DD222896A1 - Verfahren zur elektrochemischen bestimmung von lactat, pyruvat und der aktivitaet von alaninaminotransferase - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung bezieht sich auf ein elektrochemisches Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Lactat und Pyruvat sowie der Aktivitaet von Alaninaminotransferase. Ziel der Erfindung ist es, die Nachweisempfindlichkeit des Verfahrens wesentlich zu erhoehen. Aufgabe ist es, mit einem bioelektrochemischen Verfahren auf der Grundlage einer akzeptoranzeigenden Elektrode mit immobilisierten Enzymen das Ziel zu erreichen. Die erfindungsgemaesse Loesung besteht darin, dass die Elektrode eine Enzymschicht aufweist, die Cytochrom b2 und Lactatdehydrogenase enthaelt, dass ggf. vor dieser Enzymschicht eine Schicht mit Pyruvatoxidase oder Lactatmonooxygenase angeordnet ist und dass der Messloesung NADH zugesetzt wird. Die Erfindung wird in der klinischen Labordiagnostik, in der Lebensmittel- und mikrobiologischen Industrie angewendet.
Description
F« Schubert Dr, F. Scheller Dr. D. Kirstein Dr. K.-L. Schröder A. Chojnacki
"Verfahren zur elektrochemischen Bestimmung von Lactat, Pyruvat und der Aktivität von Alaninaminotransferase"
Die Erfindung betrifft ein elektrochemisches Verfahren zur Bestimmung der Konzentrationen von Lactat und Pyruvat sowie der Aktivität von Alaninaminotransferase (ALT). Das Verfahren ist zur Lactat- und Pyruvatmessung in der Lebensmittel- und mikrobiologischen Industrie sowie zur Messung dieser Substanzen und der Aktivität von ALT in physiologischen Flüssigkeiten» also in der klinischen Labordiagnostik, geeignet·
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Zur Bestimmung von Lactat und Pyruvat sowie der Aktivität von ALT wurden in der Literatur eine Reihe von Biosensoren beschrieben, die auf der Kopplung von immobilisierten Biokatalysatoren mit Indikatorelektroden beruhen. Zur Lactatbestimroung wurden in solchen Sensoren Lactatdehydrogenase (LDH) (C. C. Liu und A. K. Chen, Process Biochem» Sept./Oct. 1982, 12; W. 3. Blaedel und R. A. Oenkins, Anal« Chem. 48 (1976) 1240), Cytochrom b2 (DE-OS 22 43 962), Lactatmonooxygenase (0. G. Schindler und M. v. Gülich, Fresenius Z. Anal. Chem· 308 (1981) 434) oder Lactatoxidase (I. Karube et al., Anal· Chim. Acta 119 (1980) 271) angewendet. Dabei wurde das entsprechende Enzym jeweils mit einer amperometrie sehen oder potentiometTischen Indikatorelektrode kombinierte Im Durchschnitt liegt die untere Bestimmungsgrenze bei diesen Enzymelektroden bei 5 · 1O~ mol/1. Die maximal erreichte
4 O CCD -(O Q I. ^. 4 Ii OO 1Q Λ
~v2. -
Empfindlichkeit ist durch eine untere Bestimmungegrenze νοη 10 mol/1 gekennzeichnet»
in Biosensoren zur Pyruvatbeetimmung wurden Pyruvätoxidase (F. Mizutani st al«; Anal. Chinu Acta (18 (1980) 65), Bal<terien (C* L. Di Paolantonio und G· A. Rechnitz« Anal· Chim« Acta 148 (1982) l)# LDH und Glutamatdehydrogenaee (P. Davis© und K. Mosbach, Biochim. Biophys. Acta 370 (1974) 329) oder Maiskorngewebe (S. Kuriyama et al,t 3. Membr« Sei« 12 (1983) 269) eingesetzt· Bei diesen Sensoren liegt die untere Bestimmungsgrenze bei einer Pyruvatkonzentration von 10~ mol/1· Die genannte Pyruvätoxidaseelektrode wurde auch zur Bestim« mung der ALT-Aktivität eingesetzt· Dabei wird die Empfind« lichkeit der Aktivitätsbestimmung direkt von der Empfindlichkeit des Sensors für Pyruvat bestimmt· ; : Die oben genannten Uactatelektroden sind aufgrund des Charakters der ablaufenden Enzyrareaktionen nicht zur Pyruvatmessung geeignet· Andererseits sind« aus demselben Grund; die genannten Pyruvatsensoren nur zur pyruvat«·* nicht aber zur Lactatbestimmung anwendbar. ; -..-.' '. ? 'Γ·;·-;: '· ' :.'.: ;'. '-:''. , ';.;-·· -.'.> ._ --^. ;^ \ :\
Ziel der Erfindung . -[ ''' ' . ;.: , ' . ";,'' '-/ '-\_\ '."y/ -';," ' ".-,,- ' :/'' '' ' Ziel der Erfindung ist es, eine wesentliche Erhöhung der Empfindlichkeit der Lactat-, Pyruvat-· und ALT-Messung und« als Konsequenz, eine wesentliche Verringerung der notwendigen Probenvolumina zu erreichen. Weiterhin soll mit ein und demselben Verfahren sowohl die Messung von Lactat als auch von Pyruvat und ALT ermöglicht werden.
