DD218904A1 - Verfahren zur herstellung von peptiden - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die nach vollstaendiger bzw. partieller Schutzgruppendeblockierung als Peptidpharmaka bzw. als Zwischenprodukte von Wirkstoffen dienen koennen. Ziel der Erfindung ist die Herstellung chiral einheitlicher Peptide. Durch die Erfindung wird die sonst bei enzymatischen Segmentverknuepfungen mit zunehmender Kettenlaenge der Reaktanden auftretende Loeslichkeitsverringerung entscheidend zurueckgedraengt, wodurch darueber hinaus beim Einsatz von immobilisierten Proteasen eine kontinuierliche Prozessgestaltung ermoeglicht wird. Die Peptide werden hergestellt aus einer selektiv geschuetzten Aminosaeure oder einem selektiv geschuetzten Peptid, bei denen die in Reaktion tretende Carboxygruppe unblockiert ist oder eine Estergruppe traegt, und einer selektiv geschuetzten Aminosaeure oder einem selektiv geschuetzten Peptid einschliesslich der entsprechenden Amide, bei denen die in Reaktion tretende Aminogruppe ungeschuetzt ist. In einem proteasespezifischen Puffersystem, dem erforderlichenfalls kleinere Anteile organischer Loesungsmittel zugesetzt werden koennen, unter Verwendung solubilisierender Schutzgruppen in Gegenwart loeslicher oder immobilisierter Proteasen. Diese Peptide koennen nach Abspaltung der Schutzgruppen als Pharmaka oder nach partieller Deblockierung als Zwischenprodukt fuer die Synthese von Peptidwirkstoffen eingesetzt werden.
Description
Verfahren zur Herstellung von Peptiden
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die nach vollständiger bzw· partieller Schutzgruppendeblockierung als Peptidpharmaka bzw· als Intermediate von Wirkstoffen dienen können·
Charakteristik der bekannten technischen .Lösungen
Zur Herstellung von Peptiden können verschiedene organisch-chemische Kupplungsmethoden (vgl. Übersichten: Wünsch, E. (1974) Synthese von Peptiden, in Houben-Weyl, Bd· 15, 1/2, Methoden der organischen Chemie, Müller, B. (Hrsg·) Georg Thieme Verl., Stuttgart; Jakubke, H.-D. u· Jeschkeit, H. (1982) Aminosäuren, Peptide, Proteine, Akademie-Verl·, Berlin) eingesetzt werden, oder man verwendet zwecks Ausschaltung des Racemisierungsrisikos geeignete proteolytische Enzyme als Biokatalysatoren für den Peptidknüpfungsschritt (vgl· Übersichten: Jakubke, H.-D· u. -.Kuhlry P. (1982) Pharmazie 21, 89; Chaiken, I.M·, Komoriya, A*, Ohno, M·, Widmer, F· (1982) Appl. Biochenu Biotechnol· 2, 385)·
Bei den bekannten Verfahren der enzymatischen Peptidsynthese erfolgt die Knüpfung der Peptidbindung in Gegenwart von Proteasen unter Verwendung geeigneter Puffersysteme und oftmals unter Zusatz von organischen Lösungsmitteln, um die partiell geschützten Reaktanden weitgehend
in Lösung zu halten© Mit zunehmender Kettenlänge verringert sich die Löslichkeit der terminal partiell blökkierten Peptidsegmente· Die Zugabe hoher Anteile organischer Lösungsmittel ist in der Regel nicht möglich, da dadurch Proteasen irreversibel geschädigt werden können· Insbesondere ist beim Einsatz immobilisierter Proteasen eine wesentliche Voraussetzung für eine kontinuierliche Prozeßführung, daß sich sowohl Ausgangsprodukte als auch das Kupplungsprodukt im Reaktionsmedium lösen·
Ziel der Erfindung ist die Herstellung von chiral einheitlichen Peptiden durch proteasekatalysierte Verknüpfung der Reaktanden unter Einsatz von reversibel abspaltbaren solubiIisierenden Schutzgruppen·
