DD217823A1 - Verfahren zur gewinnung von erythrogenem toxin typ c - Google Patents
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Abstract
Das Verfahren zur Gewinnung von erythrogenem Toxin Typ C verfolgt die Aufgabe, aus Kulturfiltraten b-haemolysierender Streptokokken das nur in sehr geringen Mengen gebildete erythrogene Toxin Typ C zu gewinnen. Die Aufgabe wird erfindungsgemaess dadurch geloest, dass das Toxin an saeureaktiviertes Kieselgel bei hohen Ionenstaerken und niedrigen p H-Werten oder an neutrales Kieselgel bei neutralen p H-Werten und 10-20%iger Ammoniumsulfatsaettigung aus den Streptokokkenkulturfiltraten gebunden und mechanisch vom Streptokokkenkulturfiltrat abgetrennt wird. Das Toxin wird mit aethanolischen Puffern hoher p H-Werte vom Kieselgel eluiert. Durch Faellung mit Ammoniumsulfat wird das Rohtoxin gewonnen. Nach Aufloesen in Wasser und einer Behandlung mit frisch bereitetem Calciumphosphat erfolgt die Feinreinigung durch stufenweise Chromatografie an Carboxymethylionenaustauschern. Die Adsorption erfolgt bei niedrigen Ionenstaerken bei schwach sauren p H-Werten, das Toxin wird bei schwach alkalischen p H-Werten und niedrigen Ionenstaerken eluiert.
Description
- 4-
Titel der Erfindung Verfahren zur Gewinnung von erythrogenem Toxin Typ C
Anwendungsgebiet der Erfindung ·
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von erythrogenem Toxin Typ C in großer Reinheit. Exythrogenes Toxin Typ C wird neben den erythrogenen Toxinen Typ A und B von Streptokokken der Gruppe A (Streptococcus pyogenes) gebildet. Diese drei Toxintypen werden als Scharlachtoxine bezeichnet· Sie sind für die Hautrötung beim Scharlach verantwortlich. Alle drei Soharlachtoxintypen sind antigen. Die Scharlachprophylaxe bzw. -therapie wurde deshalb durch aktive Imnmnisierung oder passive Serumtherapie (H.Schmidt, Grundlagen der spez.Therapie und Prophylaxe bakterieller Infektionskrankheiten, Berlin, B40, S. 1027-1G38) mit teilgereinigten Präparaten vorgenommen, so daß Nebenwirkungen auftraten (Topley und.WiIson, Principles of Bacteriology and Immunology, Hrsg. G.S.Wilson and A.A.Miles, Edward Arnold Ltd. London 1955, Bd 2 S. 1669-1672).
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Die bekannte Reinigungsvorschrift für das erythrogene Toxin Typ C beruht auf der Fällung der Streptokokkenkulturfiltrate mit vier Volumen Äthanol, wobei durch Lösen in sauren Puffern die Löslichkeit bei pH 4,0 ausgenutzt wurde (Kim und D.W.Watson, A purified group A streptococcal exotoxin. Physicochemical and biological properties including the enhancement of susceptibility to endotoxin lethal shock. J.exp.Med 131, 1970, 611-628). Nach anschließender Behandlung mit Hyaluronidase zur Entfernung der mitgefällten Hyaluronsäure sowie einer präpara-
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tlven isoelektriscben Fokussierung (P.M.Schlievert, IC.IiUBettin UBd .0.7/.Watson, Purification and characterisation of group A streptOGOCoal pyrogenic exotoxin Type.C, Infect»Immunity 16, . 1977, 673-679) wurde reines Toxin Typ C erhalten. Der bei.dieser Reinigung angewandte erste Konzentrierungsschritt in Form der Alkoholfäilung ist technisch nur für "begrenzte Streptokok™ kenkulturfiltratmengen einsetzbar (hoher Alkoholverbrauch, Vergrößerung des Volumens um den Faktor 4 bis 5). Gleichzeitig wird hochviskose Hyaluronsäure raitgefällt, die jeden weiteren Reinigungsschritt sehr erschwert. Die präparative isoelektrische Fokussierung als Reinigungsmethode ist auf Grund des hohen ökonomischen Aufwandes nicht technisch anwendbar- In dem Patent V/P. 1572. 43 von D.Gerlach und W.Köhler wird ein Verfahren zur Adsorption von erythrogenem Toxin aus Streptokokkenkulturfiltraten beschrieben, bei dem aus sauren Streptokokkenkulturfiltraten bei niedrigen lonenstärken oder aus neutralen Streptokokkenkulturfi!traten bei hohen lonenstärken mit säureaktivier-'tem Magnesiumsilikat das Toxin adsorbiert wird und das Toxin über GM-^Sepharosechromat ograf ie im sauren pH-Bereioh bei pH: 5,2 gereinigt wird, lach diesem Verfahren kann nur erythrogenes Toxin Typ A adsorbiert und gereinigt werden«
Ziel der Erfindung .
