DD219291A1 - Pruefungsverfahren fuer den mikrobiologischen seitenkettenabbau von steroidvorprodukten - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung bezieht sich auf ein Pruefungsverfahren fuer den mikrobiologischen Seitenkettenabbau von Steroidvorprodukten, insbesondere auf aus Tallprodukten isolierten b-Sitosterolen. Das Ziel der Erfindung besteht in der Erhoehung der Aussagefaehigkeit zur Fermentierbarkeit verunreinigter b-Sitosterole. Die erfindungsgemaesse Loesung sieht die Auswertung der temperaturabhaengigen Laengenaenderung einer b-Sitosterolkristallprobe in der Naehe des Schmelzpunktes des b-Sitosterols unter definierten Analysenbedingungen vor. Die Auswertung erfolgt mittels des Flaecheninhalts, der durch die gewonnenen Messpunkte und die Temperaturachse in den Grenzen vom Abweichen der Laengenaenderungsmesspunktreihe von der Nullinie bis zum definierten Schmelzpunkt des b-Sitosterols gegeben ist. Die Flaeche ist direkt proportional der biologischen Wirksamkeit des b-Sitosterols.
Description
Hierzu 1 Blatt Zeichnung
Die Erfindung betrifft ein Prüfungsverfahren für den mikrobiologischen Seitenkettenabbau von Steroidvorprodukten, insbesondere von aus Tallprodukten isolierten /3-Sitosterolen. .
Die gegenüber chemischen Reaktanten vergleichsweise hohe Selektivität haben die Mikroorganismen auch in der industriellen Steroidsyrithese Eingang finden lassen. Allerdings ist ihre Anwendung aus den vielfältigsten Gründen nicht immer im gewünschten Umfang möglich.
Beispielsweise ist nach DE 2936125 bekannt, Sterole über Mikroorganismen vom Stamm der ATCC 31385 einem Seitenkettenabbau zu 17-C-Steroidverbindungen zu unterwerfen.
Voraussetzung für die Bildung des Endproduktes in ökonomisch vertretbaren Ausbeuten ist jedoch, daß das sterolhaltige Ausgangsprodukt frei beziehungsweise weitestgehend frei von die biologische Aktivität des Mikroorganismus blockierenden Begleitstoffen ist. Diese hemmende Wirkung kann von chemisch recht unterschiedlichen Spezies ausgelöst werden, so daß in aller Regel weder über die Konzentration noch über den chemischen Bau auf ihre inhibierende Wirkung geschlußfolgert werden
kann. \ .. ' .
So schien beispielsweise die bei der Zelluloseproduktion anfallende und bis zu 3% mit /3-Sitosterol angereicherte Sulfatharzseife für den mikrobiologischen Abbau aussichtsreich zu sein, allerdings stellten sich unter den Bedingungen einer Großproduktion vor allem bei der Anreicherung des Sterols einige gravierende Mängel heraus. Das chargenweise anfallende, verunreinigte, aus dem Teilprodukt isolierte /3-Sitosterol zeigt in bezug auf die Fermentierbarkeit recht ausgeprägte Eigenschaften.
Einige/3-Sitosterolchargen lassen sich problemlos dem mikrobiologischen Abbau unterwerfen, andere wiederum sind dem Mikroorganismus gegenüber resistent.
Um Zufälligkeiten der beschriebenen Art auszuschließen, wird in Anlehnung in das in der DE 2936125 beschriebene Verfahren die Fermentierbarkeit an Sitosterolproben mit dem gewünschten Mikroorganismus unter stimulierten Bedingungen überprüft.
Bei positivem Ausgang des Tests gilt die geprüfte Sitosterolcharge als problemlos verarbeitbar. Sobald der Anwender zu einem negativen Ergebnis gelangt, kann die Weiterverarbeitung der /3-Sitosterolcharge verhindert werden. Allerdings ist der Anwender damit nicht in die Lage versetzt, noch korrigierend auf die /3-Sitosterol-Herstellung einzuwirken. Obwohl alle die biologische Wirkungen verursachenden Stoffe mit diesem Testverfahren erfaßt werden, kommt ihm aufgrund der langen Zugriffszeiten von 3 bis 5 Tagen nur eine begrenzte Kontrollmöglichkeit zu. Vorrangig ist seine Wirksamkeit dadurch eingeschränkt, daß die Ergebnisse nicht unmittelbar nach Abschluß der /3-Sitosterolherstellung dem Anwender zur Verfügung stehen.
