DD220142A1 - Verfahren zur bestimmung von naturstoffen mittels selektiver mikrobiologischer elektroden - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Naturstoffen mittels mikrobiologischer Elektroden. Sie hat das Ziel, durch Einsatz mikrobiologischer Elektroden eine den Enzymelektroden vergleichbare Spezifitaet und Schnelligkeit bei der Bestimmung zu erhalten. Erfindungsgemaess werden die fuer die Bestimmung eines Naturstoffes in mikrobiologischen Elektroden benutzten Mikroorganismen in Naehrloesungen mit diesem bestimmten Stoff angezogen. Nach Dosierung des zu bestimmenden Substrates in die Messzelle wird die Aenderungsgeschwindigkeit der Atmung als Mass fuer dessen Konzentration genutzt. Dabei wird Stromstaerkeaenderung pro Zeit gemessen. Das Verfahren ist geeignet fuer den Einsatz in der Mikrobiologie, der Landwirtschaft, der Lebensmittelindustrie und -analytik, der Pharmazie und Toxikologie sowie im Umweltschutz.
Description
Riedel .
Renneberg
.Weise
Scheller ,
* f
"Verfahren zur Bestimmung von Naturstoffen mittels selektiver mikrobiologischer Elektroden" - .
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Naturstoffen (Kohlenhydraten, organischen Säuren, Alkoholen, Aminosäuren usw.) in komplexen Lösungen mit mikrobiologischen Sensoren, die spezifisch wirkende Mikroorganismen enthalten.
Das Verfahren ist geeignet fpr den Einsatz in der Mikrobiologie, der Landwirtschaft, der Lebensraittelindustrie und -ana- . lytik, der Pharmazie und Toxikologie sowie im Umweltschutz.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen ι Für die Bestimmung natürlicher Substrate, wie Kohlenhydrate, Alkohole, organische Säuren und Aminosäuren werden neben den
herkömmlichen spektrometrischen und chromatographischen Verfahren in zunehmendem Maße elektrochemische Sensoren in Form von Enzym- und Mikroorganismenelektroden eingesetzt (GUILBAULT, G. G., Enzyme raicrob. Technol., 2, 258 - 264 (1980), SUZUKI, S. and KARUBE, I., Proc. 6. Int. Ferm. Symp., London (Canada), Vol. III, ρ 355 - 360 (1980), FUKUI and TANAKA, Ann. Rev. Microbiol«, 36,145 - 172 (1982)). Der Einsatz von Enzymelektroden ist dabei im wesentlichen auf solche Reaktionen beschränkt, die zur Bildung bzw. Verbrauch von 0„ und HJDp führen in Verbindung mit dem polarographischen Nachweis. Weiterhin limitiert die Verfügbarkeit von Enzymen, die teilweise sehr aufwendige Präparation und gerin-
ge Stabilität deren Einsatzbreite. Die Kofaktor.negenerienjng bereitet ebenfalls große Schwierigkeiten·, Mikrobiologische Elektroden können überall dort, wo durch Substratnutzung O2 verbraucht wird, eingesetzt werden. Eine aufwendige Enzympräparation und eine Kofaktorregenerierung entfällt, Multienzymreaktionen können sehr einfach durch Mikroorganismen durchgeführt werden. Diese Vorteile der mikrobiologischen Elektroden werden "aber durch den Nachteil der unspezifischen Wirkung zum Teil wieder aufgehoben. Ein spezifischer Nachweis bestimmter , Stoffe in komplexen Lösungen, z. 8. Fermentationslösungen, ist deshalb mit mikrobiologischen Elektroden nur unter Einschränkungen möglich. ., ·
.Die Erfindung hat das Ziel, o. g. Nachteil der mikrobiologischen Elektrode zu beseitigen und eine den Enzymelektroden vergleichbare Spezifität und Schnelligkeit einer Messung zu erhalten. .
