DD216023A5

DD216023A5 - Verfahren zur herstellung von a-ristomycin und/oder ristomycin-derivaten hoher reinheit

Info

Publication number: DD216023A5
Application number: DD83255014A
Authority: DD
Inventors: Kalman Rak; Zoltan Boda; Rezsoe Bognar; Ferenc Sztaricskai; Gabriella Zajka
Original assignee: Reanal Finomvegyszergyar
Priority date: 1982-09-21
Filing date: 1983-09-21
Publication date: 1984-11-28
Also published as: ATA335983A; HU186121B; FI76090B; NO166790B; FI833388A7; FI833388A0; CS688183A2; AT381709B; FI76090C; NO166790C; DE3334170A1; NO833396L; CS268796B2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von A-Ristomycin und/oder Ristomycin-Derivaten fuer die Anwendung zu Thrombocytenaggregationsversuchen zur Diagnostisierung der Willebrand-Krankheit. Ziel der Erfindung ist die Herstellung von A-Ristomycin in geeigneter Konstitution und hoher Reinheit. Erfindungsgemaess werden A-Ristomycin und/oder Ristomycin-Derivate der allgemeinen Formel (I) hergestellt, worin beispielsweise bedeuten: R ein Wasserstoffatom, R tief 1 eine O-alpha-D-Araf(1 -> 2)-O-alpha-D-Manp(1 -> 2)-O-alpha-L-Rhap)-(1 -> 6)-O-beta-D-Glop-Gruppe, R tief 2 eine 2, 3, 6-Tridesoxy-3-amino-(NHY)-alpha-L-ribo-hexapyransyl-Gruppe, R tief 3 eine alpha-D-Mannopyranosylgruppe, R tief 4 eine 1-4 Kohlenstoffatome enthaltende Alkylgruppe, X den Rest einer Mineralsaeure, Y ein Wasserstoffatom.

Description

-Y- Berlin, 9. 2. 1984 AP C Ο? D/255 014/2 62 997 18

Verfahren zur Herstellung von A-Ristomycin und/oder Ristomycin-Derivaten ;

Anwendungsgebiet der Erfindung

i '

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von A-Ristomycin und/oder Ristomycin-Derivaten* Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein biologisches Reagens zu Thrombocytenaggregationsversuchen, das das erfindungsgemäß hergestellte A-Ristomycin enthält, welches insbesondere zur Diagnostisierung der Willebrand-Krankheit angewandt wird, und ein Verfahren zur Herstellung desselben· .- ''

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß bei der Reihenuntersuchung von hämophilen Kranken in der Beurteilung der Blutplättchenfunktionen die meist wertvollen Angaben durch die Thrombocytenaggregationsversuche geliefert werden· Heben den routingemäß verwendeten Aggregationsmitteln (z. B. ADP, Adrenalin, Kollagen) spielt seit 1971 die als Ristocetin genannte, vorher als Antibiotikum verwendete Substanz eine wichtige Rolle* Auf Grund der Versuche von Howard und Firkin ermöglichte das Ristocetin die schnelle und einfache Erkennung der mitgebrachten Hämophilie, der Willebrand-Krankheit (Thrombosis und Diathesis Haemorhagica 26, 362 (1971)). ,

Das Wesen der Willebrand-Krankheit ist der Defekt des VIII. Paktorkomplexes der Blutgerinnung. Die wichtigste biologische Rolle des Willebrandfaktors besteht in der Förderung der Thrombocytenadhesion zu den sub endo the Ii al en Formeln. Der Mangel oder qualitative Störung des Willebrandfaktors ruft

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; ' ' ' .. '. - 2 - . . . . .

das als Willebrand-Krankheit genannte Krankheitsbild hervor, welches die verbreitetste Form der angeborenen Hämophilie darstellt· Es ist sehr wichtig, den an Willebrand-Krankheit leidenden Kranken zu separieren (Vererbung, Familienversuche, Therapie);. Die Aufklärung und Absonderung eines derartigen Krankheitsbildes vor dem operativen Eingriff ist besonders von grundlegender Wichtigkeit. ,

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß das in der laboratorisohen Praxis verbreitet verwendete Eistocetin durch ein anderes Mitglied der Vancomyein Antibiotik-Familie - das Ristomycin - vollständig ersetzt werden kann. Das Ristomycin kann einfacher und billiger hergestellt werden und verhält sich in der Plasmaprpteinpräcipitation günstiger* Auf Grund der obigen Eigenschaften hat sich das Ristomycin in hämatölο-gischen Versuchen als günstiger erwiesen. Das bisher zur Behandlung von durch antibakterielle Infektionen hervorgerufenen Krankheiten verwendete Ristomyein kann auch an diesem neuen Anwendungsgebiet (für diagnostische Zwecke) eingesetzt werden. . .

