DD217822A5 - METHOD FOR THE PRODUCTION OF L-PHENYLALANINE BY RE-USE OF PHENYLALANINE-AMMONIA-KLYASE - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch Reagieren von t-Zimtsaeure mit einer Ammoniumionenquelle zwecks Bildung einer Substratloesung, Einstellen des p H-Wertes der Substratloesung und Kontaktieren der Substratloesung mit Phenylalanin-Ammoniaklyase als Katalysator. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens, mit dem L-Phenylalanin in hoher Ausbeute hergestellt werden kann, wobei ein hoher Grad der Aktivitaet der Phenylalanin-Ammoniaklyase aufrechterhalten wird und der Katalysator wiederverwendet werden kann. Erfindungsgemaess werden im wesentlichen halogenfreie Ammoniumsalze, beispielsweise Ammonium-sulfat, als Ammoniumionenquelle verwendet. Zum Einstellen des p H-Wertes der Substratloesung wird erfindungsgemaess eine im wesentlichen halogenfreie Saeure, beispielsweise Schwefelsaeure, verwendet.The invention relates to a process for the preparation of L-phenylalanine by reacting t-cinnamic acid with an ammonium ion source to form a substrate solution, adjusting the p H value of the substrate solution and contacting the substrate solution with phenylalanine ammonia lyase as the catalyst. The object of the invention is to provide an improved process by which L-phenylalanine can be produced in high yield, maintaining a high degree of activity of the phenylalanine ammonia lyase and reusing the catalyst. In the present invention, substantially halogen-free ammonium salts, for example, ammonium sulfate, are used as the ammonium ion source. To set the p H value of the substrate solution, a substantially halogen-free acid, for example sulfuric acid, is used according to the invention.
Description
-1- 255308 1-1- 255308 1
Verfahren zur Herstellung von !.-Phenylalanin Anwendungsgebiet der Erfindung 'Process for the preparation of! .- phenylalanine Field of application of the invention
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Phenylalanin aus einer durch Phenylalanin-Ammoniaklyase (PAL) katalysierten Reaktion von t-Zimtsäure und Ammoniak. Speziell bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein solches Verfahren zur Herstellung von Phenylalanin, bei dem ein hoher Grad der Aktivität des PAL-Katalysators erhalten bleibt und der Katalysator wiederverwendet werden kann.The present invention relates to a process for the production of phenylalanine from a phenylalanine ammonia lyase (PAL) catalyzed reaction of t-cinnamic acid and ammonia. Specifically, the present invention relates to such a process for the production of phenylalanine in which a high degree of the activity of the PAL catalyst is retained and the catalyst can be reused.
Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions
L-Phenylalanin ist eine essentielle Aminosäure mit Bedeutung auf dem Gebiet der Ernährung sowie anderen Gebieten der Lebensmittelerzeugung und Medizin. Es ist aus einer Reihe von Proteinen einschließlich Ovafbumin und Lactalbumin industriell isoliert worden. Ein im Fachgebiet weithin bekanntes Laborverfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin verwendet das Enzym Phenylalanin-Ammoniaklyase (im folgenden PAL), um die reversible Reaktion zu katalysieren: L-Phenylalanin -> trans-Zimtsäure + Ammoniak Siehe GB-PS 1 489 468 (19. Oktober 1977).L-phenylalanine is an essential amino acid of importance in the field of nutrition as well as other areas of food production and medicine. It has been industrially isolated from a number of proteins including ovafbumin and lactalbumin. A laboratory method widely known in the art for producing L-phenylalanine uses the enzyme phenylalanine ammonia lyase (hereinafter PAL) to catalyze the reversible reaction: L-phenylalanine -> trans-cinnamic acid + ammonia. See British Patent 1,489,468 (19 October 1977).
Das Gleichgewicht dieser Reaktion beträgt normalerweise 80:20 zugunsten der t-Zimtsäure, wobei verschiedenartige Mittel erprobt worden sind, um einen hohen Umwandlungsgrad in Richtung auf L-Phenylalanin zu erzielen. Das GB-PS 1 489 468 , offenbart, daß eine an die theoretischen 20% L-Phenylalanin angenäherte Ausbeute erzielt werden kann, indem eine große Masse den PAL-Katalysator enthaltender Zellen sowie ein Überschuß an Ammonium-Ionen angewandt wird. Entsprechend dem Verfahren jenes Patents handelt es sich bei der Ammoniumionen-Quelle vorzugsweise um Ammoniumchlorid, wobei die Reaktion vorzugsweise bei einem pH-Wert zwischen 8,5 und 9,7 vorgenommen wird.The balance of this reaction is usually 80:20 in favor of t-cinnamic acid, with various means being used to achieve a high degree of conversion towards L-phenylalanine. GB Patent 1,489,468 discloses that a yield approaching the theoretical 20% L-phenylalanine can be achieved by employing a large mass of cells containing PAL catalyst and an excess of ammonium ions. According to the method of that patent, the ammonium ion source is preferably ammonium chloride, the reaction preferably being carried out at a pH between 8.5 and 9.7.
