DD216954A1 - Verfahren zur virulenzabschwaechung bei bakterien der gattung pasteurella, species p. multocida - Google Patents

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DD216954A1 DD24857683A DD24857683A DD216954A1 DD 216954 A1 DD216954 A1 DD 216954A1 DD 24857683 A DD24857683 A DD 24857683A DD 24857683 A DD24857683 A DD 24857683A DD 216954 A1 DD216954 A1 DD 216954A1
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Klaus-Dieter Flossmann
Heino Rosner
Manfred Hoefer
Wilfried Erler
Hans Feist
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Akad Landwirtschaftswiss Ddr
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Abstract

Das Verfahren zur Virulenzabschwaechung bei Bakterien der Gattung Pasteurella, P. multocida, verfolgt das Ziel, bei diesen Bakterien eine dauerhafte Virulenzabschwaechung zu erreichen. Das wird dadurch erreicht, dass die Bakterien in einem chemisch definierten Eisenmangelmedium wiederholt passagiert werden. Die Erfindung hat insbesondere Bedeutung bei der Impfstoffherstellung.

Description

-1- 248 576 8
Verfahren zur Virulenzabschwächung bei Bakterien der Gattung Pasteurella, Species P. muttocida Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Virulenzabschwächung von Bakterien der Gattung Pasteurella, Species Pasteurella multocida (P.multocida).
P. multocida spielt als Erreger akuter und chronischer Erkrankungen der Haustiere insbesondere im Komplex der enzootischen Pneumonie des Kalbes und des Schweines eine wesentliche Rolle. Die Herstellung eines wirksamen, gut verträglichen Impfstoffes trägt in großem Maße zur Gesunderhaltung des Jungtierbestände und der Erzielung guter Aufzuchtergebnisse bei.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Voraussetzung für die Herstellung von Lebendimpfstoffen ist die Verfügbarkeit avirulenter Bakterien zur Vermeidung bzw. Reduzierung schädlicher Nebenwirkungen bei der Impfstoffapplikation. Die Virulenzabschwächung von Bakterien ist möglich durch die Verwendung chemischer Detergentien oder energiereicher Strahlungsarten (z. B. UV-Licht), die die Bakterien nachhaltig schädigen.
Bekanntermaßen ist es möglich, P. multocida sowohl in komplexen als auch in chemisch definierten Nährmedien in guter Ausbeute zu kultivieren {Tabellen 1 und 2.).
Als essentieller Mikronährstoff für Mikroorganismen kommt dem Eisen eine besondere Bedeutung zu.
Es kann vorausgesetzt werden, daß in den bisher üblicherweise eingesetzten Nährmedien stets ein für die Ernährung der Bakterien ausreichendes Eisenangebot vorlag.
Ziel der Erfindung
Die Erfindung verfolgt die Virulenzabschwächung bei Bakterien der Gattung Pasteurella, Species P. multocida.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu beschreiben, mit dem eine Virulenzabschwächung bei Bakterien
der Gattung Pasteurella, Species P.multocida, erzielt wird. :
Überraschenderweise wurde gefunden, daß P. multocida bei fortlaufender Passagierung in einem Eisenmangelmedium seine Virulenz verliert und daß sich P.multocida ebenfalls in einem chemisch definierten Eisenmangelmedium folgender Zusammensetzung ohne Einschränkung der Vermehrung und Passagierbarkeit kultivieren läßt (Tab.3). Die Passagierung erfolgt dabei durch Überimpfen von 10VoI.% der Bakterienkultur in das nächste Kulturmedium (Röhrchenstandkultur) und Bebrütung bei 370C. Das untersuchte Stamm-Material ist in Tabelle 4 aufgeführt.
Der experimentelle Nachweis der Virulenzabschwächung ergibt sich aus Mäuseversuchen durch Ermittlung der Dosis, die 50%
der Mäuse tötet (LD50, angegeben in Lebendkeimen pro Maus) (Tabelle 5). ; . :
Vergleichsuntersuchungen in eisenhaltigen Nährmedien weisen die unverminderte Virulenz nach (Tabelle 6).
Die Stabilität der bei der Kultivierung der Bakterien im Eisenmangelmedium eingetretenen Virulenzabschwächung wurde bei dem ursprünglich hochvirulenten Stamm 383 sowie bei dem ursprünglich mittelgradig virulenten Stamm 35 durch anschließende Haltung bei normalem Eisenangebot in chemisch definiertem Medium, durch Kultivierung auf Blutagrarplatten sowie durch Passagierung über das Versuchstier Maus geprüft.
Die Passagierung erfolgt bei flüssigen Kulturmedien wie bereits beschrieben, bei Kulturen auf Blutagrarplatten durch direktes Überimpfen der Keime mit der Impföse und Bebrütung bei 370C und bei Mäusepassagen durch Injektion von jeweils 0,5ml Bakterienkultur i.p. und anschließendem Leberausstrich auf eine Blutagrarplatte.