Sowjetische Forscher isolierten das Ristomycin-Antibiotikum aus Kulturen von Proactinomyces fruetiferi var. ristomycini durch Adsorption (vorteilhaft auf einer SzDSz-3 oder SzD7-3 Kationenaustauschersäule) und Eluieren mit einer acetonisehen Ammoniaklösung oder einem Ammoniumacetatpuffer (pH = 9 - 10). Das'Ristomycin wurde in Form der Base isoliert. Später wurde Ristomycin - ähnlicherweiae wie Ristocetin - in zwei biologisch'aktive Komponenten - in das A- und B-Ristomycin - aufgetrennt. Die Erzeugung des Antibiotikums im Betrieb in hohen Maßstäben wurde ebenfalls offenbart. Zur Bestimmung des. Wirkstoffgehaltes der Fermentationsbrühe und der inter-

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mediären Zwischenprodukte wurde neben der biologischen Wertb,eStimmung auch ein polarimetrisches und UV-spektrophotometrisches Verfahren ausgearbeitet (SU-PS 180 754; Antibiotika 8, 392 (1962); Antibiotika jj>, 884 (1964); Antibiotika 10, (1965); Antibiotiki 12, 129 (19'67); Antibiotiki 16, 786 (1971)).

Nach der Bestimmung der genauen Struktur des A-Ristomyeins (J. 0rg„, Chem, 21* 2971 (1974); J. Antibiot, ^2, 446 (1979); Tetrahedron Letters 21., 2983 (1980); JACS JKD2, 7093 (198O)) haben wir versucht aufzuklären, in welchem Maße und inwieweit die Änderung der Struktur der Verbindung bzw« der Reinheitsgrad der Verbindung die Thrombocytenaggregation beeinflussen.

Ziel der Erfindung ,

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Ristomycin und/oder Ristomycin-Derivaten, die für Thrombocytenaggregationsversuche zur Diagnostisierung der Willebrand-Srankheit geeignet sind. , .;.· .

Darlegung des Wesens der Erfindung .

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von A-Ristomycin in hoher Reinheit zur Verfügung zu stellen« , '

Erfindungsgemäß werden Ri-stomycin und/oder Ristomycin-Derivate der allgemeinen Formel (I)

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R-I-O

IJHY

hergestellt, worin

(I)

R ein Wasserstoffatom ist,

R₁ eine O-alpha-D-Araf (1—· 2)-0-alpha-D-Manp(1 ~" 2)-0-

-(alpha-L-Rhap)-(i-* 6)-0-beta-D-Qlop-Gruppe bedeutet,

, 62 997 18

R₂ eine 2,3» 6-Tridesoxy-3-amino-(HHY) -alpha-L-ribo-hexapyranosyl-Gruppe darstellt, ' , .

R, eine alpha-D-Mannopyranosylgruppe. ist,

R, eine 1 - 4^ Kohlenstoffatome enthaltende Alkylgruppe bedeutet, . .

Σ den Rest einer Mineralsäure darstellt., ;

Y ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe der ,allgemeinen Formel C(Z),-(CH₂^-CO- bedeutet, worin Z ein Wasserstoff atom oder ein Halogenatom ist und η für eine ganze Zahl zwischen 0 und 5 steht.

Es wurde festgestellt, daß die. partielle oder vollständige Entfernung der in der allgemeinen Formel (I) vorkommenden R.., Rp, Ro und R, Gruppen bzw· die Blockierung der Hydroxyfunktionien dieser Gruppen und der R-Gruppe (in Form eines Esters oder Äthers) unerwünschte biologische ?/irkungen des Antibiotikums und in manchen Fällen auch eine ungünstige Änderung der Lösbarkeit zur Folge haben· Das durch Ersetzen der R,-Gruppe durch ein Wasserstoffatom erhaltene Carboxy-A-ristomycin übt keine, das humane Thrombocytenplasma aggregierende Wirkung aus und hemmt die durch Ristomycin induzierte Thrombocytenaggregation nicht» Das an den phenolischen Hydroxygruppen blockierte tetra-O-Methyl-A-ristomycin-Derivat (R=R₄=CHo) besitzt ebenfalls ungünstige Eigenschaften· Das peracetylierte A-Ristomycin ist unter den bei den Versuchen verwendeten Bedingungen unlösbar und zum Zweck der Versuche ungeeignet. Obwohl das durch Sliminierung der Kohlenhydrate erhaltene Aglyco-A-ristömycin (R=R^=R₂=IRo=Y=H; R=CH-) eine Agglutination hervorruft, ist dieses Derivat wegen der pH- und Lösbarkeitsverhältnisse ebenfalls nicht optimal, üach unseren Kenntnissen ist auch das B-Ristomycin

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(diese Verbindung unterscheidet sich von den anderen Derivaten nur darin, daß in der allgemeinen Formel (Γ) in der He- terotetrasaccharidlcette von R... der 2-0-D-Arabinofuranosylalpha-D-manno-pyranosyl Anteil fehlt) zum gewünschten diagnostischen Zweck ungeeignet.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß der'im.-Blutgerinnungstest verwendete Wirkstoff dann und nur dann optimal ist, falls er eine hohe Reinheit und eine genau definierte Struktur der allgemeinen Formel (I) aufweist. Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I), in welchen Y für Wasserstoff oder CF.,-CO- steht, sind in hoch reiner Form- für laboratorische diagnostische Zwecke günstig geeignet,

Es wurde auf Grund der obigen'Erkenntnisse festgestellt, daß die zur_vAusübung der normalen humanen iPhrombocytenaggregationerforderliche grundlegende Bedingung darin besteht, daß in der allgemeinen Formel I vier freie phenolische Hydroxygruppen (E=H), die C-tenninale Methozycarbonylgruppe (R.=CHO und die unberührte Ristotetro.syl (=R-) Seitenkette vorhanden sein müssen.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß A-Ristomyein hoher Reinheit und dessen unter die allgemeine Formel fallenden Derivate zur Durchführung von durch A-Ristocetin indu-zierten Ihrombocytenaggregationsversuchen ausgezeichnet geeignet sind (Abbildung 1). .