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, mittels mikrobiologischer Elektroden spezifische Naturstoffe in, natürlichen Systemen und komplexen Lösungen zu bestimmen. Erfindungsgemäß werden die in den Mikroorganismenelektroden eingesetzten Mikroorganismen kultiviert, indem jeweils die für die Analytik eines bestimmten Naturstoffes (Kohlenhydrate, organische Säuren, Alkohole, Aminosäuren usw.) benutzten Mikroorganismen in einem Nährraedium angezogen werden, das bevorzugt diesen Naturstoff als C-Quelle enthält. Durch diese Anzucht wird das für den entsprechenden Naturstoff benötigte Aufnahmesystem der Mikroorganismen induziert und andere Transportsysteme (deren Substrate nicht vorhanden sind) nicht oder nur schwach ausgebildet. Die Nutzung der jeweiligen spezifischen Transportsysteme der Mikroorganismen für die Substratanalytik er-
"* «J "
möglicht nicht nur eine hohe Spezifität, sondern auch "eine sehr schnelle,Messung, indem die Änderung der Atmungsgeschwindigkeit als Folge der Substrataufnahme erfaßt wird. Die auf o. g· Art und Weise angezüchteten Mikroorganismen werden immobilisiert bzw.-fixiert zur Herstellung mikrobiologischer Elektroden benutzt. Nach Dosierung des zu bestimmenden Stoffes in die Meßzelle wird die Änderungsgeschwindigkeit der Atmung als Maß für die Substratkonzentration genutzt·
. Diese Änderung wird als Stromstärke pro Zeiteinheit gemessen. Der Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß Naturstoffe, mit denen die verwendeten Mikroorganismen kultiviert wurden, .ohne großen zeitlichen Aufwand bestimmt werden können. Ein weiterer Vorteil besteht in der Möglichkeit der simultanen Substratbestimmung. Dabei werden mehrere selektive mikrobiologische Elektroden eingesetzt.
Ausführungsbeispiele '
Die Erfindung wird nachfolgend an Ausführungsbeispielen näher erläutert* '
1. Seispiel .
Glukosebestimmung mittels im Glukosemediura angezogenen
Bacillus subtilis-Zellen
In einem Glukose enthaltenden Medium (20 g Glukose, 5 g Casamino acids, 5 g Aramoniurachlorid, 20 ml Stammlösung Salze ad 1 1 0,134 M Phosphatpuffer pH 6,0; Stammlösung Salze: 0,4 % FeCl3. 6H2O, 0,13 % CaCl2, 0,2 % ZnSO4 . 7H2O,, 2,46 % MgSO4 · 7H2O, 3,7 % HCl) angezogene B. subtilis-Zellen werden nach 18 - 20stündiger Kultivierung auf Rotationsschüttlern bei 300C zu Beginn der stationären Phase geerntet und zur Herstellung einer mikrobiologischen Elektrode nach der in DD-WP G 01 N/238 412/8 beschriebenen Art und Weise benutzt. Hierzu werden 100 .ul Kulturlösung auf'ein Filterplättchen von 2-5 ram Durchmesser zentrifugiert, so daß eine Zellkon-
zen-tration von ca. 0,2 mg Trockengewicht pro Filter erreicht vvird. Das Filter wird auf eine Polyäthylenmembran einer Sauerstoffelektrode plaziert und durch eine Dialyseraembran zur Lösungsseite abgeschlossen. In eine gerührte bei 300C temperierte Meßzelle wird 2,5 ml 0,1 mol Phosphatpqffer pH 6,8 eingebracht. Die Sauerstoffkonzentration wird in Ampere mittels Meßverstärker bei einer angelegten Spannung von -600 mV gemessen bzw. die Änderung der Stromstärke nach Dosierung des Substrates in A/min, Diese Änderungsgeschwindigkeit wird als Maß für die Substratkonzentration genutzt. Nach Dosierung von 100 yUl Glukose enthaltende Lösung fällt die Sauerstoffkonzentration (gemessen als Strom) infolge der verstärkten Atmung rapid. Diese Änderung der Stromstärke pro Zeiteinheit (A/min) ist proportional der Glukosekonzentration (Tabelle 1). Oie Ansprechzeit der Elektrode beträgt 2 sek. Werden Maltoselösungen dosiert, tritt nur eine äußerst geringe Änderung der Stromstärke, d. h. des Sauerstoffverbrauchs auf (Tabelle I)* Nach einer Substratbestimmung wird die Meßzelle 2 mal mit Phosphatpuffer gespült.
Glukosebestimmung mittels glukoseselektiver Mikroorga-nismenelektrode (B· subtilis) im Glukoseraedium angezogen.