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die sonst bei enzymatischen Peptidsynthesen mit zunehmender Segmentkettenlänge nachgewiesene Löslichkeitsverschlechterung der Reaktanden entscheidend zu verringern und beim Einsatz ' von immobilisierteil Proteasen durch Erhöhung der Produktlöslichkeit eine kontinuierliche Prozeßgestaltung zu ermöglichen·
Brfindungsgemäß werden Peptide hergestellt aus einer selektiv geschützten Aminosäure oder einem selektiv geschütztem Peptid, deren in Reaktion tretende Carboxygruppe unblockiert ist oder eine Estergruppierung trägt, und einer selektiv geschützten Aminosäure oder einem selektiv geschützten Peptid einschließlich der entsprechenden Amide, bei denen die in Reaktion tretende Aminosäure unblokkiert ist, in einem proteasespezifischen Puffersystem, dem gegegenenfalls geringe Anteile organischer Lösungs- j
mittel zugesetzt werden können, unter Verwendung solubi- j
lisierender Schutzgruppen in Gegenwart löslicher oder im- j
mobilisierter Proteasen· Nach beendeter Peptidsynthese, j
Produktabtrennung und Aufarbeitung können die Schutzgrup- I
pen erforderlichenfalls nach bekannten Methoden partiell oder vollständig abgespalten werden· Im Gegensatz zu bekannten enzymatischen Peptidsynthesen mit konventionellen Schutzgruppen wird durch die erfindungsgemäße Verwendung einer solubilisierenden Estergruppierung für die Ν-geschützte Oarboxykomponente deren Löslichkeit erhöht, wodurch bei Einsatz von Serin- bzw· Thiölproteasen Segmentverknüpfungen unter Produktausfällung ermöglicht werden«
Eine zusätzliche solubilisierende Schutzgruppe am C-Terminus der Aminokomponente erlaubt unter diesen Bedingungen eine Segmentkonlation ohne Produktausfällung· Sine solche kinetisch Kontrollierte Peptidverknüpfung ist Voraussetzung für eine kontinuierliche Prozeßgestaltung unter Einsatz immobilisierter Proteasen· Die Erfindung eignet sich aber auch sowohl für die Segmentverknüpfung, bei der entweder die cC-Aminofunktion der Carboxykomponente oder die Carboxyfunktion der Aminokomponente mit einer solubilisierenden Gruppierung substituiert ist, als auch für die enzymatisch^ Kondensation von Segmenten, deren zu schützende Punktionen vollständig mit solubilisierenden Sohutzgruppen blockiert sind· ^
Die Erfindung soll nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden·
In den Beispielen werden die Aminosäuren nach den international gültigen Regeln abgekürzt· Zusätzlich werden folgende Abkürzungen verwendet: ;
Z . Benzyloxycarbonyl
Boc tert»-Butyloxycarbonyl
OMe Methylester
OBz/SO-Na 4-Sülfobenzylester
OCho Cholinester
OEt(S2O3Na) 2-Thiosulfatoethylester
Synthese von Boc-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH^ 73,3 mg (0.1 mmol) Boc-Gln-Phe-Phe-OBzl-SOJJa werden in 0,5 ml NaHCO3ZNa2CO3 (0.2 M, pH 10) und 0,3 ml 33MP gelöst, mit 35,4 mg (0.1 mmol) H-Gly~Leu-Met-NH2 versetzt und nach Zugabe von ,10 mg Chymotrypsin 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Nach Stoppen der Reaktion mit 2 ml 1 N HCl wird das ausgefallene Produkt abgefrittet und nacheinander mit Wasser, 1 N HCl, Wasser, NaHCO^-Lösung sowie noch zweimal mit Wasser gewaschen und getrocknet· Ausb. 55,5 mg (66 % d* Th) IV 235 - 2380C
Synthese von Z-TyrtEzD-Pro-Phe-Leu-Gly-NH»
84.2 mg (0.1 mmol) Z-Tyr(Bzl)-Pro-Phe-OBzl-S03Na werden in 0,6 ml NaHCO3ZNa2CO3 (0.2 M; pH 10) und 0.4 ml DMi1 gelöst, mit 67,2 mg (0.3 mmol) H-Leu-Gly-NH« versetzt und nach Zugabe von 10 mg Chymotrypsin 10 min bei Raumtemperatur gerührt und wie unter 1) aufgearbeitet.
Ausb. 52,1 mg (64 % d. Th.) F. 97 - 99°C
Synthese, von Z-Ala-Phe-Ala-Ala-NH^.