Bei unseren Versuchen wurden unter Anwendung von sechs verschiedenen PRP- (an Thrombocyten reiches Plasma) Citrat und ED(TA-(Äthylendiami.ntetraessigsäure) PRP und Durchschnittswertbehandlung die Punkte der an der Abbildung 1 illustrier-

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ten Kurve erhalten· Die Kurven zeigen einen ähnlichen Verlauf und enthalten drei voneinander gut abtrennbare Abschnitte· Bei einer geringeren Konzentration (0,8 mg/ml) wird keine Agglutination festgestellt. Im Bereich von 0,8 - 2,0 mg/ml kann ein linearer Zusammenhang beobachtet werden· Bei Konzentrationen über 2,0 mg/ml verlaufen die Dosenkurven in Richtung der oberen Wertspitze. Bei weiterer Erhöhung der Dose wird die Plasmaproteinpräcipitation ein immer stärker störender Paktor. Unter Anwendung von Citrat und SDTA-PRP als Substrat werden identische Ergebnisse erhalten. ^Λ

Es wird auf der Abbildung 2 gezeigt, daß Ristomycin zur quantitativen Bestimmung des VIII R:Ag-Kofaktors sehr gut eingesetzt werden kann. Die.sog. Ristocetin-Kofaktor-Assay-Versuche dienen zur Messung des sich in der Willebrand-Krankheit ergebenden Plasmafaktordeficits (J. Clin. Invest. %2, 2708 (1973);Thromb. Diath. Haemorrh. 2£, 306 (1975)). Unsere Ergebnisse zeigen, daß das Ristomycin zum Zweck der quantitativen Versuche ebenfalls ausgezeichnet geeignet ist und der Ristocetin-Kofaktor und Ristocetin-Kofaktor-Assay-Versuch durch den Ristomycin-Kofaktor bzw. Ristomycin-Kofaktor-Assay-Versuch ersetzt werden können. Die Bestimmung des Ristomycin-Kofaktors kann unter Anwendung von sowohl mit gewaschenen (Abbildung 2, obere Kurve) als auch mit Formalin behandelten (Abbildung 2, unter Kurve) Thrombocyten durchgeführt werden« Das Ristocetin und Ristomycin rufen bei höheren Konzentra- '. tionen eine Plasmaproteinpräcipitation hervor. Die bei den Werten zwischen 1,5 und 3»5 mg/el erhaltenen Ergebnisse werden in der Tabelle 1 zusammengefaßt. _x :

0,01	0,01
0,07	0,20
0,15	0,55
0,66	2,02

62 997 18 - 8 Tabelle 1

Konzentration Liehtabsorption (gemessen bei 600 mn) (mg/ml) Ristocetin Ristomycin

Es ist in der obigen Tabelle ersichtlich, daß mit den erfindungsgemäß verwendeten Ristomycin stets höhere Absorptionswerte erhalten werden als mit dem Ristocetin«

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die Grundbedingung der Zuverlässigkeit der erfindungsgemäßen Versuchsmethode darin liegt, daß das zum Versuch verwendete Reagens eine hohe Reinheit aufweisen und A-Ristomycin bzw. dessen Derivat mit konstantem Wirkstoffgehalt enthalten soll* Dieses Phenomenon läßt sich wahrscheinlich auf die Tatsache zurückführen, daß, obwohl Ristocetin und Ristomycin ähnliche antibakterielle Wirkung ausüben, die Mikroorganismen, welche diese Verbindungen erzeugen, sehr unterschiedliche Eigen-.schäften besitzen· In Abhängigkeit von der Zusammensetzung des.Hährbodens und der Stoffwechselvorgänge der Biosynthese können ganz verschiedene Verunreinigungen gebildet werden, auch wenn die Aufarbeitung identisch ist. Es ist weiterhin bekannt, daß in der Kulturbrühe der Mikroorganismen Nocardia lurida URRL 2430 und Proactinomyces fruetiferi var» ristomycini je zwei biologisch aktive Komponenten erzeugt werden. Verwendet man das Antibiotikum als antibakterielles Heilmittel, stört die Gegenwart der B-Komponente im A-Ristomycin

~c τ; o ο

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nicht, da gegen patogene Mikroorganismen beide Wirkstoffe wirksam sind« Die B-Komponente weist sogar eine wesentlich höhere baktericide Wirkung als die Α-Komponente auf.