Zur Kontrolle wird die Änderungsgeschwindigkeit der Strom- stärke pro min. nach Maltosedosierung angegeben
Substrat Konz. /raM/ ' Änderung der Stromstärke pro Zeitein- : '' · ; ·. > , :heit.
min
| 0 | 0 | |
| Glukose | 0,15 | 0,14 |
| 0,6 | 0,64 | |
| 1,2 | 5 0,39 ' | |
| - | 0 | 0 |
| Maltose | 0,15 | 0,02 |
| 0,6 | 0,03 · | |
| 1,2 | 0,04 |
'bndkonzentration imMeßansatz, d. h. bei Dosierung von 100 yul Lösung enthält diese das 25fache.
2. Beispiel
Maltosebestimmung mittels in Maltose, angezogener B. subtilis·
Zellen _______
Die zur Präparation einer raaltoseselektiven Mikroorganismenelektrode benutzten B. subtilis-Zellen werden in dem im Beispiel 1 beschriebenen Medium, das an Stelle von Glukose 20 g Maltose enthält, angezogen. Anzucht, Herstellung der Elektro· de und Art der Messung entspricht der Beschreibung in Beispiel 1.
Tabelle 2 demonstriert die Abhängigkeit der Änderung der Stromstärke pro Minute von der Maltose und Glukosekonzentration. Ein Vergleich mit den in der Tabelle 1 glukoseangezogenen Zellen verdeutlicht die selektive Wirkung der Anzucht.
Maltosebestitnmung mitte,ls raaltoseselektiver Mikroorganismenelektrode (B. subtilis).
Zur Kontrolle wird die Änderungsgeschwindigkeit der Stromstärke pro min. nach Glukosedosierung angegeben
Substrat Konz. /ΐπΜ/ ' Änderung der Stromstärke pro Zeitein·
Γ ι ι Λ 1
hext
Maltose O O
0,15 0,25
0,6 ' "- O',81 1,2 ; 0,76
Glukose O ' O.
0,15 . 0,09
0,6 0,21
, 1,2
\
0,22
' siehe Anmerkung Tabelle 1
3» Beispiel . ,
Gleichzeitige Bestimmung von Maltose und Glukose in Lösungen
mittels selektiver Mikroorganismenelektroden
- */
Eine simultane Bestimmung von Glukose und Maltose in natürlichen Lösungen wird durch den gleichzeitigen einsatz von maltose- und glukoseselektiven Mikroorganismenelektroden in einer Meßzelle erreicht. Die selektiven Elektroden werden wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben, bereitet ,und in eine Doppelmeßzelle eingebracht. , _, Durch Glukoseeichlösungen werden die Elektroden eingeeicht und die verschiedenen Empfindlichkeiten der Elektroden ausgeglichen (mit Hilfe verschiedener Empfindlichkeitseinstellungen an den Meßverstärkern), d. h. die Empfindlichkeit der glukoseselektiven Elektrode wird auf die Empfindlichkeit der maltoseselektiven Elektrode eingestellt, da die Glukose-Elektrode, wie aus dem Vergleich Beispiel :1 und 2 ersichtlich, empfindlicher auf Glukose reagiert.
Oie glukoseselektive Elektrode zeigt die Glukosekonzentration direkt an. Die Differenz der Stromstärke der maltose- und glukoseselektiven Elektrode entspricht der Maltosemenge (Tabelle 3)v ' . . . '
Simultane Glukose- und Maltosebestimraung mit Hilfe von selek tiven Mikroorqanismenelektroden
Testlösungen /mMol/
Änderung der Stromstärke pro trmittelte Kon-Zeiteinheit / /u / zentrationen
/ht-ioX?
