DD218371A5

DD218371A5 - Verfahren zur herstellung von wff analoga

Info

Publication number: DD218371A5
Application number: DD84259373A
Authority: DD
Inventors: Jean E F Rivier; Jr Wylie W Vale; Joachim Spiess
Original assignee: Salk Inst For Biological Studi
Priority date: 1983-01-13
Filing date: 1984-01-12
Publication date: 1985-02-06
Also published as: DK12984A; MX161186A; IE56568B1; IL70530A; EP0117034A2; DK161096C; ES8506263A1; OA07631A; FI87080C; IN160129B; EP0117034B1; YU45587B; IL70530A0; FI87080B; DE3473764D1; KR840007569A; RO88702A; FI840111A0; NO168362C; YU5284A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von WFF-Analoga. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Peptiden mit hoeherer Effektivitaet fuer die Freisetzung von Wachstumshormonen. Erfindungsgemaess werden neue humane pankreatische WFF-Analoga mit ausserordentlicher Potenz im Sinne der Stimulierung der Freisetzung von Hypophysen-Wachstumshormon bei Saeugern zur Verfuegung gestellt mit der Formel H-R1-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-R10-Arg-R12-R13-Leu-R15-Gln-Leu-R18-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R24-R25-Ile-R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R38-R39-R40-Arg-R42-R43-R44-Y, in welcher R1 fuer Tyr, Met, D-Tyr, Phe, D-Phe, Leu, D-His oder His steht; R8 ist Ser oder Asn; R10 ist Tyr, Phe oder D-Tyr; R12 ist Arg oder Lys; R13 ist Ile oder Val; R15 ist Gly oder D-Ala; R18 ist Tyr oder Ser; R24 ist His oder Gln; R25 ist Glu oder Asp; R27 wird aus der Gruppe ausgewaehlt, die sich aus den D- und L-Isomeren von Ala, Nle, Ile, Leu, Met und Val zusammengesetzt; R28 ist Ser, Asn oder D-Ala; R34 ist Arg oder Ser; R38 ist Gln oder Arg; R39 ist Arg oder Gly; R40 ist Ser oder Ala; R42 ist Phe oder Ala; R43 ist Asn oder Arg; R44 ist eine natuerliche Aminosaeure oder des-R44; und Y bezeichnet die Carboxyl-Komponente des Aminosaeurerestes an der C-Endstelle und entspricht dem Radikal -COOR, -CRO, -CONHNHR, -CON(R)(R) oder -CH2OR, wobei R und R fuer niederes Alkyl, fluoroniederes Alkyl oder Wasserstoff stehen.

Description

Berlin* don 3i»7_a1984

AP C 12 P/259 373 63 365/18/20

Verfahren zur Herstellung von WFF-Analoga

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Peptide«, welches Einfluß auf die'Funktion .der Hypophyse bei Menschen und anderen Tieren « speziell' Säugern - ausübt«-'Insbesondere'bezieht, sich-* die vorliegende Erfindung auf ein Peptid, welche® die Freisetzung von Wachstumshormon durch die Hypophyse fördert«

Chj^iakte^^

Die Physiologen haben seit langem herausgefunden, daß der Hypothalamus die gesamte sekretorische Funktion der Adenohypophys© steuert, wobei der Hypothalamus spezielle Polypeptide erzeugt φ welch® die Sekretion eines jeden Hypophysen« hormone auslöst. Es ist ein hemmender Faktor gekennzeichnet worden, welcher di© Sekretion von Wachstumshormon (WH) inhibiert.' er. wurd® als Somatoetatin bezeichnet.

Au© einem Extrakt eines humanen Pankreaetumors ist unlängst ein entsprechender hypothalamischer Freisetzungsfaktor für HypQphysen»WH isoliert, gereinigt, -charakterisiert« synthetisiert und geprüft worden» Die Sequenz dieses Peptide lautet iTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp'-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Se^Asn-Gln-Glu^Arg^Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu, Von der amidierten Form dieses Peptide wird angenommen, daß es sich dabei um ©inen humanen pankreatischen Tumor«WH frei-

setzenden Faktor handelt; si© wird daher auch als hpWFF be zeichnete

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung neuer Analoga von Wachstumsfreteetzungshormonen mit verstärkter Wirksamkeit ♦

Darlepu_[itn<3,...djes^Wesens der Erfindung

Oer Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde» neue WFF-Analoga mit den gewünschten Eigenschaften und Verfahren zu ihrer Herstellung aufzufinden»

Nunmehr ist aus hypothalamischen Extrakten der Ratte ein Polypeptid isoliert« gereinigt, charakterisiert« synthetisiert und geprüft worden, welches aus kultivierten Hypophysenzellen Wachstumshormon freisetzt« Die Sequenz dieses aus 43 Resten bestehenden, natürlich vorkommenden Peptide lautet : H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Löu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Aen-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH, Da® Peptid wird im folgenden als RhWFF (rattenhypotha-1amischer Wachstumshormonfreisetzungsfaktor) bezeichnet«

Inzwischen sind bestimmte Analoga von hpWFF synthetisiert und geprüft worden, die noch potenter als hpWFF selbst sind; viele dieser Analoga sind kürzer· Einige dieser Analoga beruhen auf im Einklang mit der Formel von RhWFF befindlichen

Substitutioii©n,_# während andere auf anderweitigen. Subetitu» tionen basieren« Erfindungsgemäße pharmazeutisch© Zusammen-Satzungen beinhalten diese Analoga von hpWFF oder ein daraus abgeleitetes nichttoxisches Salz bei Dispersion in einem pharmazeutisch annehmbaren flüssigen oder festen Trägerstoffe Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen können sowohl in der klinischen Human» als auch Veterinärmedizin zur Verabreichung zu therapeutischen und auch diagnostischen Zwecken angewendet werden» Darüber hinaus können sie dazu verwendet werden, das Wachstum von Warmblütern einschließlich Geflügel wie auch in der Fischwirtschaft von Kaltblütern wie zum Beispiel Fischen* Aalen usw« zu fördern/

Bei der zur Bestimmung des Peptide verwendeten Nomenklatur handelt es sich um die von Schroder & Lubke in "The Peptides", Academic Press (1965) vorgeschrieben®, bei d©r in Übereinstimmung mit der herkömmlichen Darstellungsweise die Amino» gruppe am N-Terminal links und die Carboxylgruppe am C« Terminal rechts erscheint. Unter natürlicher Aminosäure wird ein® der üblichen, in der N_atur vorkommenden und in Proteinen gefundenen Aminosäuren - GIy, Ala, VaI _t Leu₈ He» Ser, Thr, Lys, Arg, Asp_# Asn» GIu, GIw₅ Cys_Ä M©t_s Phe_e Tyr, Pro, Trp und His - gemeint» Wo der Aminosäurerest isomere Formen besitzt, wird - sofern nicht anderweitig ausdrücklich angegeben - die L«Form der Aminosäure dargestellte Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung wird RhWFF ale Analogon von hpWFF angesehene ' . - . ... ,ι.':

Di© Erfindung vermittelt synthetische hpWFF«»Analoga mit der folgenden Formelι H-R.-Ala-Asp-Ala^Ile^Phe^Thr-Ro

R^«"^!-»-Leü-R,. ^ R₂₅-IIe-R₂₇-R₂₈-ArQ-GIn-GIn-GIy-GIu-R₃₄-ASn-GIn-GIu-R₃₈-^R39"^R40"^iAr9"^R42~^R43~^R44~^Y* ^{wobei R}i ^{für Tvr}* ^Möt* ^D-^TY^r« ^Pne« D-Phe. Leu, D-His oder His steht? R_Q ist Ser oder Asn; R_4n ist Tyr, Phe, oder D-Tyr; R₁₂ ist Arg oder Lye; R₁₃ ist He oder VaI; R.- ist GIy oder D-AIa; R^₈ ist Tyr oder Ser; R₂₄ ist His oder Gin; R₂ ist GIu oder Asp; R₂₇ wird unter jener Gruppe ausgewählt, dte sich aus den D- und L-Isomeren von AIa, Nie; Ile_£Leu, Met und VaI zusammensetzt; R₂₈ ist Ser, Asn oder D-AIa; R₃₄ ist Arg oder Ser; R₃₈ ist Gin oder Arg; R₃₉ ist Arg oder GIy; R₄₀ ist Ser oder Ala; R₄₂ ist Phe oder Ala; R₄₃ ist Asn oder Arg; R₄₄ ist eine natürliche Aminosäure oder des-R..; und Y bezeichnet die Carboxyl-Komponente des Aminosäurerestes am C-Teminus und ist das Radikal -COOR, -CRO, -CONHNHR, -CON(R)(R') oder -CHgOR, wobei R und R* für niederes Alkyl, fluorniederes Alkyl oder Wasserstoff stehen, allerdings vorausgesetzt, daß wenn R. für Tyr steht, R₂₇ dann nicht für Met steht, daß weiter Rq für Ser steht, ^R12 ^{für Ar}9 steht, R₁₃ für He steht, R^₈ für Tyr steht.