Im Gegensatz zu dem Obenangeführten ist jedoch bei der Anwendung der beiden Antibiotika zu hämatologischen Versuchen nur die Α-Komponente wertvoll. Die Artikel von Jenkins und Mitarbeiter (Thromb. ßes. 7, 531 (1975)) weist auch auf diese Tatsache hin« Diese Autoren haben gefunden, daß das B-Eistocetin die normalen Ihrombocyten nicht aggregiert·

Es ist bekannt, daß unter den alkalischen Bedingungen der Fermentation und der Ionenaustauscherreinigung beide Ristomycinmoleküle einer Zersetzung untergehen können· Zur Klärung dieser Vorgänge wird als Mode11verbindung das Carbosy-A-ristomycin hergestellt· Es wurde gefunden, daß diese Verbindung das normale humane Thrombocytenplasma nicht aggregiert und die durch A-Ristomycin induzierte Aggregation nicht hemmt. Dies bedeutet, daß die unter Einwirkung von Alkali stattgefundene Hydrolyse der C-terminalen Methoxycarbonylgruppe des sehr empfindlichen Glykopeptidmoleküls (und die evtl. darauffolgende Retroaldolspaltung an beiden beta-Hydroxyphenylserin-Einheiten) das A-Ristomycin-Präpa-¹ rat zu hämatologischen Zwecken vollständig wertlos und unanwendbar machen kann. Uach unseren Erfahrungen kann das A-. Ristomycin von diesen unerwünschten Begleitstoffen mit Hilfe der bei den bekannten Methoden verwendeten wäßrig-alkoholischen Umkristallisierung nicht befreit werden· .

Es sei noch darauf hinzuweisen, daß die-Ristomycinbase äußerst hygroskopisch ist« Diese Verbindung kann bei Stehenlassen an der Luft innerhalb von einigen Minuten mehr als

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15 Gew#-% feuchtigkeit aufnehmen (auf das Gewicht der Base bezogen)· Deshalb ist es fast unmöglich, aus diesem Präparat eine genaue Einmessung durchzuführen« Es wurde gleichzeitig überraschenderweise gefunden, daß die Aggregationsaktivität der A-Rystomycin-Müster während des in alltägiger laboratorischer Präzis üblichen, mit Phosphorpentoxyd durchgeführten Trocknen eine irreversible Schädigung untergehen«

Es ist zweifellos, daß bei der Isolierung des Antibiotikums . zur Sachweisung der eventuellen Begleitmittel und Verunreinigungen (nämlich der B-Komponente und der durch alkalische Zersetzung gebildeten verschiedenen Produkte) die bisher verwendeten Meßmethoden allein nicht ausreichen (bekannte Testmikroorganismen verwendende biologische Methode; UY-spektrophotometrisehe ?/irks to ff be Stimmung; Messung des optischen Drehvermögens). Die Begleitstoffe weisen nämlich bei 280 nm ebenfalls eine UY-Licht-Absorption auf und besitzen ein optisches Drehvermögen, ähnlicher Richtung»

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden A-Ristomycin und/ oder Ristomycinderivate der allgemeinen Formel (I) hoher Reinheit so hergestellt, daß man aus roher Ristomycinbase eine 30- bis 50 %lge wäßrige Lösung herstellt und der pH-Wert dieser Lösung mit einer Mineralsäure, vorteilhaft mit verdünnter Schwefelsäure, zwischen 6,7 und 7,0 .- vorteilhaft auf 6,8 - einstellt; oder den pH-Wert einer wäßrigen, übrigens mit den obigen Lösungen identischen Lösung von verunreinigtem A-Ristomycin-monosulfat mit einer Alkalilösung vorteilhaft mit Ammoniumhydroxyd - zwischen 6,7 und 7 einstellt. Die Lösung ,wird'danach bei Raumtemperatur mit einer· Menge von 20 bis 50 % (Yol»/Yol) eines mit ?/asser vermischbaren niedrigen Carbonsäurenitrile - zweckmäßig Acetonitril -

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behandelt. Das A-Ristomyein wird bei 4 ⁰C kristallisiert, die Kristalle werden abgetrennt, gereinigt und gegebenenfalls in einem organischen Lösungsmittel - zweckmäßig in einem 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthaltenden Alkanol - gelöst und darauffolgend bei 0 bis 20 ⁰C "mit einem Acylierungsmittel des Säureanhydridtyps - vorteilhaft mit Trifluoressigsäureanhydrid - acyliert. Das erhaltene Produkt - oder die erhaltenen Produkte - wird (werden) isoliert.

Das so erhaltene A-Ristomycin oder dessen Derivat wird in einer wäßrigen Pufferlösung - vorteilhaft in einer-wäßrigen Lösung von tris-Hydroxyaminomethan - gelöst. Das so hergestellte Reagens ist zum Zweck der Thromboeytenaggregationsversuche - insbesondere zur Diagnostisierung der Willebrand-Krankheit - geeignet.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird aus der nach bekannten Fermenta ti ©^verfahren hergestellten rohen Ristomycinbase durch Auflösen in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur eine 30 bis 50 %ige Lösung hergestellt. Danach wird der pH-Wert dieser Lösung mit einer Mineralsäure - zweckmäßig mit verdünnter Schwefelsäure - zwischen 6,7 und 7,0 eingestellt. ,

Als Ausgangsstoff kann auch rohes A-Ristomycinsulfat eingesetzt werden. In diesem Palle wird nach dem Auflösen der gewünschte pH-Wert durch Zugabe einer verdünnten Alkalilösung, vorteilhaft Ammoniumhydroxydlösung, eingestellt. Die Einstellung des optimalen pH-Wertes kann mit Hilfe von Instrumentenmessung oder vorteilhaft bei Umschlagen eines Bromthymolblauindikators von gelb in himmelblau durchgeführt werden« Der so vorbereiteten Lösung wird eine Menge von 20 bis 50 % (Vol./YoI.) eines mit Wasser vermischbaren Alkylnitrils,

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vorteilhaft Acetonitril, zugegeben, worauf die Kristallisierung beginnt.