Nach jeweils 150 vorausgegangenen Passagen im Eisenmängelmedium sowie daran anschließend 25 Passagen in chemisch definiertem Medium bzw. auf Blutagrarplatten erwies sich P.multocida weiterhin als avirulent. Nach 150 vorausgegangenen Passagen im Eisenmangelmedium sowie daran anschließend 25 Passagen durch die Maus stieg die Virulenz langsam wieder an, ohne jedoch die ursprünglich hohe Virulenz zu erreichen. Vergleichsuntersuchungen in eisenhaltigen, chemisch definierten Nährmedien sowie in komplexen Nährmedien weisen die unverminderte Virulenz auch nach häufiger Passagierung nach
(Tabelle 6). '
Ausführungsbeispiel
Bakterien der Gattung Pasteurella, Species P. multocida. Stamm 383, aus der Stammsammlung des Instituts für bakterielle Tierseuchenforschung Jena, wurden fortlaufend in einem Eisenmangelmedium (Tab.3) kultiviert. Die Passagierung erfolgte durch Überimpfen von jeweils 0,5ml Bakterienkultur in 5ml Kulturmedium als Röhrchenstandkultur und Bebrütung bei 370C für 18 bis 24 Stunden. '
Zur Ermittlung der Virulenz wurde die Bakteriensuspension nach 18 bis 24 Stunden mit Kulturmedium verdünnt, so daß Verdünnungen im Bereich von 10"^1 bis 10~10 vorlagen. Diese Verdünnungen wurden Gruppen von je 10 weißen Mäusen mit einem Körpergewicht von 20g intraperitoneal appliziert. Die Auszählung dertotenjiere erfolgte innerhalb von 10 Versuchstagen nach der Injektion. Die Virulenz (LD50) ergibt sich aus der Dosis, die 50% der Versuchstiere tötet bzw. nach Umrechnung aus der Anzahl der erforderlichen Keime, die eine Maus zu töten in der Lage sind. f
Im Vergleich zu Bakterien der Gattung Pasteurella, Species P. multocida. Stamm 383, die nicht im Eisenmangelmedium passagiert wurden (LDS0-Wert: 1 Keim pro Maus), ergab sich nach 150 Passagen in Eisenmangelmedium eine Virulenzabschwächung (LDso-Wert: > 5 · 105 Keime pro Maus).
-*- 248 576 8
Tabelle 1: Chemisch definiertes Nährmedium für Pasteurelia „906". pH 7,8 bis 8
Substanz g/IH2O(dest.)
Na2HPO4-12H2O 32,3
KH2PO4 1,36
NaCI * . 1,19
MgSO4-7H2O 0,25
Glukose 6
L-Arginin HCL 0,2
L-Asparaginsäure 1,6
L-Cysin 0,12
L-Glutaminsäure 0,15
DL-Serin 0,2
(oderL-Serin 0,1
L-Isoleucin 0,065
L-Leucin , 0,065
L-Phenylalanin » 0,085
L-Tyrosin 0,09
Ca-Pantotheriat 0,002
Nicotinsäureamid 0,005
Vitamin B1 (Thiamin· HCI) 0,001
Eisen-(lll)-citrat 0,001
Orotsäure 0,015
Tabelle 2: Teildefiniertes Medium „803"
für P.multocida (g/1)
Na2HPO4-12H2O . ; 32,3
KH2PO4 . · 1,36
NaCI - 1,19
MgSO4-7H2O 0,25
Glucose ' 6
L-Arginin-HCI 0,1
L-Asparaginsäure 1,6
L-Cystin 0,06
L-Glutaminsäure 0,075
L-Serin 0,05
(oder DL-Serin 0,1)
Orotsäure 0,015
Nicotinsäureamid 0,005
Ca-Pantothenat 0,002
Vitamin B, (Thiamin · HCI) 0,001
Hefe-Extrakt* .5
H2O ad 11, pH 7,8-8 *
mMol
* Supplement Vs (Dessau) oder Difco-Hefeextrakt.
Tabelle 3: Chemisch definiertes Nährmedium für Pasteurelia „902", pH 7,8 bis 8 (Eisenm^ngeilmedium) .
Substanz < g/IH2O(dest.)
90 10 20
1 30 1 12
0,5
1)
0,5
0,5
0,5
0,1
mMol
Na2HPO4-12 H2O
KH2PO4
MgSO4-7 H2O
Glukose
L-Arginin-HCI
L-Asparaginsäure
L-Cystin :
L-Glutaminsäure
DL-Serin
(oderL-Serin
L-Isoleucin
L-Leucin
L-Phenylalanin
L-Tyrosin '
Ca-Pantothenat
Nicotinsäureamid
Vitamin B1 (Thiamin-HCI)
Orotsäure
32,3 1,36 1,19 0,25 6
0,2 1.6
•0,12 0,15 0,2 0,1
0,065 0,065 0,085 0,09 0,002 0,005 0,001 0,015 90 10 20
1 30 1 12 '
0,5
1)
0,5
0,5
0,5
0,5
0,1
-s- 248 576
Tabelle 4: Untersuchtes Stamm-Material
Stamm Serotyp.nach
NAMIOKA/CARTER
Wirtstier Herkunft
Mäusevirulenz
35Ve: A
Buniall
Tabelle 5: Stamm
Rind 5: A
6:B 2:B 2:D 6:E Bezirksinstitut für 6-106
Veterinärwesen Dresden, DDR Küken National Institute of
Animal Health, Tokyo Schwein Institut für bakterielle
Tierseuchenforschung Jena, DDR Rind Institut für bakterielle
Tierseuchenforschung Jena, DDR Rind Vet.-med. Forschungsinstitut
»Pasteur" Bukarest, SRR Schwein Institut für bakterielle
Tierseuchenforschung Jena, DDR Rind National Institute of
Animal Health, Tokyo
Abhängigkeit der Virulenz von der Passagenzahl im Eisenmangelmedium 902 (LD80) Passagenzahl
100
Buniall
Tabelle 6:
Stamm
95
1 32
6-105 13 52
LD50 nach Passagierung von P. multocida in einigen Medien mit normalem Eisengehalt
Passegenzahl 0
17 i ' ' >1 · 10"
2 108 >5- 109
10 >1 10e
3 >1 · 106
9 107 >5· 109
9 105>1·108
1340 >1 · 108
901
803
803+S*
VA 3 95 1 1 9
383 1 8 2 40
D33 32 45 19 8
Buniall 2 13 2 2
100 803 803
906 40 41
16 28 15
25 25 70
28- 20 105
7
Kulturmedium 803 + S: Medium 803 mit Zusatz von 10% Serum. Tabelle 7: Überprüfung der Virulenzrückkehr
150 Passagen in
und 25 Mäusepassagen 3-106
3-106
95 65
13 32
Kulturbedingungen und 25 Passagen in 906 LD60 383 35 Bemerkungen
0 Passagen in 902 und 25 Passagen auf Blutplatte 1 6-10s hochvirulent/ mittelgradig virulent
150 Passagen in 902 >2·108 avirulent/ • ) ' avirulent
150 Passagen in 902 >3·10β >3·108 avirulent/ avirulent j
150 Passagen in 902 >2·108 , >1·108 avirulent/ avirulent
schwach virulent/ schwach virulent