^R24 ^{für His steht}* ^R25 ^{für Glu stent}* ^R28 ^{für A8n 8tent}* R₃₄ für Arg steht, R₃₈ für GIn steht, R₃₉, für Arg steht, R₄₀ für Ser steht, R₄₂ für Phe steht oder R₄₃ für Asn steht; vorausgesetzt weiter, daß irgendwelche oder auch sämtliche Reste von 28 bis 44 gelöscht werden können, um ein biologisch aktives Fragment zu liefern; oder ein nichttoxisches Salz des vorangegangenen« Methyl, Ethyl und Propyl sind die bevorzugten niederen Alkylgruppen, Auch Fragmente der vorstehenden Peptide besitzen biologische Potenz, und im allgemeinen wird davon ausgegangen, daß siöh das Peptid mindestens vom N-Terminal bis zum Rest 27 erstrecken sollte·

erstreckt sich das Peptidfragmeni lediglich bis zum Rest und 28, dann sollte Y Nl-L oder einem substituierten Amid entsprechen; erstreckt sich das Fragment indes bis zu einem der Rest© 29 bis 39, dann ist Y vorzugsweise ein Amid oder ein substituierte® Amid.

Die hpWFF-Analoga mit einem der aufgeführten Substituenten für Met in der 27-Position zeigen beträchtlich größere Stabilität« dies insbesondere dann* wenn sie oxydierenden Bedingungen ausgesetzt werden; handelt es sich bei dem SubstLtuenten um ein D-Isomer, dann kann darüber hinaus die Enzynwiderstandsfähigkeit gesteigert werden« Sie bleiben biologisch voll aktiv, wobei bestimmte Analoga bei Prüfung in_ VIt₁TO eine überraschend gesteigerte Potenz zeigen« Di© Substitution von His in der !-Position Eefert eine überraschend hohe Potenz« Des weiteren hält die Substitution einer D-Isomer-Aminosäure wie z, B* D-Tyr eine überraschende Menge an Potenz zurück und kann sich als recht brauchbar erweisen* indem das Peptid gegenüber einer Zerlegung durch bestimmte Enzyme widerstandsfähig gemacht wird«,

Die Peptide werden unter Anwendung eines geeigneten Ver« fahrens synthetisierte so etwa durch ausschließliche Fest» phasentechniken, durch teilweise Festphasentechniken, durch Fragmentkondensation, durch klassische Lösungsverknüpfungen oder durch die Anwendung der unlängst entwickelten rekombinanten DNS-Techniken, Die Techniken der ausschließlichen Festphasensynthese beispielsweise sind im Textbuch "Solid-Phase Peptid© Synthesis"_s Stewart & Young, Freeman & Co., San Francisco, 1969, dargelegt und werden durch die Offenlegung des US»PS Ur* 4 105 60S, herapsgegeben am 8» August

1978 von Vale et al«, exemplifiziert* Die Synthese vermittels* Fragmentkondensation ist im US-PS Nr* 3 972 859 (3. August 1976) exemplifiziert« Weitere verfügbare Synthesetechniken sind in den US-PS Nr, 3 842 067 (15· Oktober 1974) und Nr₄ 3 862 925 (28, Oanuar 1975) am Beispiel dargestellt«

Unter Synthese durch Anwendung der rekorobinanten DNS-Techniken sollte im Rahmen der vorliegenden Anmeldung auch die zweckvolle Anwendung einer strukturellen Gencodierung für die gewünschte Form des hpWFF-Analogons oder eines daraus abgeleiteten Fragmentes verstanden werden» Das synthetische hpWFF-Peptid kann durch Transformieren eines Mikroorganismus unter Verwendung eines Expressionsvektors einschließlich eines Promotors und Operators zusammen mit einem solchen strukturellen Gen sowie unter Bildung eines solchen transformierten Mikroorganismus gewonnen werden, um das hpWFF-Peptid darzustellen» Desgleichen kann ein nichthumanes tierisches Wesen dazu verwendet werden« das hpWFF-Peptid durch Geb-Anbau unter Verwendung eines derartigen strukturellen Genes zu erzeugen« wobei die allgemeinen Techniken anzuwenden sind* die im US-PS Nr. 4 276 282 vom 30« Juni 1981 dargelegt werden, oder wobei die Mikroinjektion von Embryos angewendet wird, wie sie im W083/01783 vom 26. Mai 1983 und im W082/04443 vom 23 Dezember 1982 beschrieben wird· Das synthetische hpWFF-Peptid kann aber auch direkt in dem Tier produziert werden, welches zu beschleunigtem Wachstum angeregt werden soll, indem die in den beiden VVO-Publikationen beschriebenen Techniken angewendet werden*

Den chemischen Synthesen gemeinsam ist das Schützen der labilen Seitenkettengruppen der verschiedenen Aminosäure-

komponenten mit geeigneten schützenden Gruppen« die ein Entstehen einer chemischen Reaktion an jener Stelle verhindern, bis die Gruppe schließlich beseitigt ist. Üblicherweise ebenso gemeinsam ist das Schützen einer Alpha-Aminogruppe an einer Aminosäure oder einem Fragment, während jene Einheit an der Carboxylgruppe reagiert, woran sich die selektive Beseitigung der die Alpha-Aminogruppe schützenden Gruppe anschließt, um ein darauffolgendes Reagieren an jener Stelle zu ermöglichen. Entsprechend ist es üblich, daß - als einer der Syntheseschritte - eine Zwischenverbindung pro-

-

duziert wird, die jeden der Aminosäurereste beinhaltet, die in ihrer gewünschten Sequenz mit an die jeweils passenden Rest® angelagerten seitenkettengeschützen Gruppen vorliegen«

Als ebenfalls innerhalb des Geltungsbereiches der vorliegenden Erfindung befindlich gelten Intermediärprodukte der Formel: X³^R₁(X oder X²)-Ala-Asp(X³)-Ala-Ile-Phe-Thr(X⁴)»R₈-(X⁴ oder X⁵)-Ser(X⁴)-R₁₀(X²)-Arg-(X⁶)-R₁₂(X⁶ oder X⁷J-R₁₃-LeU-R₁₅-GIn-(X⁵)-Leu-R₁₈(X²)-Ala-Arg(X⁶)-Lys(X⁷)-Leu-Leu-R₂₄(X oder X⁵J-R₂₅(X³J-IIe-R₂₇-R₂₈(X⁴ oder X⁵)-Arg(X⁶)-Gln-(X*)»Gly-Glu(X³)-R₃₄(X⁴ oder X⁶)-Asn(X⁵J-GIn(X⁵J-GIu(X³)-R₃₈(X⁵ oder X^ß)-R₃₉(X⁶-R₄₀(X⁴J-Ar₉(X⁶J-R₄₂-R₄₃(X⁵ oder X⁶J-44^^{x x} , wobei: X entweder für Wasserstoff oder eine alpha-

aminoschützende Gruppe steht« Die Alphaaminoschützenden Gruppen, die durch X bezeichnet werden, sind jene, die auf dem Gebiet der schrittweisen Synthese von Polypeptiden bekanntermaßen als brauchbar gelten. Unter den Klassen von alphaaminoschützenden Gruppen, die als X eingesetzt werden können, befinden sich (1) schützende Gruppen des aromatischen Urethan-Typs wie etwa Fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC), Benzyloxy-

carbonyl (Z) und substituiertes Z wie etwa p-Chlorobenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Bromobenzyloxycarbonyl und p-Methoxybonzyloxycarbonyl; (2) schützende Gruppen des aliphatischen Urethan-Typs wie etwa t-Butyloxycarbonyl (BOC), Düsopropylmethyloxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Allyloxycarbonyli und (3) schützende Gruppen des Cycloalkyl-Urethan-Typs wie etwa Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl, Die bevorzugte alphaaroinoschützende Gruppe ist BOC.

X ist Wasserstoff oder eine schützende Gruppe für den Imidazol-Stickstoff von His, wie etwa Tos.

X kann eine geeignete schützende Gruppe für die phenolische Hydroxylgruppe von Tyr sein* so etwa Tetrahydropyranyl» tert-Butyl, Trityl, BzI, CBZ, 4Br-CBZ und 2,6-Dichlorobenzyl (DCB)* Die bevorzugte schützende Gruppe ist 2,6-Dichloro-

2

benzyl· X kann Wasserstoff sein, was bedeutet, daß sich in

jener Position keine seitenkettenschützende Gruppe auf dem Aminosäurerest befindet.

X ist Wasserstoff oder eine geeignete esterbildende schützende Gruppe für die Carboxylgruppe von Asp oder GIu, wieetwa Benzyl (OBzI),2,6-Dichlorobenzyl, Methyl und Ethyl.

t · -

X kann eine geeignete schützende Gruppe für die Hydroxyl-Gruppe von Thr oder Ser sein, so etwa Acetyl, Benzoyl, tert-Butyl, Trityl, Tetrahydropyranyl, BzI, 2,6-Dichlorobenzyl und CBZ. Die bevorzugte schützende Gruppe ist BIz.

X kann Wasserstoff sein, was bedeutet, daß keine schützende Gruppe auf der Hydroxylgruppe vorliegt.

5 '

X ist Wasserstoff oder eine geeignete schützende Gruppe für die Seitenketten-Aminogruppe von Asn oder GIn, Vorzugsweise handelt es sich um Xanthyl (Xan),

X ist eine geeignete schützende Gruppe für die Guanidinogruppe von Arg« so etwa Nitro* Tos, CBZ, Adamantyloxy-

ft

carbonyl und BOC, oder X ist Wasserstoff»

7 X ist Wasserstoff oder eine geeignete schützende Gruppe für die Seitenkettenaminogruppe von Lys« Beispiele für geeignete, die Seitenkettenaminogruppe schützende Gruppen sind 2-Chlorobenzyloxycarbonyl (2-Cl-Z)₄ Tos« t-Amyloxycarbonyl und BOC.

