DD222601A1 - Verfahren zur herstellung einer cis-diammin-platin(ii)-komplexloesung - Google Patents

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DD26072384A
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Hans-Peter Schroeer
Marion Tonew
Emil Tonew
Bodo Heyn
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Akad Wissenschaften Ddr
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Abstract

Die Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur Herstellung einer cis-diammin-Platin(II)-Komplexloesung, wobei das Ziel darin besteht, eine cis-diammin-Platin(II)-Komplexloesung zu erhalten, die gute antivirale Eigenschaften mit deutlich verbesserter Zellvertraeglichkeit verbindet. Diese Aufgabe wird in der Weise geloest, dass cis-diammin-dichloro-Platin(II), vorwiegend in der festen kristallinen Form, in nahezu beliebigen Konzentrationen in frisch gereinigtem, destilliertem Dimethylsulfoxid bei Temperaturen im Bereich der fluessigen Phase in Loesung gebracht wird und anschliessend die so erhaltene, gleichgewichtsbedingte Loesung nach 2 Tagen bis 360 Tagen mit waessrigen physiologischen Medien im Verhaeltnis 1:50 bis 1:50 000 verduennt wird.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer cis-diammin-P!atin(ll)-Komplexlösung, einer Verbindung, deren potentielles Einsatzgebiet in der Bekämpfung von Viruserkrankungen liegt.
Als Anwendungsgebiet der Erfindung ist somit die pharmazeutische Forschung und Industrie anzusehen.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Cis-diammin-Dichloro-Platin(ll) — cis-DDP — als Prototyp der bekannten cis-diammin-Platin(ll)-Komplexlösungen ist ein klinisch eingeführtes Cancerostatikum, vorzugsweise zur Behandlung von Urogenital- und Tumoren im KopfVHalsbereich. Die cis-DDP-Synthese selbst ist frei von Schutzrechten; es sind jedoch Patente zu besonderen Applikationsformen dieses Wirkstoffes bekannt (so z. B. DD 142293, DD 157762).
Die immunsuppressive Wirkung von cis-DDP bei der Behandlung bösartiger Geschwülste schränkt die Fähigkeit des Körpers zur Abwehr von Sekundärinfektionen ein und kann den Verlauf einer Krebstherapie ungünstig beeinflussen. Bekannt ist seit M.J.CIeare „Platinum Coordination Complexes in Cancer Chemotherapy", Springer New York (1974) weiterhin die antileukämische Unwirksamkeit und eine hohe Toxizität von Umsetzungsprodukten des mit zyklischen Aminen substituierten cis-DDP (genauer: des cis-diammin-PlatinflO-Neutralkomplexes), vorzugsweise von cis-diammin-dichloro-Platinfll), mit Dimethylsulfoxid (kurz: DMSO).
Bekannt ist seit dem systematischen Untersuchungen von E.Tonewu.a., ZbI. Bakt. Hyg. I.Abt. Orig. A 250 (1981)417 ff., die gute antivirale in vitro-Wirkung des cis-diammin-Platin(ll)-Neutralkomplexes. Zum antiviralen Verhalten und zur Zellverträglichkeit der bisher bekannten cis-diammin-Platin(ll)-Komplexlösungen waren bis dato nur vereinzelte, wenig systematische Untersuchungen bekanntgeworden (L.Kutinova u.a., Neoplasma [Brat] 19 [1972] 453 ff.; L.Kutinova u.a.. Arch, ges. Virusforsch. 39 [1972] 196 ff.; H.C.Harder, Recent Results in Cancer Research [1974] 98 ff.; J.J. Roberts u.a., Biochimie [1978] 869 ff.; W.Achterrath u.a., Firmenschrift der Bristol-Meyers GmbH [1979]; P.Carde u.a.. Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys.7[1981]929ff.; LC.Erickson u.a., Cancer Res. 41 [1981]2791 ff.; G.Laurent u.a., Cancer Res. 41 [1981] 3347 ff. und H.H.Kohl u.a., Chem. Biol. Interaction 24 [1979] 209 ff.). Von diesen Autoren wird die hohe, gegenüber verschiedenartigen Zellen unterschiedliche Toxizität von cis-DDP-Lösungen im wäßrigen System herausgestellt.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist es, eine cis-diammin-PlatindO-Komplexlösung zu erhalten, die gute antivirale Eigenschaften mit deutlich verbesserter Zellverträglichkeit verbindet.