Bei der Kristallisierung eines Rohproduktes höherer Reinheit kann man auch so verfahren, daß man der auf die oben angegebene Weise hergestellten wäßrigen A-Ristomycinsulfat-Lösung zuerst 15 bis 50 % (Vol./Vol.) Acetonitril zufügt, danach den pH-Wert zwischen 6*7 und 7,0 einstellt, die opaleszente Lösung bis Auflösen erwärmt und langsam auf Raumtemperatur abkühlen läßt. - ' .

Die gewünschten Kristalle werden auf dem Filter mit Aceton gewaschen und darauffolgend im Vakuumexsikkator über erhitztem Kaliumchlorid und Paraffinspänen bis Gewi ent skonstanz getrocknet. Uach diesem Verfahren wird das eine ausgezeichnete Aggregationsfähigkeit aufweisende, nichthygroskopische, kristalline A-Ristomyein oder dessen Sulfat hoher Reinheit mit einer Ausbeute von 60 bis 80 % erhalten (in Abhängigkeit vom Wirkstoffgehalt des Ausgangsstoffes)·

Hach einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das rohe A-Ristomycin in einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise in einem Alkanol, gelöst bzw. suspendiert, worauf ein Acylierungsmittel (z. B. Trifluoressigsäureanhydrid) tropfenweise zugegeben 'wird. Das Rohprodukt kann erwünschtenfalls durch Umkristallisierung gereinigt werden. . .

Das erfindungsgemäße Reagens enthält ein nach dem obigen Verfahren hergestelltes, standardisiertes, hochreines, Gewichtskonstanz aufweisendes und stabiles Ristomycin oder Ristomycin-Derivat* Das erfindungsgemäße Reagens (AGGRISTEJT) ent-

C? O ρ O "C O C " O Q *·

. - 62 997 18

hält vorzugsweise Doseneinheiten von 15 mg· Die.freien phenolischen Hydroxygruppen des Reagens können jedoch bei längerer Lagerung in.Anwesenheit des Luftsauerstoffes und unter Einwirkung des Sonnenlichtes eine für die Thromboeytenaggregation ungünstige chinoidale Struktur aufnehmen« Diese Änderung wird durch eine langdauernde (40 Stunden) UY-Be1euchtung des festen Präparats bestätigt« Unter Berücksichtigung des Obenangeführten soll das erfindungsgemäße Reagens zum Hämophilie-Diagnostik-Kit in aus braunem Glas hergestellten und hermetisch abgeschlossenen'Phiolen fertiggestellt werden«

Die wichtigsten Vorteile der vorliegenden Erfindung können folgendermaßen zusammengefaßt werden:

1« Uach dem erfindungsgemäßen Verfahren können in Blutgerinnungstesten ausgezeichnet verwendbare Verbindungen der ' allgemeinen Formel (I) hoher Reinheit hergestellt werden«

Ί -

2« Das erfindungsgemäi3e Reagens kann in quantitativen Blutplasmaversuchen mit großem Erfolg eingesetzt werden und , sichert ein günstigeres Messungsinterval als die bekannten Mittel und Methoden, '

3. Das erfindungsgemäße Reagens ist verhältnismäßig stabil, sein Gewicht ist konstant, kai werden und ist gut lagerfähig.

sein Gewicht ist konstant, kann bei 100 ⁰C sterilisiert

Unsere Stabilitätsversuche zeigten zweifellos, daß eine Lösung von kristallinem A-Ristomycin-monosulfat in destilliertem · . Wasser bei 100' ⁰C 0,5 bis 1,0 Stunde lang ohne wesentliche Schädigung sterilisiert werden kann» Es wurde ebenfalls gefunden, daß die im AGGRISTHT-Kit anwesende Lösung (in TRIS-

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Puffer, pH « 7,4; Konzentration 15 mg/ml) bei +4 ⁰C' 3 Monate lang ohne Zersetzung gelagert werden kann.