Yamada, S. et al., Appl. Environ. Microbiol. 42:773-78 (1981) berichteten, daß die Umwandlungs-Ausbeute auf mehr als 70% gesteigert werden konnte, indem der pH-Wert der Substratlösung mit Salzsäure auf 10,0 eingestellt wurde. Diese Bedingungen sind allerdings so scharf, daß die PAL-Aktivität der wiedergewonnenen Zellen in starkem Maße reduziert ist, dies in einem Ausmaß, daß eine Wiederverwendung des Enzyms nicht realisierbar ist. Darüber hinaus steifen Yamada et al. fest, daß die Immobilisierung des zellulären Enzyms gegenüber dem Einsatz intakter Zellen keinen Vorteil bietet. Obwohl somit bei Anwendung dieses Verfahrens eine anfänglich hohe Konzentration an L-Phenylalanin möglich ist, macht die fehlende Fähigkeit zur Wiederverwendung des katalytischen Enzyms dieses Verfahren für eine großindustrielle Anwendung unwirtschaftlich. Mithin besteht ein anhaltender Bedarf an einem Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin aus t-Zimtsäure und Ammoniak, bei dem sowohl eine hohe Ausbeute an L-Phenylalanin erzielt wird, bei dem aber auch die PAL genügend katalytische Aktivität zurückbehält, daß sie erneut eingesetzt werden kann.'Yamada, S. et al., Appl. Environ. Microbiol. 42: 773-78 (1981) reported that the conversion yield could be increased to more than 70% by adjusting the pH of the substrate solution to 10.0 with hydrochloric acid. However, these conditions are so severe that the PAL activity of the recovered cells is greatly reduced, to the extent that reuse of the enzyme is not feasible. In addition, Yamada et al. that immobilization of the cellular enzyme offers no advantage over the use of intact cells. Thus, although an initially high concentration of L-phenylalanine is possible using this method, the lack of catalytic enzyme reuse makes this method uneconomical for large scale industrial application. Thus, there is a continuing need for a process for the production of L-phenylalanine from t-cinnamic acid and ammonia which achieves both a high yield of L-phenylalanine but which also retains sufficient catalytic activity for PAL to be reused can. '
Ziel der ErfindungObject of the invention
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Erzeugung von L-Phenylalanin aus t-Zimtsäure, bei dem das Produkt in hohen Konzentrationen erzeugt wird und bei dem das PAL-Enzym wiederholt verwendet werden kann. Desgleichen ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine solche Vorrichtung zur Erzeugung von L-Phenylalanin zu vermitteln, in welcher die Reaktion entweder in einem Chargensystem freier Zellen oder in einem System immobilisierter Zellen bzw. in einem Ehzymsystem gefahren werden kann. .The object of the invention is to provide an improved process for the production of L-phenylalanine from t-cinnamic acid in which the product is produced in high concentrations and in which the PAL enzyme can be used repeatedly. Likewise, it is an object of the present invention to provide such an apparatus for producing L-phenylalanine in which the reaction can be run either in a free-cell batch system or in an immobilized cell system or in an enzyme system. ,
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer wirtschaftlich einsetzbaren Vorrichtung zur Verwendung von PAL in der Produktion von L-Phenylalanin.Another object of the present invention is to provide an economical device for using PAL in the production of L-phenylalanine.
Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, geeignete Reaktionsbedingungen für die Herstellung von L-Phenylalanin aufzufinden.The invention has for its object to find suitable reaction conditions for the production of L-phenylalanine.
Erfindungsgemäß wird das Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch Reagieren von t-Zimtsäure und Ammoniak in Anwesenheit von Phenylalanin-Ammoniaklyase derart verbessert daß hohe Ausbeuten an L-Phenylalanin erzielt werden und ein hohes Maß an katalytischer Aktivität der PAL beibehalten wird. Unter kontrollierten Reaktionsbedingungen wird die Stabilität der PAL derart gesteigert, daß sie wiederholt zur Erzeugung von L-Phenylalanin mit hohen Konzentrationen verwendet werden kann.According to the present invention, the process for producing L-phenylalanine by reacting t-cinnamic acid and ammonia in the presence of phenylalanine ammonia lyase improves such that high yields of L-phenylalanine are achieved and a high degree of catalytic activity of the PAL is maintained. Under controlled reaction conditions, the stability of the PAL is increased so that it can be used repeatedly to produce L-phenylalanine at high concentrations.
Zwecks Erzielung dieses erwünschten Resultats wird durch Reagieren von Säure mit einer Ammoniumionenquelle eine Substratlösung hergestellt. Bei der Ammoniumionenquelle kann es sich um irgendein Nichthalogen-Ammoniumsalz handeln. Unter Verwendung einer halogenfreien Säure wird der pH-Wert der Substratlösung auf einen Wert im Bereich von etwa 8,0 bis 10,0 eingestellt, sodann wird die Lösung einer PAL-Quelle wie etwa einem System freier intakter Zellen oder aber einem PAL-haltigen System immobilisierter Zellen bzw. einem entsprechenden Enzym-System zugesetzt.In order to achieve this desired result, a substrate solution is prepared by reacting acid with an ammonium ion source. The ammonium ion source may be any non-halogenated ammonium salt. Using a halogen-free acid, the pH of the substrate solution is adjusted to a value in the range of about 8.0 to 10.0, then the solution becomes a PAL source such as a system of free intact cells or a PAL-containing system immobilized cells or a corresponding enzyme system added.
Entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren wird mit t-Zimtsäure und einer Ammoniumionenquelle eine Substratlösung hergestellt. Die Ammoniumionenquelle kann eingeführt werden, indem der t-Zimtsäure ein Ammoniumsalz entweder einer organischen Säure oder aber einer mineralischen Säure entweder direkt zugesetzt wird, oder aber indem sie in die Substratlösung eingearbeitet wird, so etwa durch Vermischen von Ammoniumhydroxid.und einer Nichthalogensäure. Wie das GB-PS 1 489 468 lehrt, besteht eine bevorzugte Ammoniumionenquelle in einem Gemisch aus Ammoniumchlorid und Ammoniumhydroxid (Seite 3, Zeilen 25 bis 26). Das Verfahren nach Yamada et al. benutzt ebenfalls Ämmoniumchlorid. Im Gegensatz zu diesen Lehren im Rahmen des bisherigen Standes der Technik ist herausgefunden worden, daß es vorteilhaft ist, wenn das Ammoniumsalz keine Halogenionen enthält. Es hat sich gezeigt, daß das Vorhandensein von Halogen in den Substratlösungen die katalytische Aktivität der PAL hemmt. Folglich gehören zu den bevorzugten Ammoniumsalzen Ämmoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumzitrat, Ammoniummacetat und Ammoniumphosphat. Ein insbesondere bevorzugtes Ammoniumsalz ist Ammoniumsulfat.According to the method of the invention, a substrate solution is prepared with t-cinnamic acid and an ammonium ion source. The ammonium ion source may be introduced by either adding an ammonium salt of either an organic acid or a mineral acid directly to the t-cinnamic acid or by incorporating it in the substrate solution, such as by mixing ammonium hydroxide and a non-halogen acid. As British Patent 1,489,468 teaches, a preferred ammonium ion source is a mixture of ammonium chloride and ammonium hydroxide (page 3, lines 25 to 26). The method according to Yamada et al. also uses ammonium chloride. In contrast to these teachings in the prior art, it has been found that it is advantageous if the ammonium salt does not contain halogen ions. It has been found that the presence of halogen in the substrate solutions inhibits the catalytic activity of PAL. Thus, the preferred ammonium salts include ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium citrate, ammonium m-acetate and ammonium phosphate. A particularly preferred ammonium salt is ammonium sulfate.
Desgleichen ist wünschenswert, daß das Ammoniumsalz der Substratlösung in hohen Konzentrationen zugesetzt wird. Die Konzentration an Ammoniumionen reicht im allgemeinen von etwa 0,1 bis zu 7,5 M, vorzugsweise von etwa 1 bis 5 M. Die hohe ^mmoniumsalzkonzentration steigert die Ammoniakkonzentration im System und wirkt darüber hinaus als Puffer, so daß die pH-Einstellung der Reaktion leichter gesteuert werden kann.Likewise, it is desirable that the ammonium salt be added to the substrate solution in high concentrations. The concentration of ammonium ions generally ranges from about 0.1 to 7.5 M, preferably from about 1 to 5 M. The high ammonium salt concentration increases the ammonia concentration in the system and moreover acts as a buffer, so that the pH adjustment of the Reaction can be controlled more easily.
Bewegt sich die Ammoniumionenkonzentrat innerhalb dieser angegebenen Bereiche, so belauft sich die Konzentration an t-Zimtsäure in der Lösung im allgemeinen zwischen etwa 30 bis etwa 20OmM, vorzugsweise liegt sie zwischen etwa 60 und etwa 15OmM.When the ammonium ion concentrate moves within these ranges, the concentration of t-cinnamic acid in the solution is generally between about 30 to about 20 microns, preferably between about 60 and about 15 microns.
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Yamada et al. lehren, daß die Substratlösung auf einen pH-Wert von 10,0 eingestellt werden sollte. Im Verfahren der vorliegenden Erfindung hingegen kann der pH-Wert auf einen Bereich von etwa 8 bis etwa 10, vorzugsweise von etwa 8,5 bis etwa 9,5 eingestellt werden. Die Quelle nach Yamada lehrt desweiteren das Einstellen des pH-Wertes der Substratlösung mit Salzsäure, Dies kann dem Substrat eine beträchtliche Menge an Chlorid zuführen. Im vorliegenden Verfahren dagegen ist es — wie bereits erwähnt — vorteilhaft, den pH-Wert der Substratlösung mit einer halogenfreien Säure einzustellen. Bevorzugte Säuren für das Einstellen des pH-Wertes sind Schwefelsäure, Phosphossäure und Essigsäure, wiewohl auch anderweitige halogenfreie Säuren verwendet werden können. Eineinsbesondere bevorzugte Säure ist Schwefelsäure, zumal sie beim Zusetzen zu einer Ammoniumhydroxid enthaltenden Substratlösung unter Bildung von Ammoniumsulfat reagiert, welches wiederum ein bekanntes enzymstabiJisierendes Agens ist.Yamada et al. teach that the substrate solution should be adjusted to a pH of 10.0. By contrast, in the process of the present invention, the pH may be adjusted to a range of from about 8 to about 10, preferably from about 8.5 to about 9.5. The Yamada source further teaches to adjust the pH of the substrate solution with hydrochloric acid. This can provide a substantial amount of chloride to the substrate. In contrast, in the present process it is advantageous, as already mentioned, to adjust the pH of the substrate solution with a halogen-free acid. Preferred acids for adjusting the pH are sulfuric acid, phosphorous acid and acetic acid, although other halogen-free acids can be used. A particularly preferred acid is sulfuric acid, especially as it reacts upon addition to a substrate solution containing ammonium hydroxide to form ammonium sulfate, which in turn is a known enzyme stabilizing agent.