X ist Wasserstoff oder eine geeignete seitenkettenschützende Gruppe nach Art der oben allgemein ausgeführten«

Met kann wahlweise durch Sauerstoff geschützt werden, vorzugsweise bleibt es jedoch ungeschützt·

Die Auswahl einer eine Amino-Seitenkette schützende Gruppe trägt keinen kritischen Charakter, sofern generell eine Gruppe gewählt wird, die während des Entschützens der Alpha-Aminogruppen im Verlauf der Synthese nicht beseitigt wird. Für einige Aminosäuren wie beispielsweise His ist jedoch ein Schützen nach Vollendung des Anknüpfens nicht generell erforderlich, und die schützenden Gruppen können gleichartig sein,

9 X ist eine geeignete schützende Gruppe für die C-endständge Carboxylgruppe wie etwa die esterbildende Gruppe X ,

oder es handelt eich um eins bei der Festphasensynthese zur Anknüpfung an einen festen Harzträger verwendete Verankerungsbildung, oder es handelt sich um des-X j in diesem Falle weist der Rest an der C-Endstelle eine Carboxyl-Komponente auf j bei der es sich - wie weiter oben definiert um Y handelt· Wird ein fester Harzträger verwendet« dann kann es sich um jedweden im Fachgebiet bekannten Typ handeln; so etwa einen Träger mit den Formeln: -0-CH₂-Harz~ tragers -NH-Benzhydrylamin (BHA) Harzträger oder -NH-Paramethylbenzhydryiamin (MBHA) Harzträger. Wird das nichtsubstituierte Amid gewünscht, dann wird der Einsatz von BHA- oder MBHA-Harz bevorzugt« da die Spaltung das Amid direkt ergibt. Falls das N-Methylamid gewünscht wird, dann kann es aus einem N-Methy1-BHA-Harz erzeugt werden* Sollten andere substituierte Amide gewünscht werden oder sollten andere Gruppen.als die freie Säure an der C-Endstelle gewünscht werden« dann kann es sich als vorteilhaft erweisen, das Peptid unter Anwendung der klassischen Methoden zu synthetisieren, wie sie im Text von Houben-Weyl dargelegt werden· ~

In der Formel für das Intermediärprodukt handelt es sich bei mindestens einer der X-Gruppen um eine schützende Gruppe oder aber X beinhaltet einen Harzträgerstoff_# Mithin vermittelt die Erfindung darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung eines interessierenden Peptide durch (a) Bilden eines Peptide mit mindestens einer schützenden Gruppe und der Formel (II):

X³^-R (X oder X^J-AIa-ASp(X³)-Ala-Ile-Phe-Thr(X⁴J-R (X⁴ öder X⁵)-Ser(X⁴J-Tyr(X²)-Arg(X⁶J-R₁₂(X⁶ oder X⁷J-R₁₃-LeU-GIy-GIn-(X⁵)-Leu-R₁₈(X²J-Ala-Arg(X⁶J-LyS(X⁷J-LeU-LeU-R₂₄(X oder X⁵)-

₅gR₂₈(X⁴ oder X⁵)~Arg(X⁶)~Gln(X⁵)~Gln(X⁵)-Gly-GIu(X³J-R₅₄(X* oder X⁶)-Asn(X⁵)-Gln(X⁵)~Glu(X³)-R₃₈(X⁵ oder

^χ6>"«39<^Χ );^R40(^x4);^Ar9i^X6);^R42"^R43i^x5 °^d% ^)^^^'· wobei: X, Χ¹» >C, X"⁵, X , X , X , X und X jeweils entweder

9 Wasserstoff oder eine schützende Gruppe darstellen, und X ist entweder eine schützende Gruppe oder eine Verankerungs« bindung an einen Harzträgerstoff oder des-X , in diesem Falle weist der Rest an der C-Endstelle eine Carboxy-Komponente auf, bei der es sich um Y handelt; (b) Abspalten der schützenden Gruppe oder Gruppen oder der Verankerungsbindung vom genannten Peptid der Formel (II); und (c) sofern gewünscht - Umwandeln eines resultierenden Peptide in eines seiner nicht toxischen Salze·

Beim Auswählen einer eine spezielle Seitenkette schützenden Gruppe, die bei der Synthese der Peptide eingesetzt werden soll, ist den folgenden Regeln zu entsprechen: (a) die schützende Gruppe muß ihre schutzenden Eigenschaften behalten und darf unter Kopplungsbedingungen keinesfalls abgespalten werden, (b) die schützende Gruppe sollte gegenüber dem Reagenten stabil sein und desgleichen sollte sie - mit Ausnahme von Xan - unter jenen Reaktionsbedingungen stabil sein, die für das Entfernen der die Alpha-Aminogruppe schützenden Gruppe für jeden Schritt der Synthese ausgewählt wurden, und (c) die die Seitenkette schützende Gruppe muß bei der Vollendung der Synthese der gewünschten Aminosäuresequenz unter Reaktionsbedingungen entfernbar bleiben, welche die Peptidkette nicht verändern werden·

Werden die Peptide nicht nach der rekombinanten DNS-Technologie hergestellt, dann werden sie vorzugsweise unter Anwen-

dung der Festphasensynthese hergestellt« wie sie allgemein von Merrifield, Ώ» Am, Chenu Soc„_Ä 85, S₀ 2149 (1963) be-

Mm ι min MfuiiKnmnmi tir-ii We» ^

schrieben wurde, wenngleich auch - wie bereits erwähnt andere im Fachgebiet bekannte glächwertige chemische Syntheseverfahren eberfalls angewendet werden können« Die Festphasensynthese beginnt vom C-Ende des Peptide vermittels

Anknüpfen einer geschützten Alpha-Aminosäure an ein geeignetes Harz« Ein derartiges Ausgangsmaterial kann hergestellt werden, indem eine alpha-aminogeschützte Aminosäure vermittels einer göterbindung an ein chloromethyliertes Harz oder ein Hydroxymethylharz angelagert wird oder indem sie vermittels einer Amidbindung an ein BHA-Harz oder ein MBHA-Harz angelagert wird« Soll ein Methyl, Ethyl oder Propylamid in das resultierende Polypeptid eingebaut werden« dann wird ein chloromethyliertes oder Hydroxymethyl-Harz verwendet; und die Spaltung erfolgt zweckmäßigerweise unter Einsatz des geeigneten Amins wie beispielsweise Ethylamin«

Bei der Herstellung des 40 Reste aufweisenden Peptide wird beispielsweise das durch BOG geschützte AIa entsprechend der Verfahrensweise nach Monahan und Gilon, Biopolvmer 12, S« 2513-19t 1973« an das chloromethylierte Harz angekoppelt« Nach dem Anknüpfen von BOC-AIa an den Harzträgerstoff wird die alpha-aminöschützende Gruppe beseitigt» so etwa durch Einsatz von Trifluoroessigsäure (TFA) in Methylenchlorid, TFA allein oder HCl in Oioxan« Das Aufheben des Schutzes erfolgt bei einer Temperatur zwischen etwa 0 C und Raumtemperatur» Gemäß Beschreibung in Schroder & Lubke, "The Peptides", 1 S. 72-75 (Academic Press 1965) können auch andere Standärd-Spaltungsreagenten und Bedingungen für die

Entfernung spezifischer alpha-amino-schützender Gruppen verwendet werden·

Nach der Beseitigung der alpha-amino-schützenden Gruppen von Phe werden die verbleibenden alpha-amino- und seitenketten-geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge verknüpft« um so die weiter oben definierte Intermediärverbindung zu gewinnen; als Alternative zum separaten Zusetzen jeder einzelnen Aminosäure während der Synthese können einige von ihnen auch vor dem Zusetzen zum Festphasenreaktor aneinandergekoppelt werden« Die Auswahl eines passenden Verknüpfungsmittels bleibt dem Sachverstand des Bearbeiters überlaaeen. Als Verknüpfungsmittel speziell geeignet ist N,N¹-Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI).

Die in der Festphasensynthese der Peptide verwendeten Aktivierungsmittel sind im Fachgebiet weithin bekannt» Beispiele für geeignete Aktivierungsmittel sind Carbodiimide wie etwa N,N'-Diisopropylcarbodiimid_# N-Ethyl~N*«(3-di~ methylaminopropyl!-carbodiimide Weitere Aktivierungsmittel sowie deren Einsatz bei der Peptidverknüpfung sind bei Schroder & Lubke (siehe oben) in Kapitel III sowie bei Kapoor, 3__# Phar. Sei», 59, S. 1-27 (1970) beschrieben.