Darlegung des Wesens der Erfindung . · .
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung einer cis-diammin-Platin(ll)-Komplexlösung zu entwickeln, das zu einer Wirkstofflösung führt, die gute antivirale Eigenschaften mit deutlich verbesserter Zellverträglichkeit kombiniert und so die Nachteile der bisher bekannten cis-diammin-P!atin(ll)-Komplexlösungen vermeidet. Auf an sich bekannte Weise wurde zunächst gefunden, daß nach Lösen von festem cis-diammin-dichloro-Platin(ll) (kurz: cis-DDP) in gereinigtem Dimethylsulfoxid (DMSO) der Wirkstoff cis-DDP eine chemische Reaktion mit dem Solvens eingeht. Die diesem Phänomen zugrunde liegende chemische Reaktion läßt sich durch das Schema
Z=±
beschreiben. "
Lösungen von cis-DDP in DMSO verändern in Abhängigkeit vom Alter der Lösungen ihre elektrische Leitfähigkeit. Das Gleichgewicht ist nach 12 Stunden weitgehend eingestellt. Eine geringfügige Verschiebung auch nach dieser Zeit zeigt aber weitere zeitabhängige chemische Veränderungen an.
Auch hochdruckflüssigkeitschromatografische — HPLC — Untersuchungen belegen, daß cis-DDP beim Auflösen in DMSO rasch eine chemische Reaktion mit dem Solvens eingeht. Nach 16 Stunden bis 20 Stunden ist die mit dieser Methode nachweisbare Veränderung noch nicht vollständig beendet.
Es wurde weiter gefunden, daß nach Ausführung folgender Verfahrensschritte
— Lösung von cis-DDP aus der festen, kristallinen Form in nahezu beliebigen Konzentrationen in frisch gereinigtem, destilliertem DMSO bei Temperaturen im Bereich der flüssigen Phase,, vorzugsweise bei einer Temperatur von 25°C, und
— anschließendem Verdünnen der so erhaltenen gleichgewichtsbedingten Lösung nach 2 Tagen bis 360 Tagen, vorzugsweise nach 2 Tagen bis 120 Tagen, mit wäßrigen, physiologischen Medien im Verhältnis 1:50 bis 1:50000, vorzugsweise im Verhältnis 1:200, '
eine cis-diammin-PlatinOO-Komplexlösung erhalten wird, die unter Beibehaltung der antiviralen Wirkung überraschend eine im Vergleich zum System cis-DDP/H20 erhöhte Zellverträglichkeit aufweist (siehe auch Tabelle 1). Durch Leitfähigkeitsmessung oder HPLC wird hierbei geprüft, daß die verfahrensgemäß bereitete cis-diammin-Platin(ll)-Kompiexlösung vorliegt.
-2- 260 723 1
Dievirostatische Aktivität der verfahrensgemäß bereiteten cis-diammin-PlatindO-Komplexlösung ist, wie vergleichende Untersuchungen zeigen, ebenso hoch wie die von cis-DDP bei gleicher Konzentration in anderen Medien, vorzugsweise in Wasser oder in Dimethylformamid. Auf Grund der besseren Zellverträglichkeit von cis-diammin-PlatinÖO-Komplexlösungen sind im Vergleich zu den Systemen in Wasser oder Dimethylformamid hier jedoch höhere Wirkstoffkonzentrationen einsetzbar, wie Tabelle 1 ausweist.
Vergleichende Untersuchungen haben weiterhin gezeigt, daß von DMSO in einer Konzentration von 0,5% in proteinfreier Hankslösung keine antivirale Wirkung ausgeht.
Die verfährensgemäßbereitete cis-diammin-Platin(ll)-Komplexlösung hat den Vorteil, daß
— sie bei deutlich verbesserter Zellverträglichkeit sich in bezug auf ihre antiviralen Eigenschaften auf dem gleichen Niveau befindet, wie die bekannten cis-DDP-Wirkstofflösungen (Wasser, Dimethylformamid) und
— dieser positive Effekt über einen langen Zeitraum (Prüfung erfolgte bis zu 360 tagen) ohne Verlust ununterbrochen erhalten bleibt . ; " , v ' · · .