Weitere Einzelheiten der vorliegenden Erfindung sind den-nachstehenden Beispielen zu entnehmen, ohne den Schutzumfang auf diese Beispiele einzuschränken·

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert«

Beispiel 1 Herstellung des A-Ristomycin-sulfats

(R, R^, R₂ und R-, sind wie iüi Punkt 1 angegeben; R, = CH^; X= HSO₄; Y = H)

2 g der auf bekannte Weise hergestellten rohen Ristomycinbase werden bei Raumtemperatur in 5,0 ml destilliertem Wasser gelöst, worauf der pH-Wert der Lösung mit 1 S Schwefelsäure auf 6,8 eingestellt wird; der genaue pH-Wert wird instrumental gemessen· Die gelbe, schwach opaleszente Lösung wird mit ein wenig Knochenkohle geklärt und filtriert. Der erhaltenen klaren Lösung "werden tropfenweise bis Trübung 15 bis 20 % (Yol./Vol·) Acetonitril zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur so lange stehen gelassen, bis die Kristallisierung eintritt. Diese Maßnahme wird nötigenfalls durch Zugabe einer weiteren geringen Menge von Acetonitril während 2 bis 3 Tagen so wiederholt, daß die Kristallisierung mit Hilfe einer 24-stündigen Kühlung im Kühlschrank bei +4 ⁰C beendet wird.

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Die gebildeten quadrätförmigen weißen Kristalle werden filtriert, zuerst zweimal mit je 1,0 ml einer eiskalten Mischung von Acetonitril und Wasser (1:1) und danach zweimal mit je 2 ml kaltem Aceton gewaschen, in einem Vakuumexsikkator, über erhitztem !Calciumchlorid und Paraffinspäne bei Raum- · temperatur unter vermindertem Druck bis Gewichtskonstanz getrocknet· Ausbeute 71 %·..

rs

Beispiel 2 . -

Herstellung des A-Ristomycin-sulfats

1,5 bis 2,0 g des als Ausgangsstoff verwendeten rohen A-Ristomycin-sulfats werden unter ständigem Schütteln in 4,0 ml destilliertem Wasser gelöst· Der stark schäumenden Lösung wird 1,0 ml Acetonitril zugegeben, das Gemisch wird mit Aktivkohle geklärt und filtriert· Der pH-Wert wird mit 2 IT Ammoniumhydroxyd in Gegenwart eines Bromthymolblauindikators (Umschlag von gelb in himmelblau) neutralisiert· Der lösung wird bis Trübung eine weitere Menge von Acetonitril zugege- , ben· Das Gemisch wird bis Eintritt der Kristallisierung stehengelassen, die ausgeschiedenen Kristalle werden durch Erwärmen auf dem Wasserbad wieder aufgelöst und die Lösung wird langsam auf Raumtemperatur kühlen gelassen· Die weitere Aufarbeitung wird auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise durchgeführt· Ausbeute 65 %·

Das nach beiden Methoden isolierte A-Ristomycin-monosulfat besitzt ausgezeichnete Thrombocytenaggregationseigenschaften und entspricht den folgenden, sehr hohen qualitativen Vorschriften: '.....

a) Die Zersetzung des Produkts beginnt bei 165 bis. 170

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(in einem Mettler PP-5 Schmelzpunktapparat gemessen Photozellenregistrierung) .

b) Mit Hilfe eines hochdruckflüssigkeitschromatographischen' Apparates (Hewlett-Packard 1082, HPLC) wird aus dem Produkt ein Chromatogramm ausgezeichneter Qualität gefertigt.

c) Das Produkt ist nach Schichtchromatographie einheitlich. Der in wäßriger: Lösung bei 280 nm gemessene log£ Wert liegt zwischen 4,0 und 4,5, der Sulfataschegehalt ist nicht höher als 0,25'%· Bei einem mit einer Wasserstrahlpumpe (etwa 15 Hgmm) am Siedepunkt des . Acetons, 4 Stunden lang kontinuierlich durchgeführten Saugen beträgt der Gewichtsverlust des A-Ristomycin-monosulfats höchstens 1 bis 2,5 %. '.'..'

Die dünnschichtchromatographische Charakterisierung des Rohproduktes und des nach Beispiel 1 und 2 hergestellten A-Ristomycin-monosulfats wird folgendermaßen durchgeführt:

Die bei der Bestimmung verwendeten Substanzen und Reagenzien:

I." Eine frisch hergestellte 1-2 ^ige wäßrige Lösung des A-Ristomycin-Musters«

II* 1 ./DC-Alurolle Zellulose (Merck 0,1 mm) Dünnschicht. 2. Fixion 50^:8 Platte (Reanal),.

III. Lösungsmittelgemische als Laufmittel:

a) n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (15:10:3:12) oder

b) n-Butanol-Pyridin-n-Propanol-Sssigsäure-?/asser (20:10:5:3:32). Obere organische Phase zur II«1. Dünnschicht. .

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Zur Äquilibrierung und Anlaufen der II·2. ScMent wird das folgende Citratpuffer (pH 6) in ionfreiem V/asser verwendet: 7,0 g Citronensäure 4,0 g Hatriumhydroxyd 81,9 g Natriumchlorid und i 100 ml Methylcellosolv

werden in einem 1000 ml Meßkolb'en aufgelöst und mit destilliertem Wasser bis zur Marke gefüllt·

IY, Entwickler: Pauly-Reagens

0,05 g diazotierte Sulfanylsäure werden in 10 ml einer 10 %igen Uatriumcarbona.tlösung gelöst und die frisch bereitete Lösung wird verwendet· < '