Dede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in etwa vierfachem oder noch stärkerem Überschuß in den Festphasenreaktor eingeleitet, worauf die Verknüpfung in einem Medium aus Dimethylformamid (DMF) : CH₂Cl₂ (1:1) oder in DMF oder CH Cl₂ allein durchgeführt werden kann. Falls eine unvollständige Verknüpfung aftritt, wird die Verknüpfungs-

Prozedur vor dem Beseitigen der alpha-amiho-schützenden Gruppe vor dem Anknüpfen der nächsten Aminosäure wiederholt» Der Erfolg der Verknüpfungsreaktion wird in jedem Stadium der Synthese durch die Ninhydrin-Reaktion überwacht, wie sie von E» Kaiser et al», Anal, Blochem, 34, 595 (1970) beschrieben wird« Die Verknüpfungsreaktionen können automatisch vorgenommen werden, so etwa auf einem automatischen Beckman 990 Synthetisierer« wobei ein Programm wie etwa das von Rivier et al,, Biopolyme rs, 1978, 17^ S* 1927-1938 , verwendet wird* _;

Nach dem Vollenden der gewünschten Aminosäuresequenz kann das intermediäre Peptid vom Harz-Trägerstoff entfernt: werden; dies erfolgt durch Behandlung mit einem Reagens wie etwa flüssigem Hydrogenfluorid, welches nicht nur das Peptid vom Harz abspaltet, sondern welches auch alle übrigen seitenkettenschützenden Gruppen X, X , X , X , X , X, X und

8 9

X , die Verankerungsbindung X und die alpha-amino-schützen-

1 '

de Gruppe X abspaltet, um das Peptid in der Form der freien Säure zu gewinnen. Befindet sich Met in der Sequenz, dann wird die schützende BOC-Gruppe unter Verwendung von Trifluoroessigsäure (TFA)/Ethandithiol vorzugsweise zuerst und vor dem Abspalten des Peptide vom Harz mit HF entfernt, um eine potentielle S-Alkylierung zu eliminieren» Wird zum Spalten Hydrogenfluorid verwendet, dann werden zwecks Spülung Anisol und Methylethylsulfid in das Reaktionsgefäß ' einbezogen»

Als ein Versuch zur Herstellung des synthetischen Peptide unter Anwendung der rekombinanten DNS-Technologie wird vor-

zugsweise ein Met-Rest als ein zusätzlicher Rest an der N-Endstelle einbezogen, wobei Met nicht andernorts im Peptid vorliegen sollte· Ähnlicherweise muß es sich bei allen im Peptid benutzten Resten um natürlich vorkommende L-Isomer-Aminosäuren oder GIy handeln. Im Ergebnis wird eine bevorzugte Peptid-Intermediärzusammensetzung mit der folgenden Formel hergestellt: H-Met-R₁-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Rg-Ser-Try-Arg-R₁₂-R₁_-Leu-

Y. Hierbei steht R₁ für Tyr, Leu oder His; RgSteht für Ser oder Asn; R₁₂ steht für Arg oder Lye; R₁₃ steht für He oder VaI; R₁₈ steht für Tyr oder Ser; R₃₄ steht für His oder GIn; R₃₅ steht für GIu oder Asp; R₃₇ steht für Ala_t Nie, He, Leu oder VaI; R₂₈ steht für Asn oder Ser; R₃₄ steht für Arg oder Ser; R₃₈ steht für GIn oder Arg; R__g steht für Arg oder GIy; R₄₀ steht für Ser oder Ala; R₄₂ steht für Phe oder Ala; R₄₃ steht für Asn oder Arg; R₄₄ ist eine natürlich vorkommende Aminosäure oder des-R_44# wobei Y die Carboxyl-Komponente , ' ; des C-Endstellen-Restes darstellt und entweder für -COOH oder CONH₂ steht,

^w Ist dieses Peptid dann erst einmal durch einen genetisch

modifizierten Mikroorganismus dargestellt und ist die Intermediärzusammensetzung unter Anwendung bekannter Verfahren dargestellt und gereinigt, dann wird die Intermediärsubstanz zwecks Abspaltung des Met-Restes an der N-Endstelle sowie zwecks Erzeugung des biologisch aktiven Peptide mit Cyanogenbromid behandelt· Wenn auch die weiter oben dargelegte For-, mel angibt, daß siuh das Peptid - wie auch andernorts im

vorliegenden Text angegeben »bis auf die Positionen 43 oder 44 erstreckt, so wird doch eine substantielle biologische Aktivität auch schon von Peptiden mit nicht mehr als 27 bis 29 Resten geliefert« wobei derartige kürzere Fragmente als für viele Zwecke generell äquivalent angesehen und in den Geltungsbereich der bevorzugten Intermediärzusammensetzung einbezogen werden« die erfindungsgemäß gewonnen und für die Peptiderzeugung vermittels der rekombinanten DNS-Technologie vorgesehen ist« '..* '

Das folgende Ausführungsbeispiel legt das bevorzugte Verfahren zur Synthese von hpWFF-Analoga vermittels der Festphasentechnik dar. Man wird selbstverständlich merken, daß die Synthese eines entsprechend kürzeren Peptidfragmentes in der gleichen Art und Weise erfolgt, wobei lediglich die erforderliche Anzahl an Aminosäuren - beginnend an der C-Endstelle - eliminiert wird«

Ausführungsbeisßiel I₁

Die Synthese von flle²^]~hpWFF(1-4O)-NH₂ mit der Formeis H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly~Gln~Leu»»Ser-Ala~Arg«-Lys-Leu-Leu-Gln-Aep-Ile-ile-Ser-Arg~Gln-Gln-Gly«»Glu«-Ser-Asn-Gln«Glu-Arg-.Gly-Ala-NH₂ erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Hydrochloridharz wie etwa dem von der Fa« Bachern, Ine«, beziehbaren mit einem Substitutions* bereich von etwa O_el bis 0,5 mMol/g Harz, Das Anknüpfen von

BOOAIa an das Harz erfolgt nach der in den Schemata A und B dargelegten allgemeinen Verfahrensweise« welche während der gesamten Synthese angewendet wird und die eine Substitution von etwa 0,35 mMol AIa pro Gramm Harz zum Ergebnis hat· Sämtliche verwendeten Lösungsmittel werden vermittels Durchspülen mit einem inerten Gas wie etwa Helium oder Stickstoff sorgfältig entgast, um so die Abwesenheit von Sauerstoff zu sichern« der den Schwefel des Met-Restes anderernfalls in unerwünschter Weise oxydieren könnte·

Nach der Entblockung und Neutralisation wird die Peptidkette schrittweise auf dem Harz aufgebaut· Entblockung« Neutralisation und das Zusetzen der einzelnen Aminosäure erfolgt in genereller Übereinstimmung mit der Verfahrensweise, wie sie detailliert im US-PS Nr. 4 292 313 nach VaIe et al. dargestellt ist.

Das Entblocken wird vorzugsweise nach dem folgenden Schema A vorgenommen:

SCHEMA A

Re a ei en s Mischzett (min)

1. 60 %;TFA/2 % Ethandithiol 10

2_e 60 % TFA/2 % Ethandithiol 15

3. IPA/1 % Ethandithiol 0,5

4. Et₃N (10 %) in CH₂Cl₂ 0,5

5. MeOH 0,5

6. Et₃N (10 %) in CH₂Cl₂ . 0,5

7. MeOH (zweimal) 0,5

8. CH₂Cl₂ (zweimal) 0,5

Die Verknüpfungen werden vorzugsweise gemäß Darstellung im folgenden Schema B vorgenommen:

SCHEMA B	Reaqens	Mischzeit (min)
9.. DCCI	mm I
10, BOC~Aminösäure	50 ... 90
11. MeOH (zweimal)	0,5
12, CH₂Cl₂ (zweimal)	0,5
13. Ac₀O (3M) in CH₀Cl-	15,0
14. CH₂Cl₂	0,5
15. MeOH	0,5
16, CH₂Cl₂ (zweimal)	0,5

Kurz gesagt, es werden ein bis zwei mMol BOC-geschützter Aminosäure in Methylenchlorid pro Gramm Harz plus ein Äquivalent 1,0 molares DCCI in Methylenchlorid für zwei Stunden verwendet» Wird BOC-Arg (TOS) angeknüpft, dann wird ein Gemisch aus 50 % DMF und Methylenchlorid verwendet. Als die schützende HydroxyIseitenkette-Gruppe für Ser und Thr wird Bzl-Ether verwendet. Zur Aktivierung des Carboxy!»Endes von Asn oder GIn wird P~Nitrophenylester (ONp) verwendet, und BOC-Asn(ONp) beispielsweise wird über Nacht angeknüpft, indem ein Äquivalent HOBt in einer 50%igen Mischung aus DMF und Methylenchlorid verwendet wird, wobei in diesem Fall kein DCC zugesetzt wird. Die Amidogruppe von Asn oder GIn wird durch Xan geschützt, wenn anstelle der aktiven Ester-Methode die DCC-Verknüpfung gewählt wird. Als schützende Gruppe für die Lys«-Seitenkette wird 2«*Chlorobenzyloxy-

carbonyl (2 Cl-Z) verwendet» Tos wird verwendet, um die Guanidino-Gruppe von Arg zu schützen, und die GIu- oder Asp-Carboxy!gruppe wird wie der Bzl-Ester (OBzI) geschützt· Die phenolische Hydroxylgruppe von Tyr wird mit 2,6-Dichlorobenzyl (DCB) geschützt. Am Ende der Synthese wird die folgende Zusammensetzung gewonnen:

X¹-Tyr(X²)-Ala-Asp(X³)-Ala-Ile-Phe-Th r(X⁴)~Asn(X⁵)-Se r(X⁴)-Tyr(X²)-Arg(X⁶)-Lys(X⁷)-Val-Leu-Gly-Gln(X⁵)-Leu-Ser(X⁴)-Ala-Arg(X⁶)-Lys(X⁷)-Leu-.Leu-Gln(X⁵)-A8p(X³)-Ile-Ile-Ser(X⁴)-Arg-(X⁶)-Gln(X⁵)-.Gln(X⁵)-Gly-Glu(X³)-Ser(X⁴)-Asn(X⁵)-Gln(X⁵)-Glu- (X³ )-Arg (X⁶J-GIy-AIa-X⁸. Hierbei gilt^X¹ ist B0C,₇X³ ist Benzylester, X* ist BzI, X° ist Xan, X ist Toe« X ist 2 Cl-Z

und X ist -NH-Harzträgerstoff, Xan kann teilweise oder vollständig vermittels TFA-Behandlung entfernt worden sein, welche angewendet wurde, um die alpha-amino-schützende Gruppe zu entblocken,

Nach-dem der finale Tyr-Rest an das Harz angeknüpft worden ist, wird BOC mit 60%iger TFA in CH₂Cl₂ beseitigt* Um das verbleibende geschützte Peptid-Harz zu spalten und zu entschützen, wird es mit 1,5 ml Anisol, 0,5 ml Methylethylsulfid und 15 ml Fluorwasserstoff (HF) pro Gramm Peptid-Harz eine halbe Stunde lang bei -20 ⁰C sowie eine halbe Stunde lang bei 0 ⁰C. behandelt« Nach Elimination des Fluorwasserstoffs unter starkem Vakuum wird das verbleibende Harz-Peptid abwechselnd mit trockenem Diethylether und Chloroform gewaschen, worauf das Peptid mit entgaster 2N wäßriger Essigsäure extrahiert und vermittels Filtration vom Harz separiert wird»

Das gespaltene und entschützte Peptid wird sodann in 0 bis 5%iger Essigsäure aufgelöst und einer Reinigung unterzogen,

~ 20 -

wobei letztere eine Sephadex-G-SO-Feingelfiltration beinhalten kann.