Ausführungsbeispiel
1.1. Bereitung der cis-diammin-PlatinflO-Komplexlösung
Festes, kristallines cis-DDP wird in gereinigtem DMSO — sowie für Vergleichszwecke in Dimethylformamid — bei 250C gelöst; c = 50mmol/l. Diese Stammlösungen werden nach dem Ansetzen unter Lichtausschluß bei 4°C aufbewahrt. Aus diesen Stammlösungen wird nach 2 Tagen bis 360 Tagen, bevorzugt nach 2 Tagen bis 120 Tagen, eine Verdünnung in physiologischen Medien 1:200 oder mehr vorgenommen, so daß z.B. die DMSO-Konzentration 0,5% oder weniger beträgt. In der für Vergleichszwecke wäßrigen Stammlösung (c = 50 mmol/l) ist die Substanz suspendiert, da die Löslichkeit des Wirkstoffes in Wasser 1 mg/ml = 3,3 mmol/l beträgt.
1.2. Darlegung der Eigenschaften der verfahrensgemäß hergestellten Komplexlösung -
— Prüfung auf antivirale Wirkung
Zellkülturen, Züchtung, verwendete Medien, Virusstämme und Titerbestimmungen wie auch die Versuchsdurchführungen entsprechen den Angaben in M.Tonewu.a., ZbI. Bakt. Hyg. I.Abt. Orig. A 249 (1981) 269 ff. sowie in M.Tonewu.a., ZbI. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A 249 (1981)421 ff. ' , ,
— Prüfung auf zytotoxische Wirkung
Die angegebenen cis-diammin-PlatinllO-Komplexlösungen wurden aus den entsprechenden Stammlösungen in Erhaltungsmedien mit einem beliebigen Serum, vorzugsweise mit 2% Kälberserum, verdünnt und unmittelbar danach auf 2 Tage alte Monolayerkulturen aufgetragen:
Die Zellen wurden mikroskopisch auf morphologische Veränderungen kontrolliert. Es wurden die Konzentrationen als maximal tolerierte Dosen (MTD) angegeben, die am 2. bzw. 5. Beobachtungstag gegenüber den unbehandeiten Zellkontrollen keine zytotoxische Veränderung hervorriefen.
— Untersuchungen zur antiviralen Aktivität von cis-DDP; Wirkung auf extrazelluläres Virus in proteinfreien Medien
In Tabelle 2 sind die Ergebnisse der Inaktivierung verschiedener Viren in Abhängigkeit vom Alter der Stammlösung in verschiedenen Lösungsmitteln dargestellt.
Eine frisch bereitete Lösung von cis-DDP (c = 250μ.ΓηοΓ/Ι) in proteinfreier Hankslösung erwies sich unabhängig vom Lösungsmittel für L-wie auch für FL-Zellen immer als stark zytotoxisch, obwohl die Einwirkungszeit auf Zellkulturen bei dieser Versuchsanordnung nur ca. 1 Stunde (Virusadsorption nach derVirusinaktivierung) bei Zimmertemperatur betrug, da dann eine weitere Verdünnung im. Verhältnis .1:5 durch Zugabe von Erhaltungsmedien erfolgte.
Eine gealterte, verfahrensgemäß hergestellte Komplexlösung war jedoch noch in einer Konzentration von 250μΐηοΙ/Ι verträglich und inaktivierte VSV, Vaccinia wie auch Adenovirus Typ 5 in dieser wie auch in wesentlich geringeren Dosen.
— Untersuchungen zur Stabilität der biologischen Wirkung einer verfahrensgemäß bereiteten cis-diammin-Platin(ll)-Komplexlösung
Eine verfahrensgemäß bereitete cis-diammin-Platin(ll)-Komplexlösung wurde in den aus Tabelle 3 ersichtlichen Zeitabstanden unter weiterer Verdünnung auf antivirale Wirkung'untersucht. In einem Zeitraum von 9 Monaten hat sich die Effektivität bezüglich der inaktivierung von Vaccinia-, Vesikularstomatitis- wie auch Andenovirus Typ 5 nahezu unverändert erhalten.