troms
£ Ϊ
Glukose, Maltose Glukose- Maltose- Differenz
selekti- selekti- Maltoseve Elek- ve Elek- elektr. trode trode Glukoseelektrode
Glukose Maltose
| 0,15 | _ | 0,06 | 0,06 | O | 0,15 | - |
| 0,60 | - | 0,20 | 0,20 | 0 | 0,60 | 0,15 |
| - | 0,15 | 0,01 | 0,25 | 0,24 | - | 0,6 . |
| - | 0,6 | 0,02 | 0,81 | 0,79 | - | 0,16 |
| 0,15 | .0,15 | 0,06 | 0,31 | 0,25 | 0,15 | .0,61 |
| 0,15 | 0,6 | 0,07 | 0,87 | 0,80 | 0,17 | 0,15 |
| 0,5 | 0,15 | 0,20 | 0,26 | 0,06 | 0,60 | 0,59 |
| 0,6 | 0,6 | 0,22 | 1,00 | 0,78 | 0,65 | |
| 4. Seispiel | die in | |||||
| Glutaminsäurebestimmung | mittels | B. subtilis-Zellen, | rden | |||
| einem glutaminsäureenthaltenden | Medium angezogen wu | |||||
Die zur Glutaminsäurebestimmung benutzte Elektrode wurde, im Seispiel 1 beschreiben, präpariert, wobei die B. subtilis Zellen ohne Kohlenhydrate angezogen werden. Hierdurch wird zwar eine 8fache Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber Glutaminsäure im Vergleich zu Zellen, die in einem Glukoseme diura angezogen wurden, erreicht, die Glukoseerapfindlichkeit wird aber nur um 50 % reduziert (Tabelle 5), so daß eine direkte Glutaminsäurebestimmung mit einer Elektrode in Gegenwart von Glukose nicht möglich ist. Durch Nutzung von 2
Elektroden, einer glukosespezifischen Elektrode (mit Zellen., die_im Glukosemediura angezogen werden), die nicht auf Glutaminsäure anspricht, und einer sog· glutaminsäureselekti ven Elektrode (Zellen kohlenhydratfrei angezogen), die eine Empfindlichkeit gegenüber Glutaminsäure aufweist, aber noch Glukose anzeigt, ist es möglich, durch Differenzbildung Glutaminsäure mittels mikrobiologischer Elektroden zu bestim men.
Glutaminsäurebestimmung mittels glutaminsäureempfindlicher Mikroorganismenelektrode , .
Zum Vergleich wird die Änderung der Stromstärke nach Dosierung von Glutaminsäure und Glukose einer Elektrode, die in Glukose angezogene Zellen enthält, angegeben.
Substrat Konz. Änderung der Stromstärke pro Zeitein-
L min '
ibM '· . Elektrode mit Zellen Elektrode mit
_ : aus Glutaminsäure- Zellen aus Glukomedium semedium
Glukose 0,15 .0,13 0,25
Glutaminsäure 1,2 0,16 ; 0,02
-'Anmerkung: Tabelle 1
5. Beispiel - ',·...
Glukosebestimraung mittels immobilisierter, auf Glukose ange-, zogener S. subtilis-Zellen \ v
Die Kultivierung erfolgt wie im Beispiel 1. Die speziell auf Glucose kultivierten Zellen werden durch Zentrifugation von der Nährboillon abgetrennt, wobei 100 ml verwendet werden. Der Rückstand wird mit 10 ml Phosphatpuffer versetzt und aufgerührt. \
5 /Ul der Kleberlösung (2,5 g handelsüblicher Kleber, Epasol-Kontakt, wird mit 30 ml Essigsäuraäthylester gemischt) werden auf eine Polyäthylenfolie gegeben. Direkt auf den trocknenden Kleber werden 10 ,ul der Zellsuspension aufgebracht. Die so präparierte Polyäthylenfolie wird 20 Minuten in einem Exikator unter Vakuum aufbewahrt. Danach werden auf die Zellen weitere 5 ,ul der Kleberlösung gegeben und mit einer Dialysemembran abgedeckt.
Am nächsten Tag wird die trägerfixierte Mikroorganismen-Folie zum Bespannen einer Sauerstoffelektrode benutzt. Die Herstellung der Elektrode und die Art der Messung entsprechen dem im Beispiel 1 Beschriebenen!. Tabelle 5 gibt die Stromwerte für' Glukose und Maltose wieder.