Das Peptid wird anschließend weiter vermittels präparativer oder semipräparativer HPLC gereinigt« wie sie bei Rivier et al«. Peptides; Structure and Biological Function« (1979), S, 125-128 sowie bei Marki et al», £. Am, Chem. Soc« 103, 3178 (1981) beschrieben ist. Zusammengefaßt dargestellt: Waters Associates prep LC-500 aufnehmende Patronen werden mit 15 bis 20 C₁₈ Silika von Vydac (30OA) gepackt. Vermittels eines Niederdruck-Eldex-Gradientenerzeugers wird ein Gradient von CH CN in TEAP erzeugt, wie dies bei Rivief, O₀, 2.0 i=iü«. Chromatography 1# 343-367 (1978) beschrieben ist. Die chromatographischen Fraktionen werden vermittels HPLC sorgfältig überwacht, und nur die betrachtliche Reinheit aufweisenden Fraktionen werden zusammengefaßt. Das Entsalzen der gereinigten und unabhängig voneinander hinsichtlich ihrer,Reinheit kontrollierten Fraktionen wird vermittels eines CH_CN-Gradienten in O,l%iger TFA erreicht. Der Mittelschnitt wird dann lyophilisiert, um das gewünschte Peptid zu erbringen, dessen Reinheit über 98 % liegt.

Die Synthese wird unter Verwendung eines chloromethylierten Harzes wiederholt, um das gleiche Peptid in freier Säurenform unter Anwendung von Verfahrensweisen zu gewinnen, wie sie allgemein bei Rivier, 0., CJ* Amer. Chem. Soc,^ 96, 2986-2992 (1974) beschrieben sind.

Ausführungsbeispiel· II ,

Die Synthese von £val²⁷, D-Ala²⁸J-hpWFF(l-40)-NH₂ mit der Formel: ι

: - 21 ~ · - ' _ .

H-Ty r-Ala-Asp-Ala- Ile-Phe-Th r-Asn~Se r-Ty r-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Val-D-Ala-Arg-Gln~Gln-Gly->Glu-Ser-Asn-Gln~Glu-Arg-Gly-Ala-NH₂ erfolgt in einer schrittweisen Form unter Einsatz eines Bookman 990 Peptld-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz in der in Ausführungsbeispiel I beschriebenen Weise· Das Peptid wird vermittels Anwendung von TLC und HPLC als im wesentlichen rein beurteilt. '

Auaführunqsbeispiel III

Die Synthese des hpWFF-Analogons £o-Tyr 3-hpWFF(l-32)-NH₂ mit der Formel: ₍

H-D-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-VaI-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH₂ erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem,MBHA-Harz in der in Ausführungsbeispiel I beschriebenen Weise· Das Peptid wird nach Prüfung mit TLC und HPLC als im wesentliehen rein beurteilt· Die optische Drehung wird auf einem fot©elektrischen Polarimeter als £K)_D = -61*4 + (C=I, 1 % Essigsäure, unkorrigiert) gemessen«

Die Synthese wird unter Verwendung eines chloromethylierten Harzes zwecks Herstellung des gleichen Peptids in der freien Säureform in der weiter oben allgemein angegebenen Form wiederholt.

Ausführungsbeispiel IV

Die Synthese des verkürzten hpWFF-Analogona £Nle J-hpWFF (1-32J-NH₂ mit der Formel:

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn«S©r-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Sef-Arg-Gln-Gln-Gly-NH» erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz in der in AusführungsbeLspiel I beschriebenen Weise« Dieses Analogon wird nach Anwendung von TLC und HPLC als im wesentlichen rein beurteilt. Die optische Drehung wird auf

2? η

einem fotoelektrischen Polarimeter als £*O _D ^a -57,8 + (C=I), 1 % Essigsäure, unkorrigiert) gemessen« Die gleiche allgemeine Synthese wird angewendet« um ^NIe J-hpWFF(l~44)-NH₂ herzustellen,

Ausführungsbeispiel· V «

Die Synthese von iNle²⁷3-hpWFF(1-27)-NH₂ mit der Formel: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-.Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-NH₂ erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz in der in Ausfuhrungsbeispiel I beschriebenen Art, Das Peptid wird nach Anwendung von TLC und HPLC als im wesentlichen rein beurteilt,

Ausfuhrungsbeispiel VI

Die Synthese von rile²⁷3-hpWFF(l-32)~0H mit der Formel: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem chloromethylierten Harz in der am Schluß von Ausführungsbeispiel I genannten Art, Das Peptid wird nach Anwendung von TLC und HPLC als im wesentlichen rein beurteilt. Die optische Drehung

op

wird auf einem fotoelektrischen Polarimeter als . £oO _D = -61,7° + 1(C»'I), ι.,% Essigsäure* unkorrigiert) gemessen.

Die Synthese wird unter Verwendung eines MBHA-Harzes wiederholt, um das gleiche Peptid in amidierter Form zu produzieren.

Ausf üh runflsbeispLel VII

Die Synthese von £O-Met \J-hpWFF(l~32)~NH₂ mit der Formel: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH₂ erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz in der in Ausführungsbeispiel I beschriebenen Weise« Das Peptid wird nach Anwendung von TLC und HPLC als im wesentlichen rein beurteilt« Die optische Drehung wird auf einem fotoelektrischen Polarimeter als £A>2 q ^a -54,5 + 1 (C=I), 1 % Essigsäure, unkorrigiert) gemessen.

Ausführungsbeispiel· VIII

Die Synthese von fH.ie\3-hpWFP(.l-32)-NH₂ mit der Formel: H-Hi 9-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Th r-Asn-Se r-Ty r-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala~Arg~Lys-Leu-Leu«Gln~Asp~Ile-Met-SeT-Arg-Gln-Gln-Gly-NHg erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz in der in Ausführungsbeispiel I beschriebenen Weise« Das Peptid wird nach Anwendung von TLC und HPLC als im wesentlichen rein beurteilt« Die optische Drehung wird auf einem fotoelektrischen Polarimeter als /?0 q « -58,7 +1 (CaI), 1 % Essigsäure, unkorrigiert) gemessen«

Die Synthese wird unter Verwendung von Phe als letztem Rest wiederholt, um £>he U~hpWFF(i-32)~NH₂ zu produzieren. Die optische Drehung wird auf einem fotoelektrischen Polarimeter als &>Oq² * -58,2° + 1 (C=I), 1 % Essigsäure, unkorrigiert) gemessen«

Ausführunpsbeispiel IX

Die Synthese von rPhe¹⁰J-hpi/VFF(l«.32)-NH₂ mit der Formel: H-Tyr-Ala-Asp-Ala~Ile-Phe-Thr~Asn~Ser~Phe~Arg->Lys-yal~Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-GIn-GIn-GIy-NH₂ erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptids-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz in der in Ausführungsbeispiel I beschriebenen Art» Das Peptid wird nach Anwendung von TLC und HPLC als im wesentlichen rein beurteilt. Die optische Drehung wird auf einem fotoelektrischen Polarimeter als £p0q -59,5° + 1 (C=I, 1 % Essigsäure, unkorrigiert) gemessen«

Ausfuhrunqsbeispiel X ,

Die Synthese vonfval²⁷J-hpWFF(l-32)-0H mit der Formel: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr~Arg~Lys-Va1-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Val-Ser-Arg-Gln~Gln-Gly-OH erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem chloromethylierten Harz in der am Schluß von Ausführungsbeispiel I angegebenen Weise« Das Peptid wird nach Anwendung von TLC und HPLC als im wesentlichen rein beurteilt. Die optische Drehung wird auf einem fotoelektrischen Polarimeter als £Wd ⁼ "*⁶²*⁴ 1 ^ (^Celf 1. % Essigsäure, unkorrigiert) gemessen«

Aus f ü h r Hfl&ebeis P₁ iel XJ₁

Die Synthese von fHis¹, Nle²⁷J-hpWFF(1-32)~NH₂mit der For

H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Glm-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg~Gln~Gln~Gly-NH_ erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz in der in Aueführungsbeispiel I beschriebenen Art, Das Peptid wird nach Anwendung von TLC und HPLC als im wesentlichen rein beurteilt« Die optische Drehung wird auf einem fotoelektrischen Polarimeter als &Q p² » -59_#3° +1 (C=I, 1 % Essigsäure, unkorrigiert) gemessen.