Tabelle 1 '
Verträglichkeit von Cis-diammin-PlatindO-Komplexlösung für Hühnerembryonal- und L-Zellen in Abhängigkeit vom Lösungsmittel und vom Alter der Stammlösung nach weiterer Verdünnung in Erhaltungsmedium mit 2% Kälberserum
Lösungsmittel Aufbewahrungsdauer der . Maximai verträgliche Dosis 7,8
Stammlösung b.4°C am 5. Beo 62,5
125,0
bachtungstag nach Wirkstoffzugabe in 250,0
Tage in/umol/l
verfahrensgemäß o .' 7,8
bereitete 1 "." ,' Hühnerembryonalzellen L-Zellen 7,8
cis-diammin- 3 31,25 15,6
Platin(ll)- ' - 62,5 15,6
Komplexlösung 125,0 ' 7,8
System o' 250,0 7,8
cis-DDP/Wasser 1 .·.'
3 15,6
5 ' . 15,6
System 0 ; 31,25
cis-DDP/ . 8 : 31,25
Dimethylformamid 31,25
31,25
-3- 260 723 1
Tabelle 2
Antivirale Wirkung von cis-diammin-PlatinOO-Komplexlösung in Abhängigkeit vom Lösungsmittel und vom Alter der Stammlösung (c = 50mmol/l)
Virus
Lösungsmittel Aufbewahrungsdauer d. Stammlösung bei 4°C
Tage
Titerreduktion nach einstündiger Behandlung des extrazellulären.Virus in Prozentzur Kontrolle1' Substanzkonzentratibn in/xmol/l 250
Vaccinia
VSV
Adeno Typ 5
DMSO21 Aqua dest.
DIFO DMSO21
Aqua dest. DIFO
DMSO21
Aqua dest. DIFO
100/toxisch 68
95 36
100 91
100 98
98 78
80 65
99 47
99 97
toxisch . 100
toxisch 98
toxisch 99,89
99,99 99,98
99,98 99,0
toxisch 93,20
99,53
toxisch 93,20
toxisch
toxisch 99,53
99,82
toxisch . 93,20
99,78 99,32
toxisch 99,84
toxisch 90,26
1) Berechnung: Bei Vacciniavirus aus der Differenz der plaquebildenden Einheiten, bei den anderen Viren aus der Differenz der TCID50.
2) DMSO, wie verfahrensgemäß beschrieben
Tabelle 3
Antivirale Wirkung einer verfahrensgemäß bereiteten cis-diammin-Platin(l!)-Kompfexlösung (c = 50mmol/l) in Abhängigkeit vom Älter -
Virus
Konzentration
μ.ΓΤΐρΙ/1 Einstündige Einwirkung auf zeilfreies Virus in proteinfreier Lösung; Titerdifferenz zur unbehandelten Kontrolle in Prozent Wochen 3 Monate 6 Monate 9 Monate
Vaccinia 250
25
VSV 250
25
Adeno 250
Typ 5 25
100 Ί00 100 100
87 74 77 69
99,99 99,99 99,99 99,99
99,98 99,72 98,26 99,68
99,9 99,97 99,9 99,82
0 nicht 0 98,2
signifikant

Claims (2)

  1. -1- 260 723
    Erfindungsansprüche:
    1. Verfahren zur Herstellung einer cis-diammin-PlatinOll-Komplexlösung aus festem, kristallinem cis-diammin-dichloro-Platin(ll) (kurz: cis-DDP), gekennzeichnet dadurch, daß man cis-DDP in nahezu beliebigen Konzentrationen in frisch gereinigtem, destilliertem Dimethylsulfoxid bei Temperaturen im Bereich der flüssigen Phase löst, die so erhaltene gleichgewichtsbedingte Lösung nach 2 Tagen bis 360 Tagen mit wäßrigen physiologischen Medien im Verhältnis 1:50 his 1:50000 verdünnt und diese Lösung unmittelbar zum Einsatz bringt.
  2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man cis-DDP in einer Konzentration von c = 50mmol/l in Dimethylsulfoxid bei einer Temperatur von 250C löst, die so erhaltene gleichgewichtsbedingte Komplexlösung nach 2 Tagen bis 120 Tagen mit wäßrigen physiologischen Medien im Verhältnis 1:200 verdünnt und die Lösung unmittelbar zum Einsatz bringt.
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