Die Substratlösung wird einer PAL enthaltenden Nährbrühe, den daraus separierten Zellen oder dem isolierten Enzym zugesetzt. Die PAL wird unter Anwendung herkömmlicher Methoden erzeugt, wie sie der gegenwärtige Stand der Technik lehrt. Die PAL-katalysierte Reaktion verläuft unter L-Phenylalanin produzierenden Bedingungen, welche vorzugsweise eine Reaktionstemperatur von etwa 100C bis etwa 450C einschließen. Unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Stabilität der PAL derart gesteigert, daß sie wiederholt eingesetzt werden kann, um L-Phenylalanin in hohenThe substrate solution is added to a PAL-containing nutrient broth, the cells separated therefrom or the isolated enzyme. The PAL is produced using conventional methods as taught by the current state of the art. The PAL catalyzed reaction proceeds under L-phenylalanine-producing conditions, which preferably include a reaction temperature of from about 10 ° C to about 45 ° C. Under the conditions of the process according to the invention, the stability of the PAL is increased so that it can be used repeatedly to high L-phenylalanine
^ Konzentrationen zu produzieren.^ To produce concentrations.
; Das vorliegende Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin kann etweder in einem Chargensystem freier Zellen oder in einem System immobilisierter Zellen bzw. einem Enzymsystem angewendet werden. Bei dem Chargensystem kann es sich entweder um ein einfaches Chargensystem oder um ein kontinuierlich gespeistes Chargensystem handeln. Wird die PAL in einer Säule immobilisiert, dann kann die Säule als Durchlaufsystem, als Wiedereinsatzsystem oder als kontinuierlich gespeistes Wiedereinsatzsystem betrieben werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Immobilisierung des PAL-Enzyms oder der das Enzym enthaltenden Zellen wird In der US-Patentanmeldung der Seriennummer 400 141. vom 20.JuIi 1982 offengelegt. Werden die PAL-Enzyme oder die das Enzym enthaltenden Zellen auf einer Säule immobilisiert, dann kann die Säule auf einer Temperatur von etwa 100C bis etwa 4O0C und vorzugsweise von etwa 180C bis etwa 300C gehalten werden, wenn die Substratlösung durch die Säule gepumpt wird.; The present process for producing L-phenylalanine may be used either in a free-cell batch system or in an immobilized cell system or enzyme system. The batch system can be either a simple batch system or a continuously fed batch system. If the PAL is immobilized in a column, then the column can be operated as a continuous flow system, as a reuse system or as a continuously fed reuse system. A preferred method of immobilizing the PAL enzyme or cells containing the enzyme is disclosed in U.S. Patent Application Serial No. 400,141, issued on June 20, 1982. If the PAL enzymes or cells containing the enzyme immobilized on a column, the column can be kept to about 30 0 C to a temperature of about 10 0 C to about 4O 0 C and preferably from about 18 0 C when the Substrate solution is pumped through the column.
Das Reaktionsgemisch wird vermittels herkömmlicher Methoden hinsichtlich seiner L-Phenylalanin-Produktion analysiert. Wird Schwefelsäure anstelle von Salzsäure in der Substratlösung verwendet, dann wird etwa 8- bis 10mal mehr L-Phenylalanin produziert. Wenn das PAL-Enzym immobilisiert worden ist, dann zeigt es nach 41 Tagen Reaktionszeit eine annähernd 50%ige Retention der Aktivität. Dies steht im Gegensatz zu den 20% Retention nach 24 Stunden, wie sie von Yamada et al. berichtet werdenThe reaction mixture is analyzed for its L-phenylalanine production by conventional methods. If sulfuric acid is used instead of hydrochloric acid in the substrate solution, then about 8 to 10 times more L-phenylalanine is produced. When the PAL enzyme has been immobilized, it shows an approximately 50% retention in activity after 41 days of reaction time. This is in contrast to the 20% retention after 24 hours as described by Yamada et al. be reported
Das L-Phenylalanin kann vermittels konventioneller Verfahren aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden. The L-phenylalanine can be isolated from the reaction mixture by conventional methods.
AusführungsbeispieTAusführungsbeispieT
Die folgenden Ausführungsbeispiele sollen dazu dienen, daß erfindungsgemäße Verfahren zu illustrieren und deutlicher zu definieren, nicht jedoch als begrenzend ausgelegt werden.The following embodiments are intended to illustrate and more clearly define methods of the invention, but are not to be construed as limiting.
Ausführungsbeispiel 1Embodiment 1
Ein Kulturmedium wurde vermittels der folgenden allgemeinen Vorgehensweise zubereitet:A culture medium was prepared by the following general procedure:
' Einem Liter deionisiertem Wasser wurden 10g Pepton, 10g Hefeextrakt, 0,5g D,L-Phenylalanin, 5g Natriumchlorid und 5g L-Isolaucin zugesetzt. Mittels Schwefelsäure wird der pH-Wert auf 6,0 eingestellt, worauf 10min lang bei 12O0C und 15psi im Autoklaven behandelt wird. Dies ist das Standard-Anregungsmedium für die Kulturröhrchen und Schüttelgefäße.To one liter of deionized water was added 10 g of peptone, 10 g of yeast extract, 0.5 g of D, L-phenylalanine, 5 g of sodium chloride and 5 g of L-isolaucine. Using sulfuric acid, the pH is adjusted to 6.0, followed by 10 minutes at 12O 0 C and 15psi autoclaved. This is the standard excitation medium for culture tubes and shake flasks.
Ausführungsbeispiel 2Embodiment 2
Die allgemeine Vorgehensweise von Ausführungsbeispiel 1 wurde wiederholt, wobei dem Medium allerdings außerdem noch 10OmM Kaliumiodid (Kl) zugesetzt würden. Dies ist das hochinduzierende Selektionsmedium.The general procedure of Example 1 was repeated, but the medium also still 10OmM potassium iodide (Kl) would be added. This is the highly inducing selection medium.