Das reine Rohprodukt zeigt auf der Celluloschicht in den Lösungsmittelgemischen a) und b) R^-Werte von 0,59 bzw· 0,52. Auf einer PircLon 50x8 Platte wird in einem Citratpuffer (pH = 6) ein R^ Wert von 0,61 gemessen* Das Reagens ist sehr empfindlich, weist praktisch alle Zersetzungsprodukte nach; die untere Sachweisgrenze beträgt 0,5 bis 1,0 /Ug#

Die hochdruckflüssigkeitschromatographischsiMessungen werden mit Hilfe eines Hewlett-Packard 1082 HPLC Apparates isochratischen Betriebes durchgeführt. Bei unseren Versuchen wird eine in unseren Laboratorien hergestellte analytische Säule verwendet (Cg-Lichrosorb, 10 /um)· Der Wirkstoffgehalt der A-Ristomycin-Muster wird mit einem bei 254 nm funktionierenden UY-Detektor bestimmt. Aus den Mustern werden 1 millimolare Lösungen hergestellt, deren 20 bis 30/Ul Aliquote auf die Säule gespritzt werden. Die Chromatogramme werden wie 'folgt entwickelt: :

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(I) In einem 12 % Methylcellosolv enthaltenden Citratpuffer (pH 6,3), Flüssigkeitsströmung 2,0 ml/Min., Papiergeschwindigkeit 0,1 cm/Min.

(II) In 10 % Acetonitril enthaltendem (ameisensäure fr ei), 0,1 molarem Ammoiiiumformiat (pH,7,4); Flüssigkeitsströmung 3>0 ml/Min*; Papiergeschwindigkeit 0,3 cm/Min,

Die obigen Bedingungen haben sich am günstigsten erwiesen»

Die Stabilität des nach den Beispielen 1 und 2 hergestellten kristallinen A-Bistomycin-sulfats wird nach UV-Bestrahlung, der festen Muster und nach thermischer Sterilisierung der wäßrigen Lösungen verschiedener Konzentration bzw* Stehenlassen bei +4 ⁰G in einem THIS-Puffer bestimmt·

ä) 50 bis 100 mg A-Ristomycin werden in einer mit einem Pfropfen geschlossenen kleinen Flasche mit UV-Licht so bestrahlt, daß die Entfernung zwischen der das Muster enthaltenden Flasche und der Lampe etwa 20 cm ist, Hach 40-stündiger Bestrahlung wird die Farbe der hergestellten Lösung etwas tiefer; in einer Konzentration von 15 mg/ml ist die Aggregierung der humanen Shrombocyten ganz langsam.

b) Aus A-Ristamycin werden in destilliertem !fässer zwei Lösungen ähnlicher Verdünnung (0,39 mg/ml bzw. 0,35 mg/ml) .und eine mehr konzentrierte Lösung (6,8 mg/ml) hergestellt. Die Lösungen werden 3 Stunden lang in einem 'Wasserbad von 100 ⁰C gehalten* Das abgedampfte Wasser wird gelegentlich ersetzt. Die Lösungen werden auf Raumtemperatur gekühlt

1 % und die Si ^ Werte werden auf Grund der Intensität,der bei 280 nm gemessenen Lichtabsorption bestimmt. Es kann festgestellt werden, daß die Lichtabsorptionerhöhung der

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ι - 19 -

bei 100 ⁰C gehaltenen Lösungen nicht linear ist. Im Bereich von O bis 1 Stunden zeigen die durch Liophylisierung zurückgewonnenen Substanzen nach DünnschichtChromatographie und HochdruckflüssigkeitChromatographie keine Zersetzung· Die Substanzen aggregieren in der gewünschten Konzentration die normalen humanen Thrombocyten befriedigend*

c) Aus A-Ristomycin wird in einem TRIS-Puffer.(pH =7,4) ' eine Lösung mit einer Konzentration von 15 mg/ml hergestellt, welche in einem Kühlschrank bei +4 ⁰G 12 Wochen lang gelagert wird* Aus dieser Stammlösung wird der übliche Thfombocytenaggregationsversuch zweiwöchentlich durchgeführt bzw« nach Durchführung der entsprechenden Puffer-Verdünnung (0,2 ml-»ΊΟ ml) wird der S^" '° Wert bestimmt·

x cm

Während des Versuches bleibt die aggregierende Aktivität

1 % und der Et Wert der A-Ristomycin-Lösung unverändert.

Beispiel 3 . >

Herstellung des bis-IT^T'-Trifluoracetyl-A-ristöinycins

mg A-Ristomycin werden in 10 ml wasserfreiem Methanol suspendiert, wonach 0,28 ml Trifluoressigsäureanhydrid unter Siskühlung tropfenweise zugegeben wird. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur stehengelassen und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in wasserfreiem Methanol wieder aufgelöst und erneut eingeengt. Dieser Vorgang wird noch dreimal wiederholt, wonach das Produkt in einem Vakuumessikkator über erhitztem Calciumchlorid und Paraffinsäure bis Gewichtskonstanz getrocknet wird.'¹ Ausbeute 90 %.