Ausführungsbeispiel XII

Die Synthese von RhWFF(l-43)-0H mit der Formel: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Hie-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem chloromethylierten Harz mit einem Substitutionsbereich von etwa 0,1 bis 0,5 mMol/g Harz in der in Ausführungsbeispiel VI angegebenen Art* Das Peptid wird nach Anwendung von TLC und HPLC als im wesentlichen rein beurteilt» Die optische Drehung wird auf einem fotoelektrischen Polarimeter als Γ<*3 ρ -50,8° + 1 (C»l, 1 % Essigsäure, unkorrigiert) geraessen·

Die Synthese wird unter Verwendung eines MBHA-Harzes wiederholt, um RhWFF(l-43)-NH₂ herzustellen; hierbei wird ein Anfangsschritt gemäß allgemeiner Beschreibung bei VaIe et al*

U.S,-Patent Nr, 4 292 313 vollzogen, um Asn an das MBHA-Harz anzuknüpfen. Das Peptid wird nach Anwendung von TLC und HPLC als im wesentlichen rein beurteilt· Die optische Drehung wird auf einem fotoelektrischen Polarimeter als /j^j 22 -51,7° + 1 (C=I, 1 % Essigsäure, unkorrigiert) gemessen ,

Aaf üh runcjsbeispie 1

Die Synthese von RhWFF(1-4O)-NH₂ mit der Formel: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly~Gin-Leü~Tyr«Ala~Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu~Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-NH-erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz entsprechend der allgemeinen Beschreibung in Asführungsbeispiel I, Das Peptid wird nach Anwendung von TLC und HPLC als im wesentlichen rein beurteilt* Die optische Drehung wird auf einem fotoelektrischen PoIarimeter als [oL^₀ = -56,5 + 1 (C=I, 1 % Essigsäure, unkorrigiert) gemessen,

Ausführungsbeispiel XIV

Die Synthese eines hpWFF-Analogons, d, h« /^Met , Leu ⁷]-RhIVFF(1-43)-0H mit der Formel:

H-Met-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Leu-Asn-Arg Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid Synthetisierers auf einem chloromethylierten Harz gemäß der in Ausführungsbeispiel XII beschriebenen allgemeinen Welse« Das Peptid wird nach Anwendung von TLC und HPLC als iiti wesentlichen rein beurteilt.

Ausführunpsbeispiel XV

Die Synthese eines hpWFF-Analogons, d, h, [tile ⁷J-RhWFF (1-32J-NH₂ mit der Formel:

H-H is-Ala-Asp-Ala-Ile«Phe-Thr« Se r-Se r-Ty r-Arg-A rg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr~Ala-Arg-Lys-Leu~Leu~His~Glü"»Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-NH_ erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Ausführungsbaispiel I, Dieses Analogon wird nach Anwendung von TLC und HPLC als im wesentlichen rein beurteilt,

Ausführunpsbeispiel XVI

Die Synthese eines hpWFF-Analogonfragmentes, d. h.£p-Tyr J-RhWFF(1-29)-NH₂ mit der Formel:

H-Hie-Äla-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-D-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH₂ erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Ausführungsbeispiel I* Das Peptid wird nach Anwendung von TLC und HPLC als im wesentlichen rein beurteilt»

Die Synthese wird wiederholt, wobei an der N-Endstelle D-Tyr fÜ His substituiert wird, um auf diese Weise CD-Tyr^1#^⁰J-RhWFF(l-29)-NH₂ zu produzieren.

Ausführuncisbeispiel XVII

Die Synthese eines hpWFF-Analogonfragmentes, d, h. RhWFF (i-29)-NH₂ mit der Formel: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-tGly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NHg erfolgt «chrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf

MBHA-Harz gemäß Ausführungsbeispiel III, Das Peptid wird nach Anwendung von TLC und HPLC als im wesentlichen rein beurteilt,

Ausführungsbeispiel· XVIII

Die Synthese von £ Nie²⁷J~RhVVFF(1-29)-NH_£ mit der Formel: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Giu-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-NH₂ erfolgt schrittweise unter Einsatz _x eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Ausführungsbeispiel I, Das Peptid wird nach Anwendung von TLC und HPLC als im wesentlichen rein beurteilt. Die optische Drehung wird vermittels eines fotoelektrischen Polarimetere als £*Orj ^a ' Essigsäure, unkorrigiert) gemessen.

trischen Polarimeter als £Oq = -52,6 + 1 (C=I, 1 %

Ausführuncisbeispiel XIX

Die Synthese eines hpWFF-Analogons, d, h# £o-His , D-Tyr , D-Ala¹⁵J-RhWpF(1-29J-NH₂ mit der Formel: H-D-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-D-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-D-Ala-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH₂ erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Ausführungebeispiel I, Das Peptid wird nach Anwendung von TLC und HPLC als im wesentlichen rein beurteilt·

Ausführungsbeispiel XX

Die Synthese eines hpWFF-Analogons, d, h, ^Tyr~}-RhWFF(1-29)· NH₂ mit der Formel: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-

Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg»NH₂ erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz gemäß Ausführungsbeispiel I_e Das Peptid wird nach Anwendung von TLC und HPLC als im wesentlichen rein beurteilt«

Ausführungsbeispiel XXI

Die Synthese von RhVVFF-CVaI-NH₂J mit der Formel: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-VaI-NH₂ erfolgt schrittweise unter Einsatz eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Ausführungsbeispiel I, Das Peptid wird nach Anwendung von TLC und HPLC als im wesentlichen rein beurteilt«

Zusätzlich zu den vorstehend spezifisch aufgeführten Analoga werden die im folgenden aufgeführten Analoga ebenfalls unter Anwendung der weiter oben dargelegten Festphasen-Synthesetechniken synthetisiert: £lle²⁷J-hpWFF(l-29)-NH₂, Cl!e²⁷J-hpWFF(l-29)-0H,

£D-His¹3-hpWFF(l-32)-NH_2i

ζ D-AIa²⁷J -HpWFF (1-32 )~NH₂ ₁

[ D-Tyr¹ _#Nle²⁷]-hpWFF(l-32)-NH₂, -

{D-Tyr¹-, Nle²⁷3-hpWFF(l-32)~0H,

iD-Phe¹, Val²⁷3-hpWFF(1-4O)-OH,

(His¹, Phe¹⁰3-hpWFF(l-32)-NH_2f

£D~Tyr¹ _t Nle²⁷]-hpWFF(1-4O)-OH,

(ü-Tyr ₍ Nie J-hpWFF(l-40)-Arg-Ala-Arg-Leu-0H,

tPhe¹ , Phe¹⁰»Ile²⁷J-hpWFF(1-32)*NH_p,

T¹, D-AIa¹⁵, Nle²⁷J~hpl'VFF( 1-32J-NHg, £ D-Phe¹; Phe¹⁰, D~Met²^~hpWFF(l-40)-0H_i I Ue²⁷J ^hpWFFCl^Oj-Arg-Ala-Arg^Leu-NHg, C He²⁷J-hpWFF(l~40)-Arg~Ala-Arg»Leu-0H, C¹, D-AIa¹⁵, D«Ala²⁸J»hpWFF(1-32)«NH Leu²⁷, D-Ala²⁸J-hpWFF(l-40)-0H_# ^{27 28}

NH

₂»

[His¹, D-VaI²⁷, D-Ala²⁸3-hpWFF(l~32)~ fD-Tyr¹, Phe¹⁰, D-IIe²⁷J-hpWFF(1-39)-NH₂, £val²⁷J-HpWFF(l-40)-0H₉

fVal²⁷J«hpWFF(l«40)-Arg-Ala-Arg-Leu-0H und fD-Phe¹, D-AIa¹⁵, D-NIe²⁷, D-AIa²⁸J-hpWFF( 1-32)-r

Die in verschiedenen der Ausführungsbeispiele hergestellten synthetischen Peptide werden in in-yitrp-Bestimmungen entr weder mit gereinigtem synthetischem hpWFF(1-4O)-OH oder mit gereinigtem synthetischem hpWFF(l-40)-Phe-Gln-NH₂ verglichen, um deren Wirksamkeit bei der Förderung der Freisetzung von Wachstumshormon zu bestimmen. Alle diese synthetischen Analoga besitzen eine beträchtliche Stärke, beim Hervorrufen der Freisetzung von Wachstumshormon«

Die in-vitro-Bestimmungen werden unter Verwendung des synthetischen hpWFF als eines Standards im Seite-an-Seite-Vergleich mit äquimolaren Konzentrationen der verschiedenen synthetisierten Analoga durchgeführt» Verwendet werden Kulturen, welche Zellen von Rattenhypophysen beinhalten, die vier oder fünf Tage zuvor entnommen worden waren« Die vergleichende Prüfung wird in der von VaIe et al., Endocrinology, 91, 562-572 (1972 beschriebenen allgemeinen Weise vorgenommen, wobei Kulturen verwendet werden, die hinsiht-

* . - 31 ~ , . _ . ·

lieh der Sekretion von Wachstumshormon als optimal angesehen werden« Die Inkubation mit der zu prüfenden Substanz erfolgt über 3 bis 4 Stunden hinweg; aliquote Mengen des Kulturmediums werden abgenommen und zwecks Messung ihrer Gehalte an immunoreaktivem Wachstumshormon (ir WH) yen» mittels eines gut gekennzeichneten Radioimmunoassays aufbereitet*