Ausführungsbeispielsembodiment
Die allgemeine Vorgehensweise von Ausführungsbeispiel 1 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß dem Medium 20OmM Kl zugesetzt wurden. Dies ist ebenfalls ein hochinduzierendes Selektionsmedium.The general procedure of Example 1 was repeated except that 20 μM Cl was added to the medium. This is also a highly inducing selection medium.
Ausführungsbeispiel 4Embodiment 4
Die allgemeine Vorgehensweise nach Ausführungsbeispiel 1 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß Pepton weggelassen ; und 1 Bg Hefeextrakt eingesetzt wurden. Desweiteren wurden 200 mM Kl zugesetzt. Dies ist das hochinduzierende Schüttelgefäßs Produktionsmedium.The general procedure of Embodiment 1 was repeated except that peptone was omitted ; and 1 Bg of yeast extract were used. Furthermore, 200 mM KI was added. This is the highly inducing shaker vessel production medium.
Ausführungsbeispiel 5Embodiment 5
. Unter Anwendung der allgemeinen Vorgehensweise von Ausführungsbeispiel 4 wurde ein Fermentierungsmedium zubereitet, - wobei allerdings Natriumchlorid und L-Isoleuzin weggelassen wurden. Dies ist das hochinduzierende Fermentations- * Produktionsmedium., Using the general procedure of Example 4, a fermentation medium was prepared, except that sodium chloride and L-isoleucine were omitted. This is the high-induction fermentation * production medium.
Ausführungsbeispiel 6Embodiment 6
Gemäß den Ausführungsbeispielen 1,2 und 3 wurden drei Kulturmedien hergestellt. Ein PAL produzierender Stamm von Hhodoto-rula rubra (ATCC 4056), welcher auf Schrägagärkulturen gehalten worden war, wurde dazu verwendet, 4,5cm3 jeder der Reagenzglaskulturen zu beimpfen. Die Röhrchen wurden sodann bei 300C und 250U/min auf einen Schüttler gestellt. Bei 24h oder 48h wurden 7 Überführungen (0,2dm3) von jedem Reagenzglas in 4,5ml frisches Kulturmedium vorgenommen. Die Kulturröhrchen wurden dazu verwendet, 200cm3 Medium in 10OO-ml-Schüttelflaschen zu beimpfen. Ein Gefäß von jedem Medium wurde bei 30 Stunden und bei 54 Stunden geerntet. Die Zellausbeute nach 30 Stunden betrug im Mittel 14g Paste/Liter; nach 54h betrug sie im Mittel 29g Paste/Liter. Die PAL-Aktivität von 10OmM Klwar um 31 % höher als die Kontrolle. Die PAL-Aktivität von 20OmM Kl war um 39% höher als die Kontrolle. · ,According to Embodiments 1, 2 and 3, three culture media were prepared. A PAL-producing strain of Hhodoto-rula rubra (ATCC 4056) which had been kept at Schrägagärkulturen, was used to inoculate 4.5 cm 3 of each of the test tube cultures. The tubes were then dried at 30 0 C and 250U / min placed on a shaker. At 24h or 48h, 7 transfers (0.2dm 3 ) of each test tube were made in 4.5ml of fresh culture medium. The culture tubes were used to inoculate 200 cm 3 of medium in 10OO ml shake flasks. One vessel of each medium was harvested at 30 hours and 54 hours. The cell yield after 30 hours was on average 14 g paste / liter; after 54h it was on average 29g paste / liter. The PAL activity of 10OmM Klwar was 31% higher than the control. The PAL activity of 20 mM Kl was 39% higher than the control. ·,
Ausführungsbeispiel 7Embodiment 7
Die allgemeine Vorgehensweise von Ausführungsbeispiel 6 zum Anbau von R.-rubra-Zellen in 20OmM Kl hochinduzierendem Medium wurde mit der Ausnahme nachvollzogen, daß 25 Selektionsübertragungen der 200-mM-KI-Kultur vorgenommen wurden. · 4'. '' The general procedure of Example 6 for growing R. rubra cells in 20 mM Kl highly inducing medium was followed except that 25 selections of the 200 mM KI culture were made. · 4 '. ''
-3- 255 308-3- 255 308
Darüber hinaus wurden 24h nachdem die Schüttelflasche inokuliert worden war 2,5% des Mediums dazu verwendet, 15 frische (Finalbehälter) Schüttelbehälter zu beimpfen; nach 24stündiger Kulturzeit wurden diese Behälter geerntet. Die Zellausbeuten sowie die PAL-Aktivität wurden anhand einiger weniger Behälter sowie anhand des finalen zusammengefaßten ' '.In addition, 2.5% of the medium was used to inoculate 15 fresh (final container) shaker containers 24 hours after the shake flask was inoculated; after 24 hours of culture these containers were harvested. The cell yields as well as the PAL activity were summarized on the basis of a few containers as well as the final ''.
