugefügt und über Nacht gerührt. Die lösung wurde am Rotationsverdampfer etwas eingeengt und in Essigester gegossen, der ausgefallene Peststoff abgetrennt und mit K₂CO--Lösung gewaschen· Der etwas schmierige Peststoff wurde aus Ethanol umkristallisiert·

Ausbeute: 1,22 g (86 #)

Pp«: 163 - 65 ⁰C

Pp·: 178 - 80 ⁰C (nach ümkristallisation) DC: (A) vor der Ümkristallisation aus Ethanol, BAW Py Rp = 0,81 einheitlich

· - ^; . ' ' . ' . . .· -:, ' ' · ' . .· ; .' 8

;:. . ;. ·; > , ^; ..: . ;;. ·.;. .· . / . β

BAW R-, S 0,51 = Haupt fie ck, R-, = 0,8 = Nebenfleck

SBJJ '. Rji ~ 0,56 = Hauptfleck, Rj, = 0,32 = Nebenfleck Anfärbung mit Pauly-Reagenz und TDM

Ausbeute nach ümkristallisation: 1,07 g (75 ^)

Beispiel 7: /. .' ' ' : ; ' [: ' ' " ' ' ..·. : ^: . . ' .·. H-Asp-Arg-Val-Ty^-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-OH χ X HOAc χ

Y H₂O (MG: 1296,97) ;

760 ing (0,45 inMol) geschütztes Dekapeptid wurde in 10 ml Hydrierlösung (MeOH/AcOH/HgO; 3:3i1) gelöst, mit 135mg frisch hergestelltem Pd-schwarz-Katalysator versetzt und unter dem Wasserstoffstrom gerührt (Verhältnis Schützgruppen : Katalysatormenge 100 mg/mlol)· Hach 24 Std· wurde der Katalysator abzentrifugiert und die Reaktionslösung weitere 21 Std. mit frischem Katalysator hydriert· Nach Abtrennen des Katalysators wurde die Lösung eingeengt und der ölige Rest mit Ethanol festgerieben und aus Methanol umkristallisiert.

Ausbeute: 401 mg (70 ^) DC: (A) SBET R^ = 0,24 Haupt fleck j

r_ β 0,32 und 0,36 zwei schwache Nebenflecken BAWPy R_x.,as 0,76 keine Nebenflecken

Beispiel 8:

purchführung der Chromatographie

Ca. 1 g Rohprodukt wurden in 5 ml Startpuffer gelöst und unlösliche Bestandteile abzentrifugiert· Nach dem Auftragen wird mit einem linearenGradientenvon 0,01 bis 0,1 N NH.OAc bei pH 6 eluiert· Substanz wurde bei einer Ionenstärke von ca« 0,08 N NH.OAc eluiert· Die Extinktion des Eluats wird bei 252 nm über einen üvioord ΊΙ verfolgt· Die entsprechenden Fraktionen wurden über DC kontrolliert und selektiert. Nach zweimaliger Lyophllisierung (zur vollständigen Entfernung des NH.OAc) wurden aus verschiedenen Ansätzen 500 bis 700 mg AT I isoliert* Es wurde eine Säule 2,8 χ 40 em benutzt. Die laufgeschwindigkeit betrug 50 ml/h·

Re chromat ο graphische Kontrolle an CMtJ (250 mg) ergab einen einheitlichen symmetrischen peak und 230 mg AT I·

Substanzcharakteristik: —

H-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile^HiB-Pro-Phe-His-Leu · X GH₃COOH ·

X = ca. 2 Y = 5—8

Mo!masse 1296,97 für 10Q#iges Peptid

weißes lyophilisat, geruchlos, leicht löslich in Wasser,

eine 0,1 m Lösung ist farblos Schmelzbereich 248 > 258 ⁰G 7

Optische Drehung ß<J |³ == 46,6 ° c = 1 in 0,05 M Essig-

.-.·. ' " ' ^; . - .'. ·. '" " '·" ' säure ·' ^;, ..DS~Chromatographie einheitlich in " SBN Rf =0,2 -0,3 -^y'-^:-\ :" / "' BAW Py Rf =0,7 - 0,8

Verwendete Abkürzungen

AT I	Angiotensin I
BAW	Butanol/Elsessig/Wasser
Boc/BOC	tert#-Buty!oxyearbonyl
CMC	Carboxymethylcellulose
BCCI	Dlcyclöhexylcarbodiimid
DMP .'. . ^:	Dimethylformamid
HOHB	liI-Hydroxy-5-norbornendicarboximid
MM	N~Methylmorpholin
-ONI)	- litrobenzylester <
-ONp	^:.,'- Jfitroptienylester
THP	- Tetrahydrofuran
SBlT -	sek» Butanol/3 ¹^ Ammoniak
Z . .: '	BenzyloxyoarbOnyl

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Angiotensin I /1/, dadurch gekennzeichnet, daß man das N-terminale Tetrapeptid Asp-Arg-Val-Tyr mit dem Hexapeptid Ile-His-Pro-Phe-His-leu kondensiert.

Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His^Pro-Phe-His-Leu /1/

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Tetrapeptid das Z-Asp(OBzI)-Arg(NO₂)-Val-Tyr-OH und als Hexapeptid das H-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-ONb eingesetzt wird. ; ·. ,.-. ^: .. "' ,. ' . ..''.. ' \' " ..·.;

3· Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hexapeptid Verwendung findet, das durch Kombination der Fragmente His-LeU, Pro-Pheund Ile-His dergestalt synthetisiert wird, daß H-His-Leu-OWb und Boc-Pro-Phe-OH zum BOc-Pro-Phe-His-Leu-ONb umgesetzt werden und da- * raus nach Abspaltung der Boc-Gruppe das C-terminale Hexapeptid durch Verknüpfen mit Boc-Ile-His-OH gewonnen wird.

4. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein C-terminales Dipeptid His-Leu Verwendung findet, das aus Bocg-His-Olip und Leucin-p-nitrobenzylester, vorzugsweise durch Aktivesterkupplung, gebildet wird.

5· Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fragmente 1 - 4 unä 5 - 10 unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid und JJ-Hydroxynorbornendicarboximid im Verhältnis 1 : 3 kondensiert und danach die Schutzgruppen abgespalten werden.