Die Ergebnisse dieser vergleichenden Prüfung unter Verwendung von äquimolaren Konzentrationen sind in der folgenden Tabelle I dargestellt:

TABELLE I

Peptide in vit ro

. ___w _{im <v}, , _t__ '-.„"·, Relative_i Potenz* *, „-, „

£ NIe²^D-hpWFF(1-32J-NH₂ 3,21 (2,02.,.5,43)

rHis¹3-hpWFF(l-32)-NH₂ 2,15 (1,12,«.4,41)

TlIe²^J-hpWFF(1-32)-0H 0,20 (0,11,,.0,35)

£'D-Tyr¹3-hpVVFF(l-32)-NH₂ 0,74 (0,47_βΛ,1,14)

rD-Met²⁷J-hpWFF(l-32)-NH₂ 0,22 (0,13.,.0,36)

£Phef3--hpWFF< 1-32J-NH₂ , 0,13 (0,05._#,0,29)

£PheJ°J-hpWFF(l-32)-NH₂ 0,69 (0,26...2,63)

t VaI²⁷J -hpWFF(l-32.)-OH 0,31 (0,21... 0,45)

¹,, Nle²⁷3-hpWFF(l-32)-NH₉ 3,22 (2,12...5,33)

^x^ relativ zu hpWFF(i-40)-Phe»Gln»NH₂

Die in^vit^a-Prüfung dieser synthetischen Peptide zeigt, daß die EC₅₀ von 20_e..l00 Pikomolar variiert'und daß die

.- 32 -

niedrigste effektive Konzentration 3 ««« 8 Pikomolar beträgt. Die maximale wirksam© Konzentration für hpWFF(1-40)-NH₂ betrug 1 Nanomolar»

Die Ergebnisse dieser vergleichen Prüfung für äquimolare Konzentrationen verschiedener der hpWFF-Analoga auf der Basis von RhWFF sind in Tabelle II aufgeführt,

TABELLE II

Peptide Vergleich %

hpWFF(1-4O)-OH (Standard für diese Prüfung 100

RhWFF(1-43)-0H 300

RhWFF(1-29)-NH₂ 1100

£O-TyT¹⁰J-RhWFF(1-29)-NH₂ 34

¹¹⁰-ΝΗ₂ 600

y(₂ 920 '

f Nle²⁷J-RhWFF(l-32)-NH₂ 1 390

{"Leu¹, NIe²⁷J-RhWFF(1-29J-NH₂ 480

D-His¹, D-tyr¹⁰, D-AIa¹⁶J-RhVVFF(1-29)-ΝΗ_£ 29

RhVVFF-[val⁴⁴-NH₂3 670

Die in-vitro-Prüfung dieser synthetischen Peptide zeigt, daß die EC__n von 20 bis 100 Pikomolar variiert und daß die niedrigste effektive Konzentration 3 bis θ Pikomolar beträgt. Die maximale effektive Konzentration für RhWFF(l-43) beträgt 1 Nanomolar,

Zusätzlich zu den in-vitro-Tests hinsichtlich der Sekretion von Wachstumshormon werden in-viyo-Exp e rime η t e durch Injizieren des synthetischen Peptide vermittels eines Dauer-

katheters in freilaufende normale männliche Ratten vorgenommen» Die Tiere werden mit FLA-.63, einem Dopaminhydroxylase-Inhibitor, vorbehandelt, welcher die spontane Sekretion von Wachstumshormon unterdrückt, ohne dabei die Reaktion auf exogenen VVFF zu beeinträchtigen. Durch den gleichen Katheter werden unmittelbar vor sowie 5 und 20 min nach den Injektionen Blutproben entnommen; die Wachstumshormonpegel im Blut werden vermittels Radioimmunoassay gemessene Die Ergebnisse zeigen« daß synthetische hpWFF« Analoga kraftvolle Stimulatoren der Sekretion von Hypophysen-Wachstumshormon 'sind, Dosierungen zwischen etwa 20 Nanogramm und etwa 25 Mikrogramm pro kg Körpermasse erweisen sich als wirksam«

Weitere Prüfung zeigt, daß die in den anderen Ausführungsbeispielen synthetisierten anderen synthetischen phWFF-Analoga beträchtliche Potenzen aufweisen; aus diesen Prüfungen können einige allgemeine Schlußfolgerungen abgeleitet werden:

1. C-termlnale Amidierung scheint die Aktivität von WFF-Peptiden einer Kettenlänge von mehr als 39 Resten nicht zu steigern, a© steigert jedoch die Potenz von Peptiden mit einer Länge von weniger als 39 Resten« Γΐΐβ JUhpWFF

(1-32J-NH₂ beispielsweise ist potenterals rile²⁷J-hpWFF (l-32)-0H;

^¹, Nle²⁷J-hpWFF(l-32)-NH₂ ist potenter als

^y, Nle²⁷J-hpWFF(l-32)-0H,· und

£lle²⁷J-hpWFF( 1-29J-NH₂ ist Potenter als rHe²⁷J-hpWFF

(1-29J-0H* rile²⁷3-hpWFF(1-44J-NH₀ allerdings ist genauso

' #«· 27·» · ι · ' '

potent wie rileJ-hpWFF(l-44)-GH.

2. In äer Reihe der amidierten Peptide sind die Analoga mit 32 Resten im wesentlichen genauso potent wie die entsprechenden längeren Analoga; beispielsweise hat CtJIe J-hpWFF'(l-32)-NH₂ etwa de gleiche Potenz wie/NIe²⁷J-hpWFF

3* In der Reihe der Peptide mit freien Carboxy-Endstellen sind die entsprechenden Analoga mit mehr als 39 Resten gleichermaßen potent« So sind beispielsweisejfval y-hpWFF (1-4O)-OH und £Val²⁷J-hpWFF(1-44)-0H äquipotent, wie dies auch bei £D-Tyr³V Nle²⁷J-hpWFF( 1-4O)-OH und £D-Tyr¹, NIe²⁷J-* hpWFF(l-44)-0H der Fall ist,

Syntötische hpWFF-Analoga dürften in jenen Einsatzgebieten zweckdienlich sein, in denen der Arzt die Produktion an Wachstumshormon zu steigern wünscht« Die Stimulation der WH-Sekretion durch hpWFF-Analoga ist von Interesse bei Patienten mit vollständigem oder relativem VVH-Ma ng el infolge Unterproduktion von endogenem WFF* Darüber hinaus ist es wahrscheinlich, daß eine gesteigerte WH-Sekretion sowie sie begleitende Wachstumssteigerung auch bei Menschen oder Tieren mit normalen WH-Pegeln erzielt wird; Desgleichen dürfte die Verabreichung von hpWFF den Körperfettgehalt verändern sowie andere WH-abhängige metabolische, immunologische und entwicklungsbedingte Prozesse modifizieren« So können hpWFF-Analoga beispielsweise als Hilfsmittel zur Stimulierung anabolischer Prozesee beim Menschen unter Umständen wie etwa nach dem Erleiden von Verbrennungen dfenlich sein« Als weiteres Beispiel kann die Verabreichung von hpWFF-Analoga an Nutztiere wie etwa an Küken, Puten, Schwei-

ne, Ziegen, Rinder und Schafe gelten, um deren Wachstum zu beschleunigen und das Ertragsverhältnis von Protein zu Fett zu steigern» Sie können in der Gewässerbewirtschaftung im Rahmen der Fischhaltung sowie der Haltung anderer kaltblütiger Seetiere wie etwa von Meeresschildkröten, Aalen und Amphibien eingesetzt werden. Zur Verabreichung an den Men» sehen sollten die synthetischen hpWFF-Analoga eine Reinheit von mindestens etwa 93 % - vorzugsweise aber 93 % - aufweisen« Dieser Wert drückt aus« daß das jeweils beabsichtigte Peptid in dem genannten Masseprozentsatz an sämtlichen vorliegenden ähnlichen Peptiden und Peptidfragmenten beteiligt ist.

Für de Verabreichung von synthetischen hpWFF«Analoga an Nutztiere sowie ah andere Tiere zwecks Wachstumsbeschleunigung und Fettgehaitsverminderung kann eine Reinheit von nicht mehr als etwa 5 % oder sogar auch nicht mehr als etwa 0,001 % akzeptabel sein· Werden die Analoga vermittels gentechnischer Verfahren hergestellt, dann können die Analoga anfangs sehr geringe Reinheiten aufweisen«

Synthetische hpWFF-Analoga oder deren nicht toxische Salze können, kombiniert mit einem pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch annehmbaren Trägerstoff zwecks Bildung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, an Tiere einschließlich den Menschen entweder intravenös, subkutan, intramuskulär, intranasal oder oral verabreicht werden» Die Verabreichung kann von einem Arzt vorgenommen werden, um die Freisetzung von Wachstumshormon zu stimulieren, wenn der zu behandelnde Wirtsorganismus einer derartigen therapeutischen Behandlung

bedarf. Die erforderliche Dosis wird sich nach dem jeweils zu behandelnden Zustand, nach der zeitlichen Dauer des Zu-Standes und nach der Dauer der gewünschten Behandlung richten.