Zeilpastenproduktes bestimmt. Die höchste PAL-Aktivität bei 28,7g Paste/Liter Medium betrug 18,4U/g Paste (528U PAL/Liter). (1 Einheit = 1 Mol L-Phenylalanin konvertierten zu t-Zimtsäure und Ammoniak/min bei 300C.) Die Aktivität wurde vermittels einer Modifikation der von Kalghatgi und Subba Rao, Biochem. J. 149: 65-72,1975 angegebenen Methode bestimmt. Das abschließend zusammengefaßte Zellprodukt zeigte 15,0 Einheiten PAL/g Paste bei 27 g Paste/Liter mittlerer Zellausbeute (405U PAL/Liter). . sZeilpastenproduktes determined. The highest PAL activity at 28.7 g paste / liter medium was 18.4 U / g paste (528 U PAL / liter). (1 unit = 1 mole of L-phenylalanine converted to t-cinnamic acid and ammonia / min at 30 ° C.) Activity was measured by a modification of the method described by Kalghatgi and Subba Rao, Biochem. J. 149: 65-72.1975. The final pooled cell product showed 15.0 units PAL / g paste at 27 g paste / liter average cell yield (405U PAL / liter). , s
Ausführungsbeispielsembodiment
Ammoniumzinnamat-Substratlösung wurde vermittels der folgenden allgemeinen Vorgehensweise hergestellt. Zimtsäure wurde zu Ammoniumhydroxid (28%) bis zum Auflösen zugesetzt. Sodann wurden Wasser und Säure zugesetzt, um das Substratvolumen bzw. den pH-Wert einzustellen. In den nachstehenden Ausführungsbeispielen werden die Zimtsäurekonzentration, die Ammoniakkonzentration und der pH-Wert (Menge der zugesetzten Säure) variieren; daher werden die Mengen produzierten Ammoniumsalzes ebenfalls variieren.Ammonium cinnamate substrate solution was prepared by the following general procedure. Cinnamic acid was added to ammonium hydroxide (28%) until dissolved. Then, water and acid were added to adjust the substrate volume and pH, respectively. In the following embodiments, cinnamic acid concentration, ammonia concentration and pH (amount of added acid) will vary; therefore, the amounts of ammonium salt produced will also vary.
Ausführungsbeispiel 9 ' , Embodiment 9 ',
Die Wirkung hoher Halogenkonzentrationen auf PAL wurde durch Verwendung verschiedener Säuren beim Absenken des pH-Wertes von Substratlösungen untersucht. Unter Anwendung der allgemeinen Vorgehensweise von Ausführungsbeispiel 8 wurden zwei Substrate zubereitet (6OmM CA; 7,5 M NH3; pH 10,0). Lösung A wurde unter Einsatz von Salzsäure pH-eingestellt, während Lösung LB unter Verwendung von Schwefelsäure pH-eingestellt wurde. Wie in Ausführungsbeispiel 4 angebaute R.-rubra-Zellen wurden bei 30°C in mit verrührtem Wasser ummantelte Becher eingebracht. Zeitlich geordnete Proben wurden entnommen und hinsichtlich L-Phenylalanin sowohl vermittels Dünnschichtchromatografie als auch vermittels einer enzymatischen L-Aminosäure-Oxidase-Untersuchung analysiert. Es zeigte sich, daß die Substratlösung A (Ammoniumchlorid enthaltend) PAL-Enzym inhibiert. Zellen der Substratlösung B erzeugten zehnmal mehr L-Phenylalanin (nach 24 Stunden Reaktionszeit) als Zellen der Substratlösung A.The effect of high halogen concentrations on PAL was investigated by using different acids to lower the pH of substrate solutions. Using the general procedure of Example 8, two substrates were prepared (60 mM CA; 7.5 M NH 3 ; pH 10.0). Solution A was pH adjusted using hydrochloric acid while solution LB was pH adjusted using sulfuric acid. R. rubra cells grown as in Embodiment 4 were placed in a mulled water-jacketed cup at 30 ° C. Time-ordered samples were taken and analyzed for L-phenylalanine by both thin-layer chromatography and by L-amino acid oxidase enzymatic assay. It was found that the substrate solution A (containing ammonium chloride) inhibits PAL enzyme. Cells of Substrate Solution B produced ten times more L-phenylalanine (after 24 hours reaction time) than cells of Substrate Solution A.
Ausführungsbeispiel! 10Embodiment! 10
Die allgemeine Vorgehensweise des Ausführungsbeispieles 9 wurde wiederholt, um Phosphorsäure mit Schwefelsäure zu vergleichen. Die R.-rubra-Zellen in dem mit Phosphorsäure pH-eingestellten Substrat produzierten 90% des L-Phenylalanins, wie es vom mit Schwefelsäure pH-eingestellten Substrat erzeugt wurde.The general procedure of Embodiment 9 was repeated to compare phosphoric acid with sulfuric acid. The R. rubra cells in the phosphoric acid pH-adjusted substrate produced 90% of the L-phenylalanine as produced by the sulfuric acid pH-adjusted substrate.
Ausführungsbeispiel 11Embodiment 11
Die allgemeine Vorgehensweise des Ausführungsbeispieles 9 wurde wiederholt, um Essigsäure mit Schwefelsäure zu vergleichen. Die in den Reaktoren erzeugte Menge an L-Phenylalanin war die gleiche.The general procedure of Embodiment 9 was repeated to compare acetic acid with sulfuric acid. The amount of L-phenylalanine produced in the reactors was the same.
Äusführungsbeispiel 12 ·.Embodiment 12 ·.