Die Erfindung beinhaltet als Ziel die Gewinnung von erythrogenem Toxin Typ C.
Darlegung des "'esens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu beschreiben, mit dem hochgereinigtes erythrogenes Toxin Typ C gewonnen werden kann.
Es wurde gefunden, daß aus einer fermentierten Streptokokke.n-Vultur nach Abtötung der Keime erythrogenes Toxin Typ C, das aus neutralen wie auch sauren Streptokokkenkulturfiltraten weder bei niedrigen noch bei hohen lonenstärken mit säureaktiviertera Mägnesiumsilikat adsorbiert werden kann, aber an 'Kieselgel adsorbiert wird, wenn bei niedrigen pH-WerteD und
gleichzeitig hohen Ionenstärken mit säureaktiviertem Kieselgel oder bei neutralen pH-Werten und 10 bis 20 %iger Neutralsalzkonzentration mit neutralem Kieselgel die Streptokokkenkulturfiltrate extrahiert werden. Von dem mechanisch abgetrennten Adr ' .s or bat kann das Toxin mit Puffern hoher pH-Werte, die 5 bis 10 ,$ wassermischbare organische Lösungsmittel enthalten, eluiert werden. Das Toxin wird durch Neutralsalz gefällt und von Fremdproteinen befreit, indem durch Einrühren von Calciumchlorid und Dinatriumhydrogenphosphat unter neutralen pH·^· Bedingungen Galciumphosphat gefällt wird und die Feinreinigung durch stufenweise Fraktionierung an Carboxyraethylionenaustauschern, bevorzugt Carboxymethylsepharose, durchgeführt wird, überraschenderweise wird erythrogenes Toxin Typ C bei niedrigen lonenstärken und schwach alkalischen Puffern vom Austauscher eluiert. Damit wird in einfachen und wenigen Sohritten reproduzierbar ein hochgereinigtes Toxin Typ C gewonnen.
Ausführungsbeispiele
Das Verfahren soll durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.
50 Liter Streptokokkenkultur mit 0,75 bis 1 mg Toxin Typ C pro Liter werden nach beendeter Fermentation durch Zugabe konzentrierter Salzsäure auf pH 3,5 gebracht und zur Abtötung der Streptokokken eine Stunde gerührt. Anschließend wird der pH-Hrert auf pH 4,0 durch Zugabe von Natronlauge eingestellt und
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die Streptokokken abzentrifugiert. In dem sauren Streptokokkenkulturfiltrat löst man 3 kg Natriumchlorid und rührt 3 kg säureaktiviertes Kieselgel (vorzugsweise Kieselgel B, Sorte 1, VEB Chemiewerk Bad Köstritz) ein und läßt es nach zwei Stunden absitzen. Der Überstand wird abgegossen und das Kieselgel mit 0,02 M Acetatpuffer pH 5,0, der 1M Natriumchlorid enthält, gewaschen. Mit fünf Litern l#iger Natriumcarbonatlösung, die 500 ml Äthanol enthält, wird das Toxin vom Kieselgel eluiert. Man erhält 30 bis 35 mg Rohtoxin. Zur weiteren Reinigung werden
zu d.er riutuuxinlosung 2,5 kg Ammoniumsulfat zugefügt und nach·. AufIbsen über TüTaoht bei 40C stehen gelassen. Der ausgefällte Niederschlag wird abgetrennt und der verbleibende überstand mit 50 g neutralem Kieselgel (vorzugsweise Kieselgel B) extrahiert. Das gebundene Toxin wird mit 100 ml l#iger !Natriumcarbonat-^ lösung eluiert und die Lösung mit 1N" Salzsäure neutralisiert und danach tüit dem in 150 ml Wasser aufgelösten Präzipitat vereinigt. Zu dieser Lösung werden 2 g Calciumchlorid (wasserfrei) zugesetzt und unter Rühren bei einem kontrollierten pH von 7,0 bis 7,6 durch Zugabe von 4 g Dinatriurahydrogenphosphat (gelöst in 20 ml Wasser) gefällt. Das ausgefallene Phosphatgel wird abgetrennt. Aus der klaren Toxinlösung (260 ml) wird mit Ammoniumsulfat (80$ Sättigung) bei pH 4,0 das Rohmaterial ausgefällt. Das präzipitierte Rohmaterial wird in Wasser gelöst und intensiv gegen 0.005 M Phosphatpuffer pH 6,5 dialysiert. Der während der Dialyse ausfallende Niederschlag wird abgetrennt und die klare Lösung auf eine Carboxymethyl-Ionenaustauschsäule, vorzugsweise CM-Sepharose 6 B, die mit dem gleichen Puffer äcLuilibriert worden war. Durch Wasohen mit 0,005 M Phosphatpuffer pH 6,5 bis zur Extinktion 0 (280 nm) wird der größte Teil der Verunreinigungen entfernt. Anschließend wird mit einem 0,007 M Phosphatpuffer pH 7,0 so lange eluiert, bis die Extinktion 0 (280 nm) erreicht ist· Das Toxin kann naoh Pufferwechsel mit 0,008 M Phosphatpuffer pH 7,5 sauber eluiert werden. Von 30 mg Rohtoxin erhält man 10 bis 12 mg Reinprodukt .
Beispiel 2 . .
50 Liter Streptokokkenkultur werden durch Zugabe konzentrierter Salzsäure auf pH 3,5 gebracht und zui Abtötung der Streptokokken eine Stunde gerührt. Danach wird duroh Zugabe von Natronlauge der pH-Wert auf 7,0 eingestellt und die Streptokokken bei diesem pH-Wert absentrifugiert. Dem Streptokokkenkulturfiltrat werden 6 kg Ammoniumsulfat zugesetzt und aufgelöst. Anschließend werden 6 kg neutrales Kieselgel (vorzugsweise Kieselgel B, Sorte 1, VEB Chemiewerk Bad Köstrltz) eingerührt und zwei Stunden gerührt. Danach läßt man das Kieselgel ab-
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sitzen, gießt den überstand ab, wäscht das Kieselgel mit 20#iger Ammoniumsulfatlösung und eluiert das Toxin mit IO Litern l$iger Natriumcarbonatlösung (pH 9,5). Man erhält 20 bis 25 mg Rohtoxin. Die weitere Reinigung erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die Vorteile des Verfahrens sind folgende: es wird in einfacher Weise eine Konzentrierung von Toxin Typ C möglioh, es kann im technischen Maßstab gearbeitet werden, die Konzentrierung erlaubt eine Vorreinigung und die Abtrennung der störenden hochviskosen Hyaluronsäure. Das erhaltene Toxin Typ C ist sowohl in der isoelektrischen Fokussierung wie auch in der Natriumdodecylsulfatelektrophorese frei von Verunreinigungen.
Claims (1)
- ErfindungsanspruchVerfahren zur Gewinnung von erytbrqgenem Toxin Typ C aus Streptokpkkenkulturfiltr.sten, gekennzeichnet dadurch, daß für eine fermentierte Streptokokkenkultur nach Abtötung der Keime unter geeigneten Bedingungen eine Adsorption an einem festen Träger^ vorzugsweise Kieselgel, vorgenommen wird, indem- mit säureaktiviertem ICieselgel "bei niedrigen pH-Werten v und gleichzeitig hohen lonenstärken oder- mit neutralem Eieselgel "bei neutralen pH-Werten und 10~20$iger Neutralsalz-Konzentrationgearbeitet wird und nach Desorption des Toxins das erhaltene Rohtoxln von Fremdproteinen befreit und mittels Chromatographie gereinigt wird.
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