Derartige Peptide werden häufig in Gestalt pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch annehmbarer nichttoxischer Salze verabreicht; so etwa als Säureadditionssalze oder Metallkomplexe z« B, mit Zink, Eisen oder dergleichen (wobei diese als im Rahmen der vorliegenden Anmeldung zweckmäßige Salze gelten)₀

Veranschaulichend für derartige Säureadditionssalze sind Hydrochloride Hydrobromidj Sulfat, Phosphat, Maleat, Acetat, Zitrat, Benzoat, Sukzinat, Malat, Askorbat, Tartrat und dergleichen, Soll der Wirkstoff oral in Tablettenform verabreicht werden, dann kann die Tablette einen Bindestoff wie etwa Tragant, Maisstärke oder Gelatine; einen Zerfallstoff wie etwa Alginsäure; sowie ein Gleitmittel wie etwa Magnesiumstearat enthalten« Ist eine Verabreichung in flüssiger Form gewünscht» dann können Süß- und/oder Geschmacksstoffe zugesetzt werden; die intravenöse Verabreichung kann in physiologischer Kochsalzlösung, Phosphatpufferlösungen oder dergleichen vorgenommen werden»

An Menschen sollten die Peptide unter der Leitung eines Arztes verabreicht werden, wobei die pharmazeutischen Zusammensetzungen das Peptid gewöhnlich in Verbindung mit einem herkömmlichen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff enthalten werden« Die parenterale Dosis wird gewöhnlich von etwa 20 Nanogramm bis zu etwa 25 Mikrogramm Peptid pro Kilogramm Wirts-Körpermasse betragen»

Wenn auch die E_rfindung unter Bezug auf ihre bevorzugten Verkörperungen beschrieben worden ist, welche die den Erfindern derzeit bekannte beste Art und Weise der Realisierung darstellt, so sollte es sich von selbst verstehen, daß sich dem Fachmann eventuell anbietende verschiedene Veränderungen und Modifikationen angewendet werden können, ohne daß damit vom Geltungsbereich der Erfindung, wie er in den angefügten Patentansprüchen niedergelegt ist, abgewichen wird. So können beispielsweise Modifikationen in der Peptidkette und dabei spezielle an der Carboxy!-Endstelle des Peptide beginnende Tilgungen entsprechend der heutzutage bekannten experimentellen Praktiken zwecks Erzeugung von Fragmenten vorgenommen werden, die sämtliche oder doch sehr beträchtliche Anteile der Potenz des Peptide weiter behalten; derartige Peptide gelten als innerhalb des Geltungsbereiches der Erfindung befindlich. Desgleichen können Additionen entweder zu einer der Endstellen oder zu beiden Endstellen vorgenommen werden und/oder es können allgemein äquivalente Reste fürnatürlich vorkommende Reste substituiert werden wie dies im Gesamtgebiet der Peptidchemie weithin bekannt ist - um Analoga mit zumindest einem beträchtlichen Anteil der Potenz des nativen Polypeptide zu produzieren; auch damit wird vom Geltungsbereich der Erfindung nicht abgewichen.

Verschiedene Merkmale der Erfindung werden in den folgenden Patentansprüchen betont.

Claims

Erfindu n$ sa nsprujeh

1, Verfahren zur Herstellung von WFF-An&loga , gekennzeich net dadurch, daß diese durch die Formel (I) defiriert werden: / . -

R₁₅-GIn-Le u-R^g-Ala-Arg-Lyö-Leu-LeU-R₂₄-R₂₅-IIe-R₂₇-

R₄₃-R₄₄-Y, in welcher R₃. für Tyr, Met, D-Tyr, Phe, D-Phe, Leu, D-His oder His steht; R_Q ist Ser oder Asn; R₁₀ ist Tyr, Phe oder D-Tyr; R₁₂ ist Arg oder Lys; R₁₃ ist He oder VaI; R₁₅ ist GIy oder D-AIa; R₁₈ ist Tyr oder Ser; R₂₄ ist His oder Gin; R₂₅ ist GIu oder Asp; R₂₇ ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus den D- und L-Isomeren von AIa, Nie, lie, Leu, Met und VaI besteht; R₂₈ ist Ser, Asn oder D-AIa; R₃₄ ist Arg oder Ser; R₃₈ ist GIn oder Arg; R₃₉ ist Arg oder GIy; R₄₀ ist Ser oder Ala; R₄₂ ist Phe oder Ala; R₄₃ ist Asn oder Arg; R₄₄ ist eine natürliche Aminosäure oder ^eS-R₄₄; und Y bezeichnet die Garboxyl-Komponente des Aminosäurerestes an der G-Endstelle und entspricht dem Radikal -COOR, -CRO_t -CONHNHR, -CON(R)(R') oder -CHgOR, wobei R und R¹ für niederes Alkyl, fluorniederes Alkyl oder Wasserstoff stehen, allerdings vorausgesetzt, daß wenn R₁ für Tyr steht, R₂₇ dann nicht Met entspricht sowie daß Rg für Ser steht, R₁₂ für Arg steht, R₁₃ für He steht, R₁₈ für Tyr steht, R₂₄ für His steht, R₂₅ für GIu steht, R₃₉ für Asn steht, R₃₄ für Arg steht, R₃₈ für GIn steht, R₃₉ für Arg steht, R₄₀ für Ser steht, R₄₂ für Phe steht oder R₄₃ für Asn steht'} vorausgesetzt weiter, daß irgendeiner oder sämtliche der Reste

28 bis 44 getilgt werden können, um ein biologisch aktives Fragment zu erbringen; oder ©in nichttoxisches Salz der vorstehenden Verbindungen, gekennzeichnet weiter dadurch, daß sich das Verfahren zusammensetzt aus dem (a) Bilden eines Peptide mit mindestens einer schützenden Gruppe und der Formel (II):
^{1 23}

X¹^₁(X oder X²J-AIa-ASp(X³J-AIa-IIe-PhO-ThT(X⁴J- oder X⁵)-Ser(X⁴)-R₁₀(X²)-Arg(X⁶)-R_JL₂(X⁶ oder X⁷)-R₁₃,Leu-R₁₅-Gln-(X⁵J-LeU-R₁₈(X²J-Ala-Arg(X°J-LyS(X⁷JLeULeUR

₁₅(J₁₈gy₂₄ (X oder X⁵J-R₂₅(X³J-He-R₂₇-R₂₉(X⁴ oder X⁵)-Arg(X⁶)-Gln-(X⁵J-GIn(X⁵J-GIy-GIu(X³J-R₃₄(X^ oder X⁶)-Asn(X⁵J-GIn(X⁵J-GIu(X³J-R₃₈(X⁵ oder X⁶)-R₃₉(X⁶J-R₄₀(X⁴)-Arg(X⁶)-R₄₂-R₄₃-(X⁵ oder X J-R₄₄(X⁸J-X⁹, in welcher X» X¹* Χ²* X³» X⁴J X⁵# X⁶« X⁷ und X⁸ jeweils entweder Wasserstoff oder eine schützende Gruppe sind und in wel-

9
eher X entweder eine schützende Gruppe oder eine Verankerungsbindung an einen Harz-Trägerstoff oder des-X ist, wobei im genannten Fall der Rest an der G-Endstelle eine Carboxy-Komponente aufweist, bei der es sich um Y

handelt; (bj Abspalten der schützenden Gruppe bzw. Gruppen oder der Verankerungsbindung von dem genannten Peptid der Formel (HJ; und (c) - sofern gewünscht - Umwandeln eines resultierenden Peptide in eines seiner nichttoxischen Salze«

! J

' ' 1

Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß X für Wasserstoff oder eine alpha-amino~schützende₍Gruppe steht; X ist Wasserstoff oder eine schützende Gruppe für den Imidazolstickstoff von His; λ ist Wasserstoff oder eine schützende Gruppe für die phenolische Hydroxyl-Grup-

pe von Tyr; X^d. ist.. Wasserstoff oder eine schützende Gruppe für die Carboxy-Gruppe von Asp oder Ou; X ist Wasserstoff oder eine schützende Gruppe für die alkoholische Hydroxyl-Gruppe von Ser und Thri X ist Wasserstoff oder eine schützende Gruppe für die Amido-Gruppe von Asn oder Gin; X ist Wasserstoff oder eine schützende Gruppe für die Guanidino-Gruppe von Arg; X ist Wasserstoff oder eine schätzende Gruppe für die Seitenketten-Aminogruppe von Lys*

3, Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß X für Wasserstoff oder Tos steht, X ist BOC, X ist DCB,

X³ ist OBzI, X⁴ ist BzI, X⁵ ist Xan, X⁶ ist Tos, X⁷ ist

8
2-Chlorobenzyloxycarbonyl und X ist «NH-Harzträgerstoff·

4. Verfahren nach irgendeinem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß R₁ für His steht*

5« Verfahren nach irgendeinem der Punkte 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß Y für CONH₂ steht,
6. Verfahren nach irgendeinem der Punkte 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß R₂₇ für Nie steht*

7, Verfahren nach irgendeinem der Punkte 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß R₁₀ für Tyr steht, R₁₅ für GIy

steht und R₂_ für Ser steht*
8. Verfahren¹nach irgendeinem der Punkte 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß R₁₀ für Tyr steht, R₁₅ für D-AIa

steht und R₀₀ für D-AIa steht·

.. - 41 - -
9. Verfahren nach irgendeinem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß FL für D-Tyr steht und R₃₇ für Nie, VaI oder lie steht,

1O_# Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung eines synthetischen Peptide, gekennzeichnet dadurch, daß dieses die Sequ enz His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Th r-Se r-Se r-Ty r-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Ty r-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn~Arg-Gln~Gln-Gly~Glu-Arg-Asn-Gln-Glu~Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn aufweist.
11. Verfahren nach irgendeinem der Punkte 1 bis 10, gekennzeichnet dadurch, daß dte Reste 33 bis 44 getilgt werden»