Nach der allgemeinen Vorgehensweise von Ausführungsbeispiel 6 wurden Zellen angebaut. Diese Zellen wurden dazu verwendet, die Wiederverwendbarkeit (Stabilität) der ganzen Zellen zu untersuchen. Es wurden drei Substrate hergestellt, 6OmM t-Zimtsäure, 7,5 M Ammoniak, deren pH-Wert mit Schwefelsäure auf 10,0,9,0 bzw. 8,0 gesenkt wurde. Zellen (4,5g Zellpaste) wurden 16h lang bei 3O0C in jedes der Substrate (45cm3) eingebracht. Die L-Phenylalanin-Konzentration wurde vermittels L-Aminosäure-Oxidase-Untersuchung sowie vermittels Dünnschichtchromatografie bestimmt. Die Zellen wurden zentrifugiert, gewaschen und für 16 Stunden in frisches Substrat eingebracht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:Following the general procedure of Example 6, cells were grown. These cells were used to study the reusability (stability) of whole cells. Three substrates were prepared, 6OmM t-cinnamic acid, 7.5M ammonia, whose pH was lowered to 10.0, 9.0, and 8.0, respectively, with sulfuric acid. Cells (4.5 g cell paste) were 16h introduced at 3O 0 C in each of the substrates (45cm 3) long. The L-phenylalanine concentration was determined by L-amino acid oxidase assay and by thin layer chromatography. The cells were centrifuged, washed and placed in fresh substrate for 16 hours. The results are summarized in the following table:
pH Lauf I Lauf Il %Aktivitäts-pH run I run Il% activity
mg/mlL-Phe mg/ml L-Phe retentionmg / ml L-Phe mg / ml L-Phe retention
8 0,22 0,12 558 0.22 0.12 55
9 0,95 0,78 82 10 2,02 0,43 219 0.95 0.78 82 10 2.02 0.43 21
Die Ergebnisse zeigen, daß selbst bei doppelter Anfangsaktivität von pH 10,0 gegenüber pH 9,0 die pH-9,0-Zellen nach einem Lauf eine gegenüber pH 10,0 mit 163% höhere Aktivität aufweisen.The results show that even with double initial activity of pH 10.0 versus pH 9.0, the pH 9.0 cells after one run have an activity that is 163% higher than pH 10.0.
Ausführungsbeispiol 13Embodiment 13
Gemäß Ausführungsbeispiel 12 wurde eine zweiwöchige Stabilitätsstudie vorgenommen. Die Reaktor-pH-Werte betrugen allerdings 8,75,9,00 und 9,25, und die Ammoniak-Konzentration betrug 5,5M. Der 14-Tage-Test wurde mit 6 aufeinanderfolgenden Chargenuntersuchungen freier R.-rubra-Zellen vorgenommen. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle dargestellt.According to Embodiment 12, a two-week stability study was performed. However, the reactor pH's were 8.75, 9.00 and 9.25, and the ammonia concentration was 5.5M. The 14-day test was performed with 6 consecutive batch studies of free R. rubra cells. The results are shown in the following table.
produzierte mg L-Phenylalanin/Stunde/g Zeil-Trockenmasse (% erhaltene anfängliche Aktivität)produced mg L-phenylalanine / hour / g cell dry weight (% initial activity obtained)
Tage bei Reaktions-pHDays at reaction pH
angegebenemspecified
pH-Wert. /PH value. /
7 . '7. '
Die Ergebnisse zeigen, daß geeignete Bedingungen eine Wiederverwendung von PAL zur Erzeugung von L-Phenylalanin gestatten und daß die Retentionspegel der Aktivität für freie Zellen hoch sind.The results show that suitable conditions allow reuse of PAL to produce L-phenylalanine and that the retention levels of free cell activity are high.
-4-255 308 1-4-255 308 1
Ausführungsbeispiel 14Embodiment 14
Die Zellpaste aus Ausführungsbeispiel 7 wurde unter Anwendung der allgemeinen Vorgehensweise immobilisiert, wie sie vom US-Patent der Seriennummer 400 141 vermittelt wird. Das Substrat (8OmM; 4,8M NH3; pH9,23) wurde aufwärts durch eine Säule gepumpt, welche mit immobilisierten R.-rubra-Zellen gepackt war. Die Durchflußraten variierten mit 0,10,0,25 und 0,50SVh~1 bei 220C sowie mit 0,25 und 0,50SV11""1 bei 28 0C. Das abfließende Medium wurde hinsichtlich L-Phenylalanin geprüft. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. .The cell paste of Embodiment 7 was immobilized using the general procedure taught by US Pat. No. 400,141. The substrate (80 mM, 4.8 M NH 3 , pH 9.23) was pumped upwards through a column packed with immobilized R. rubra cells. The flow rates varied with 0,10,0,25 and 0,50SV h -1 at 22 0 C and with 0.25 and 0,50SV 11 "" 1 at 28 0 C. The effluent was tested for L-phenylalanine. The results are listed in the following table. ,
Bei 0,1 SVh ~1 wurde eine 40%ige Substratkonversion beobachtet, was einer Produktion von 5,4g L-Phenylalanin/Liter bei 22 0C entsprach. -At 0.1 SV h -1 a 40% substrate conversion was observed, which corresponded to a production of 5.4 g of L-phenylalanine / liter at 22 0 C. -
Ausführungsbeispiel 15Embodiment 15
Die Kultur- und Immobilisationsbedingungen von Aüsführungsbeispiel 14 wurden eingehalten. Zur Bestimmung der Halbwertsproduktivität der Säule unter bestimmten Bedingungen wurde eine PAL enthaltende Säule mit immobilisierten R.-rubra-Zellen einer Durchlaufbehandiung unterzogen. Bei dem Substrat handelte es sich um 75mM CA; 4,5 M NH3; pH9,25, und es wurde bei 23°C bei einer Durchflußmenge von 0,25SVh ~1 kontinuierlich durchlaufen gelassen. Es ergab sich eine Halbwerts-Produktivität von 41 Tagen (siehe Abbildung 1). Dieser Test zeigt, daß immobilisierte PAL über eine lange Zeitspanne hinweg zur kontinuierlichen Erzeugung von L-Phenylalanin verwendet werden kann.The culture and immobilization conditions of embodiment 14 were maintained. To determine the half-life productivity of the column under certain conditions, an PAL-containing R.-rubra cell-immobilized column was subjected to a continuous treatment. The substrate was 75 mM CA; 4.5 M NH 3 ; pH9.25, and it was run continuously at 23 ° C at a flow rate of 0.25SV h ~ 1 . There was a half-life of 41 days (see Figure 1). This test demonstrates that immobilized PAL can be used over a long period of time for the continuous production of L-phenylalanine.