53.3 mg (0.1 mmol) Z-Ala-Phe-Oßt (S2O3Na) und 98 mg (0.5 mmol) H-AIa-AIa-NH2*HCl werden in 1,5 ml Michaelispuffer (pH 8) und 0,5 ml 1N NaOH gelöst und bei Raumtemperatur 20 min mit 2,5 mg Chymotrypsin gerührt. Öie Aufarbeitung erfolgt wie unter 1) angegeben.
Ausb. 32,7 mg (64 % d. Th.) P. 266 - 27O0C
.· _;.y: ;ί ..; . . ; ~ 5 - . ' .
41 mg (0.1 mraol) Z-Pro-Phe-OMe werden in 0,3 ml Methanol gelöst, dazu 452 mg LeU-GIy-OPOSg000 (entspr. 0,1 mmol Leucin) und 2,5 mg Chymotrypsin in 2,5 ml 0,2 M Phosphatpuffer pH 8 gegeben und gerührt· Nach 60 min wird mit NaCl gesättigt und mehrmals mit CH2Cl2 extrahiert, die Extrakte über Ua2SO. getrocknet, i. Vak· eingeengt und der Rückstand aus Ethanol kristallisiert.
i . '
Ausb. 325 mg Polymerpeptid mit einem Gehalt an Z-Pro-Phe-Leu-Gly von 52 % (Aminosäureanalyse) Die Verwendung von 82 mg (0.2 mmol) führt zu einer Tetrapeptidausbeute nach 30 min von 89 %·
Synthese von Z-Phe-Leu-HH^
a) 160 mg Z-Phe-OPOSgooo (entspr. o.o5mmol Phe) und 16,7 mg (0.1 mmol) Leu-NH2»HC1 werden in.5 ml Phosphatpuffer mit 5 mg Chymotrypsin 20 min gerührt. Der Niederschlag wird abgesaugt, mit gesättigter NaHCO,-Lösung und 1N HCl gewaschen und getrocknet·
Ausb. 8,7 mg (42 % d. Th.) P. 189 -1910C
b) 42,1 mg (0.1 mmol) Z-Phe-OCho und 83,5 mg (0.5 mmol) H-LeO-HHg-HOl werden in 1,5 ml Michaelispuffer (pH 8) und 0,5 ml 1N NaOH gelöst und bei Raumtemperatur 20 min mit 2,5 mg Chymotrypsin gerührt. Die. Aufarbeitung erfolgt wie unter 1) beschrieben.
Ausb. 26,6 mg ((4,7 % d. Th.) P. 189 - 1910C
Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung von Peptiden, bei welchem eine mit einer oC-Arainoschutzgruppe blockierte Aminosäure oder ein entsprechend geschütztes Peptid, deren in Reaktion tretende Carboxygruppe unblockiert ist oder eine Sstergruppierung trägt, mit einer an der G-terminalen Carboxyfunktion geschützten bzw· freien Peptid einschließlich der entsprechenden Amide, bei denen die in Reaktion tretende Aminogruppe unblockiert ist, in einem proteasespezifischen Puffersystem, dem erforderlichenfalls Anteile organischer Lösungsmittel zugesetzt werden können, mit einer Protease umgesetzt wird, wobei nach beendeter Kupplung und beschriebener Aufarbeitung eine partielle oder totale Schutzgruppendeblockierung folgt, dadurch g e k e η η ζ e i c h η e t, daß zur reversiblen Blockierung der N-terminalen Aminofunktion der Carboxykomponente sowie der C-terminalen Funktionen der Carboxy- und Aminokomponente eine oder mehrere solubilisierende Schutzgruppelia eingesetzt werden·
2· Verfahren nach Punkt 1, dadurch g e k e η η ζ e i c h η e t, daß bei Einsatz von Serin- und Thiolproteasen solubilisierende Esterschutsgruppen an der Carboxykomponente verwendet werden·
3· Verfahren nach Punkt 1, dadurch g e k e ηän zeichnet, daß solubilisierende Ssterschutzgruppen an der Carboxykomponente und weitere solubilisierende Schutzgruppen am K-Terminus der Carboxykomponente und/oder am C-Terminus der Aminokompönente in Gegenwart immobilisierter Serin- und Ihiolproteasen eine Peptidverknüpfung in homogener Phase ermöglichen·
4· Verfahren nach Punkt 1, dadurch g e k e η η ze i c h η e t, daß als solubilisierende Schutzgruppen die folgenden verwendet werden: Polyoxyethylen, Thiosulfatoalkyl-, Sulfobenzyl-, Cholin-, Carnitinester·
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1983
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