Claims (2)

-}- 248 576 Erfindungsansprüche:
1. Verfahren zuY Virulenzabschwächüng in chemisch definierten Medien bei Bakterien der Gattung Pasteurella, Species
P. multocida, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung in Eisenmangelmedien mehrmals wiederholt durchgeführt - wird. ·
:. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß 150 Passagen im Eisenmangelmedium vorgenommen werden. Hierzu 6 Seiten Tabellen
DD24857683A 1983-03-08 1983-03-08 Verfahren zur virulenzabschwaechung bei bakterien der gattung pasteurella, species p. multocida DD216954A1 (de)

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5587166A (en) * 1987-03-24 1996-12-24 British Technology Group Limited Vaccine against Pasteurella
EP0694560A3 (de) * 1994-07-29 1998-08-12 American Cyanamid Company Herstellung von Pasteurella-Antigenen
CN117965354A (zh) * 2024-01-04 2024-05-03 山东省滨州畜牧兽医研究院 一种禽多杀性巴氏杆菌高密度发酵培养方法及培养基

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP0694560A3 (de) * 1994-07-29 1998-08-12 American Cyanamid Company Herstellung von Pasteurella-Antigenen
CN117965354A (zh) * 2024-01-04 2024-05-03 山东省滨州畜牧兽医研究院 一种禽多杀性巴氏杆菌高密度发酵培养方法及培养基

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