Als äußerst substil bei der Beurteilung der Verunreinigungen des /3-Sitosterols muß die Gaschromatographie bewertet werden.
Mit ihr lassen sich umfangreiche Aussagen zu Konzentrationen ermitteln, jedoch bietet die breitgefächerte Information keine Gewähr dafür, daß die zu erwartende biologische Aktivität des Endproduktes /3-Sitosterols korrekt ermittelt wird.
Im Hinblick auf die Verwendungsfähigkeit der bekannten Verfahren sind folgende Nachteile feststellbar:
Die zusätzliche Information über die Erfassung chemischer Verbindungen im /3-Sitosterol mittels Gaschromatographie reicht für die Beurteilung der biologischen Abbaubarkeit nicht aus.
Die über die biologischen Testungen gewonnenen Ergebnisse stehen dem Anwender zu spät zur Verfügung, um mit ihrer Hilfe
den Herstellungsprozeß des/3-Sitosterols noch zu beeinflussen. ,
Das Ziel der Erfindung besteht in der Erhöhung der Aussagefähigkeit zur Fermentierbarkeit verunreinigter /3-Sitosterole. Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Prüfungsverfahren zu schaffen, daß die Beurteilung mikrobiologischer Reaktionen an verunreinigten /3-Sitosterolen ohne die Vornahme zusätzlicher biologischer Testverfahren und Identifizierung der Begleitstoffe ermöglicht.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Prüfungsverfahren für den mikrowellen Seitenkettenabbau von Steroidvorproduktion gelöst, das die thermische Längenänderung der zu untersuchenden /3-Sitosterokristallprobe unter definierten Bedingungen von Druck, Temperatur und Zeit registriert, welches dadurch charakterisiert ist, daß die temperaturabhängige Längenänderung der unter einem Druck von 0,5 bis 10kpcm~2 stehenden Probe bei einer Aufheizgeschwindigkeit von 0,5 bis 15"CmJnT1 in derJMähedes Schmelzpunktes des/3-Sitosterols kontinuierlich gemessen und daß die biologische Wirksamkeit des /3-Sitosterols dem Flächeninhalt, begrenzt durch die Meßpunkte und die Temperaturachse in den Grenzen vom Abweichen der Meßpunktreihe von der Nuilinie bis zum definierten Schmelzpunkt des /3-Sitosterols, proportional zugeordnet wird.
Das Flächenintegral (nach Fig. 1) vor der definierten Schmelzpunktiage steht in einem eindeutigen Zusammenhang zur Permentierbarkeit und kann in dieser komplexen Aussage durch keine bisher angewandte Methode zur Beurteilung von /3-Sitosterolkristallisaten aus Tallprodukten ersetzt werden. Das Integral erfaßt explizit sowohl alle polaren als auch unpolaren
Begleitstoffe der Hauptkomponente /3-Sitosterolkristallisat und damit die inhibierend wirkenden Begleitstoffe. Der Zahlenwert des Integrals wird bei konstanter Aufnahmetechnik ermittelt. :
Der definierte Schmelzpunkt der Hauptkomponente des /3-Sitosterolkristallisates ist eindeutig nach dem erfindungsgemäßen Verfahren definiert und begrenzt das Flächenintegral zu höheren Temperaturen. Neben der Hauptkomponente beeinflussen alle Begleitstoffe die Lage des Schmelzpunktes. Nach klassischen Methoden der Schmelzpunktbestimmung ergaben sich lediglich Schmelzintervalle, die die Angabe einer definierten Schmelztemperatur nicht gestatten. Die Durchführung des Prüfungsverfahrens und Auswertung des Thermogrammes sind nach 1,5 Stunden abgeschlossen und gestatten einen sofortigen Eingriff in die Technologie der Herstellung des /3-Sitosterolkristallisates aus Teilprodukten. Gegenüber den bekannten Verfahren zur Beurteilung der Fermentierbarkeit von ß-Sitosterolkristallisaten weist die erfindungsgemäße Lösung nachstehende Vorteile auf:
Das erfindungsgemäße Verfahren ist einfach und gestattet es, über die Auswertung der Integralbestimmung und Schmelzpunktbestimmung aus einem einzigen Meßvorgang geringste Veränderungen in der Zusammensetzung von 0-Sitosterolkristallisaten auf der Basis von Teilprodukten zu erfassen, die in direkter Beziehung zur Fermentierbarkeit stehen. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt einen sofortigen Eingriff in die Herstellungstechnologie der /3-Sitosterolkristallisate. Es erspart die umfangreichen Verfahrensschritte einer Fermentation des yS-Sitosterolkristallisates und dessen kinetischer Auswertung oder deren Ermittlung von Zielprodukten der Fermentation.