Das so erhaltene bis-H,IT^f-Trifluoroacetyl-A-ristomycin zeigt

, 62 997 18

- 20 - ,

keinen charakteristischen Schmelzpunkt (Zersetzungspunkt). Standardisierung: auf einer Zelluloseschicht im Lösungsmittel·· gemischHIa (siehe Beispiel 2) beträgt der. R^ Wert 0,45·

analyse: C₉₉H₁₀₈O₄₆H₈P₆ (2258):

berechnet: P 5,05 % H '4,96 %

gefunden: P 4,91 % Έ 4,86 % _ä

4,88 , 4,74

Die so erhaltene Verbindung aggregiert die normalen Thrombocyten auf dieselbe Weise wie das A-Ristbmyein.

Beispiel 4

Herstellung der Reagenzien ...

.15,00 g eines den obenangeführten qualitativen Vorschriften entsprechenden A-Ristomyein-monosulfats werden in einem 1 1 Erlenmeyerkolben in 100 ml destilliertem Wasser (pH 6,8) suspendiert* Der an die Wand des Kolbens ausgeschiedene Wirkstoff wird unter ständigem Schütteln mit einer weiteren Menge von 400 bis 500 ml destilliertem Wasser wieder in Lösung gebracht.. Die so erhaltene, einen homogenen Wirkstoffgehalt aufweisende Lösung wird in einen 100 ml Meßkolben faserfrei filtriert, der zum Auflösen verwendete Kolben und der Filter werden auf quantitative Weise nachgewaschen und das Meßgefäß wird bis zur Marke gefüllt« Die A-Ristomaein- . monosulfat-Konzentration der so erhaltenen Lösung beträgt 15 mg/ml« (Zur Herstellung eines sterilen Präparats wird die Lösung 30 bis 60 Minuten lang bei .100 ⁰C gehalten und danach auf "Raumtemperatur gekühlt,) Aus dieser Lösung werden unter Anwendung einer automatischen Püllvorrichtung unter aseptischen Bedingungen genau je 1,00 ml Volumen in braune, sog..

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" - 21 -

Zerreißverschlußflaschen gefüllt· Die Flaschen werden nach Schnellgefrieren liophylisiert und abgeschlossen.

Als Kontrolle der genauen Füllung und der YoIlständigkeit der Liophylisierung wird der A-Ristomycin-Gehalt (15 mg) einiger Flaschen je Charge nach der HPLC-Methode und Gewichtsbestimmung nachgeprüft.

Claims

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Erfindungsanapruch

1. Verfahren zur Herstellung von A-Ristomycin und/oder Histomycin-Derivaten der allgemeinen Pormel (I) hoher Reinheit .'..-. '

OR

(D

NHY

worin , > R ein Wasserstoffatom iat;

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R₁ eine O-alpha-D-Araf(1-^-2)-0-alpha-D-Manp(1-^2)-0-

-(alpha-L-Rhap)-(i—5*6)-0-beta-D-Glop-Gruppe bedeutet; >

Rp eine 2,3,6-Tridesozy-3—amino-(ltHX)-alpha-L«-ribo-hexapyranosyl-rGruppe darstellt; . .

Ro eine alpha-2-Mannopyranosy!gruppe ist;

S, eine 1-4 Kohlenstoffatome enthaltende Alkylgruppe bedeutet? ' - . '

X den Rest einer Mineralsäure darstellt;

X ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe der allgemeinen I*or-· mel C(Z)₃-(CH₂)_n-GO bedeutet, worin Z ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom ist und η für eine ganze Zahl

- ' zwischen O und. 5 steht,

und gegebenenfalls eines Reagens zur Anwendung in Thromboey— tenaggregationsvarsuchen, insbesondere für die Diagnostisierung der Willebrand—Krankheit,

gekennzeichnet dadurch, daß man den pH—Wert einer 30 bis 50 ^igeη wäßrigen Lösung der rohen Eistomycinbase durch Behandlung mit einer Mineralsäure — vorteihaff mit verdünnter /Schwefelsäure- zwischen 6,7 und.7,0 -zweckmäßig auf 6,8-einstellt; oder den pH-Wert einer 30 bis 50 '-yoigen wäßrigen Lösung.eines verunreinigten A—Ristomycinsulfats mit einer Alkalilösung —vorteilhaft mit Ammoniumhydroxyd —zwischen 6,7 und 7,0 einstellt, danach mit einer Menge von 20 bis 50 % .(ToI./YoI.) .eines mit Wasser vermischbaren' niedrigen aliphatischen Carbonsäurenitriis -zweckmäßig Acetonitril— bei Raumtemperatur behandelt, darauffolgend bei+4,^° G kristallisiert, erwünschtenfalls in einem organischen Lösungsmittel— vorzugsweise in einem 1-5 Kohlenstoffatome enthaltenden Alkenol - auflöst.und .danach mit einem Acylierungsmittel das Säureanhydrid-Typs - vorteilhaft mit Trifluoressigsäure— anhydrid - bei einer / ' -

2S ^.

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Temperatur von 0 bis 20 C aeyliert und darauffolgend das erhaltene Produkt oder die erhaltenen Produkte isoliert, und daß man gegebenenfalls das fertiggestellte Ristomycin und/oder Eistomycin-Derivat unmittelbar vor Anwendung in einer bekannten wäßrigen Pufferlösung -vorzugsweise in einer wäßrigen tris—Hydrosyaminoinethanlösung— auflöst.

Hierzu... iL.Seiien Zeichnungen