| Tabelle | 5 | 1. Messung | B. subtilis-Zellen | immobilisierter, |
| Glukose- | 2. Messung | Glukosezugab^: | ||
| • und Maltosebestimraung mittels | 3. Messung | ; 0,15 mM AuA/min/ | Maltosezügabe: | |
| glukoseselektiver | 4. Messung | 0,12 | 0,15 mM ^",uÄ/min/7 | |
| 1. Messung | 0,11 .. l | :' 0 | ||
| 2. Messung | 0,13 | o , · : .' | ||
| 1. Tag | 3. Messung | 0,12 | 0 | |
| . - | 1. Messung | 0,11 | 0 | |
| 2. Messung | ; 0,12 | 0 | ||
| 3. Messung | 0,10 | °- | ||
| 2. Tag | 1. Messung | 0,11 | . ο · | |
| 2. Messung | ' : '; 0,10 | · '.-·.· ο "! · ' | ||
| 3. Messung | . 0,10° | - ' 0 .. | ||
| 3. Tag | 6. Beispiel | . 0,09 | : 0 .· | |
| Maltosebesjcimmung | 0,10 | o | ||
| zogener | . , 0,09 | 0 | ||
| 6. Tag | 0 | |||
| mittels immobilisiert | " .' | |||
| B. subtilis-Zellen | er, auf Maltose ange- | |||
Die Kultivierung erfolgt wie im Beispiel 2. Die speziell auf '. · . ' ' · ' * / . .
Maltose kultivierten Zellen werden entsprechend dem Beispiel 5 auf einer Polyäthylenfolie mit der Kleberlösung trägerfixiert und in gleicher Weise werden, unter Verwendung einer Sauerstoffeleßtrode, jeweils Glukose- bzw. Maltoselösungen vermessen.
| Maltose- und Glukosebestiiiimung mittels | 1. Messung | . subtilis-Zellen | immobilisierter. |
| maltoses'elektiver B | 2. Messung | Glukosezugabe: | |
| \- | 3. Messung | 0,15 mM /",uA/min/ | Maltosezugabe: |
| 1. Messung | 0,02 | 0,15 mM /\uA/min/ | |
| 1. Tag | 2. Messung | 0,01 | 0,30 |
| 3. Messung | 0,03 | 0,28 | |
| 1 .Messung | 0,01 | 0,31 | |
| 2. Tag | 2. Messung | 0,01 | 0,29 |
| 3. Messung | 0,02 | 0,30 | |
| 1. Messung | 0,01 | 0,30 | |
| 3. Tag | 2. Messung | O1Ol | 0,29 |
| 3. Messung | 0,01 | 0,28 | |
| 0,01 | .0,30 | ||
| 6. Tag | 0,01 | 0,23 | |
| 0,02 | 0,23 | ||
| 0,29 | |||
Claims (3)
1) Verfahren zur Bestimmung von Naturstoffen (Kohlenhydraten, organischen Säuren, Alkoholen, Aminosäuren usw.) in kornplexen Gemischen oder Lösungen mit Mikroorganismenelektroden, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Analytik eines bestimmten Stoffes in mikrobiologischen Elektroden benutzten Mikroorganismen in Nährlösungen mit diesem Naturstoff angezogen werden und die Änderungsgeschwindigkeit der Atmung nach Dosierung des bestimmten Stoffes als MaS für dessen Konzentration als Stromstärkeänderung pro Zeit gemessen wird.
2) Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß nach o· g· spezifischer Anzucht erhaltene Mikroorganismen immobilisiert, bzw. fixiert in den mikrobiologischen Elektroden
; eingesetzt- werden. ' '
3) Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere selektive mikrobiologische Elektroden zur simultanen Substratbestiramung eingesetzt werden.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD25615183A DD220142A1 (de) | 1983-11-01 | 1983-11-01 | Verfahren zur bestimmung von naturstoffen mittels selektiver mikrobiologischer elektroden |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD25615183A DD220142A1 (de) | 1983-11-01 | 1983-11-01 | Verfahren zur bestimmung von naturstoffen mittels selektiver mikrobiologischer elektroden |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD220142A1 true DD220142A1 (de) | 1985-03-20 |
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ID=5551491
Family Applications (1)
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| DD25615183A DD220142A1 (de) | 1983-11-01 | 1983-11-01 | Verfahren zur bestimmung von naturstoffen mittels selektiver mikrobiologischer elektroden |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD220142A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5278048A (en) * | 1988-10-21 | 1994-01-11 | Molecular Devices Corporation | Methods for detecting the effect of cell affecting agents on living cells |
-
1983
- 1983-11-01 DD DD25615183A patent/DD220142A1/de not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5278048A (en) * | 1988-10-21 | 1994-01-11 | Molecular Devices Corporation | Methods for detecting the effect of cell affecting agents on living cells |
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