Die Erfindung soll an nachstehendem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.
Jeweils 25mg /3-Sitosteroikristallisatproben wurden in einen zylindrischen Probenbehälter gefüllt (Proben A— E). Nach Verdichtung der Proben im Zylinder wird mittels eines Stempels ein Druck von 1,0kpcm~2 auf den zylindrischen Probenkörper
gegeben. .
Der mit den F;robenmaterialien gefüllte Behälter wird mit einer Aufheizgeschwindigkeit von 10°Cmin~1 aufgeheizt.
Die sich in Abhängigkeit von der Temperatur ergebende Längenänderung des zylindrischen Probenmaterials wird über geeignete Verstärkersysteme zur Anzeige gebracht.
In Tabelle 1 sind die Ergebnisse bezüglich der Ermittlung des Integrals und des Schmelzpunktes des/3-Sitosterols (Fp) aufgeführt und der Ermittlung des Umsatzgrades zum Zielprodukt des Fermentationsversuches gegenübergestellt.
Tabelle 1 Auswertung des Flächeninhalts und der Fermentierbarkeit
Probe Flächenintegral Fp Fermentierbarkeit*
A 1,85 137 100% ' "
B 1,83 , ,.· , 137 . 95%
C . 1,80 137 92%
D 3,15 134 60%
E 1,85 ' 137 '' 96% . . . * bezogen auf eine Standardqualität
Die Proben A bis E entstammen der laufenden /3-Sitosterolkristallisat-Produktion. Nachdem in der Probe D ein hoher Wert des Flächenintegrals und Absinken der Fp-Temperatur erkannt worden ist, wurden die Kristallisationsbedingungen für die Probe E nachgebessert. Im Ergebnis der Optimierung des Verfahrens lieferte die folgende ß-Sitosterolkristallcharge die mit der Probe E ausgewiesenen Parameter und eine wieder optimale Fermentierbarkeit.
Claims (1)
- Erfindungsanspruch.1. Prüfungsverfahren für den mikrobiologischen Seitenkettenabbau von Steroidvorprodukten mittels thermischer Längenänderungregistrierung der/3-Sitosterolkristallprobe unter definierten Bedingungen von Druck, Temperatur und Zeit, gekennzeichnet dadurch, daß die temperaturabhängige Längenänderung der unter einem Druck von 0,5 bis 10kpcm~2 stehenden Probe bei einer Aufheizgeschwindigkeit von 0,5 bis 1515CmIn"1 in der Nähe des Schmelzpunktes des/3-Sitosterols kontinuierlich gemessen und daß die biologische Wirksamkeit des /3-Sitosterols dem Flächeninhalt, begrenzt durch die Längenänderungsmeßpunkte und die Temperaturursache in den Grenzen vom Abweichen derLängenänderungsmeßpunktreihe von der Nuilinie bis zum definierten Schmelzpunkt des/3-Sitosterols, proportional zugeordnet wird.
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