Ausführungsbeispiel 16AEmbodiment 16A
Gemäß Aüsführungsbeispiel 5 wurde ein Fermentationsmedium zubereitet und dazu verwendet, R. rubra in einem 10-Liter-Fermentationstank anzubauen. Der Fermentationssamen wurde wie in Ausführungsbeispiel 3 hergestellt. Periodisch wurden Zellproben aus dem Fermentationsbehälter geerntet. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer PAL-Aktivität untersucht, um die optimale Erntezelt zu ermitteln. Es zeigte sich, daß innerhalb von 6 Stunden nach dem Auftreten der Gipfelaktivität weniger als 50% der Spitzenaktivität verblieben. Desgleichen wurde festgestellt, daß vor der Gipfelaktivität das gesamte D,L-Phenylalanin erschöpft worden war. .In accordance with Example 5, a fermentation medium was prepared and used to grow R. rubra in a 10 liter fermentation tank. The fermentation seed was prepared as in Embodiment 3. Periodically, cell samples were harvested from the fermentation tank. The cells were examined for their PAL activity to determine the optimal harvesting tents. It was found that less than 50% of peak activity remained within 6 hours of peak activity. Likewise, it was found that all of the D, L-phenylalanine had been depleted prior to peak activity. ,
Alisführungsbeispiel 16BExample 16B
Es wurde eine Wiederholung von Ausführungsbeispiel 16A vorgenommen. Dabei wurde allerdings unmittelbar nach dem Auftreten der Gipfelaktivität D,L-Phenylalanin (5g/10 Liter) in den Fermentationsbehälter eingespeist. In der ersten Stunde kam es zu einem Abfall der PAL-Aktivität wie in Ausführungsbeispiel 16 A. Für die nächsten drei Stunden stabilisierte sich jedoch die PAL-Aktivität, bevor geerntet wurde (siehe Abbildung 2).A repetition of embodiment 16A was made. However, D, L-phenylalanine (5 g / 10 liters) was fed into the fermentation vessel immediately after peak activity occurred. In the first hour, there was a fall in PAL activity as in Example 16 A. For the next three hours, however, PAL activity stabilized before harvesting (see Figure 2).
Aüsführungsbeispiel 17Implementation Example 17
Entsprechend der Vorgehensweise von Ausführungsbeispiel 14 wurden Zellen zubereitet und immobilisiert. Bei dem verwendeten Substrat handelte es sich allerdings um 75mM CA; 4,5M NH3; pH9,43 bei 230C und einer Durchflußmenge von SVh~ ' = 0,50. Es zeigte sich, daß die Säule 1,9g L-Phenylalanin/Liter Bettvolumenträger/Stunde produzierte. Die L-Phenylalanin-Konzentration im abfließenden Medium betrug 3,8g/l.According to the procedure of Embodiment 14, cells were prepared and immobilized. However, the substrate used was 75mM CA; 4.5M NH 3 ; pH 9.43 at 23 0 C and a flow rate of SV h ~ '= 0.50. It was found that the column produced 1.9 g of L-phenylalanine / liter bed volume carrier / hour. The L-phenylalanine concentration in the effluent was 3.8 g / l.
Äusführungsbeispiel 18Embodiment 18
Entsprechend der Vorgehensweise von Ausführungsbeispiel 14 wurden Zeilen zubereitet und immobilisiert. Die immobilisierten Zellen wurden in eine Säule gepackt, worauf 352cm3 Substrat (75mM CA; 4,5M NH3; pH9,4) bei 1,0SV11"1 durch die Säule rezirkuliert wurden. In Zeitabständen wurden Proben des Substrat-Pools entnommen, worauf die L-Phenylalanin-Konzentration vermittels enzymatischer L-Aminosäureoxidase-Untersuchung und Dünnschichtchromatografie bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt.In accordance with the procedure of Embodiment 14, lines were prepared and immobilized. The immobilized cells were packed in a column, whereupon 352cm 3 Substrate (75 mM CA; 4.5M NH 3; pH9,4) was recirculated through the column at 11 1,0SV "1 At time intervals samples of the substrate pools were taken. whereupon the L-phenylalanine concentration was determined by enzymatic L-amino acid oxidase assay and thin layer chromatography The results are shown in the following table.
Dieses Ausführungsbeispiel demonstriert, daß unter den genannten Reaktionsbedingungen bei Verwendung von PAL enthaltenden immobilisierten Zellen L-Phenylalanin in hohen Konzentrationen sowie mit hoher Umwandlungsrate hergestellt werden kann.This embodiment demonstrates that L-phenylalanine can be produced in high concentrations and at a high conversion rate under the reaction conditions mentioned using PAL-containing immobilized cells.
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