Aufgabe der Erfindung ist es» mit einem bioelektrocheraischen verfahren auf der Grundlage einer akzeptoranzeigenden Elektrode mit immobilisierten Enzymen zur Bestimmung von Lactat, Pyruvat und der ALT-Aktivität die Nachteile des Standes d©r Technik, wie die geringe Nachweisempfindlichkeit, zu Verbes«
';. ''.' '·· " .' , - 3 - ':. ' . : " '' υ ' " ; ".-'! vj:.":'^y.
sern« Die erfindungsgemäße Lösung der Aufgabe besteht in einem Verfahren auf der Grundlage einer Enzymelektrode« die auf der Oberfläche des elektronenleitenden Teiles Cyt©chrom bp und LDH fixiert aufweist·, Auf der elektrodenabgewandtBn Seite dieser Enzyraschicht ist gegebenenfalls eine weitere Enzymschicht« die entweder Pyruvatoxidase oder Laetatraonooxy^ genase enthält« angeordnet· V
Die Erfindung soll im weiteren noch näher erläutert werden, Die Kopplung der Reaktionen von Cytochrom b« und LDH ergibt ein Signal, dai von der Konzentration von Lactat oder pyruvat in einer Weise abhängt, die es ermöglicht« sehr kleine Mengen dieser Substanzen zu bestimmen· Zum Nachweis dieses Signals wird eine Cytochrom b2 und LDH enthaltende Schicht auf der Oberfläche einer akzeptoranzeigenden Elektrode angeordnet· Die Enzymelektrode taucht in eine gepufferte Meßlösung, die einen e"*-Akzeptor (A) der Cytochrom b.-Reaktion (z. B· Ferri-· cyanid, Thionin) und NADH enthält· Die Elektrode ist eo polarisiert, daß sie den reduzierten Akzeptor (AH«) anzeigt« Bei Zugabe von Lactat zur Meßlösung wird dieses durch Cytochrom bg zu Pyruvat dehydriert: :
wieder zu Lactat reduziert« welches wiederum durch Cytochrom bp dehydriert wird. Durch diese kontinuierlich ablaufende Rezyklisierung des Lactats entsteht AH2 in einer Konzentration» die um ein vielfaches größer istf als die des ursprünglich vorliegenden Lactats· Dementsprechend erhält man für eine geringe Lactatmenge bereits ein relativ hohes Elektrodensignal·
Wird anstelle von Lactat Pyruvat zugegeben, so lauft kontinuierlich derselbe Reaktionszyklus ab, beginnt j edoch mit der LDH-Reaktion« ·' '; . ';; . " .- .; .: ... ;';.· ' :' · ·, ; ;. ; ' .·.. Zur Bestimmung von ALT enthält die Meßlösung neben A und NAOH noch Alanin und öU-Ketoglutarat. Wird ALT zu dieser Lösung gegeben, so erfolgt eine Transaminierung, bei der Pyruvat entsteht'::' ' ' ; :/·' · .,, ' ;' ;/Λ'- '- / λ, V '; .. r/'y^ : r' ι"-.'-..1--'
Die Bildungsgeschwindigkeit des Pyruvats wird durch das erfindungsgemäße Verfahren bestimmt· Das Elektrodehsignal ist von der Aktivität der ALT abhängig·
Enthält die Probe« deren Lactatgehalt zu bestimmen ist» Pyruvat, so wird vor der Enzymschiebt mit Cytochrom b^ und LDH eine Schicht« die Pyruvatoxidase enthält, angeordnet> Das in diese Schicht gelangende Pyruvat wird entsprechend:
oxidiert und kann somit nicht in die Cytochrora b2«LDH-Schicht eindringen· Damit wird eine Verfälschung der .Lactatmessung durch Eintreten des Pyruvats in den Reaktionszyklus verhindert· In gleicher Weise wird eine Verfälschung der Pyruvat- und ALT-Bestimmung durch in der Probe vorhandenes Lactat (insbesondere bei Blutproben) verhindert, indem vor der Cytochrora b2-LDH-Schicht eine Schicht mit Lactatroonooxygenase aufgebracht wird.
Die Vorzüge der Erfindung im Vergleich mit existierenden Verfahren sind ihre außerordentlich hohe Empfindlichkeit (untere Bestimmungsgrenze für Lactat und Pyruvat 5 · 10™7 mal/l) Ürtdi die Möglichkeit,mit nur einem Verfahren sowohl Lactat al© auch Pyruvat und ALT bestimmen zu können«
· . ' · · ' '-. -.' — 5 - ·'. '· " : y ::.y' ''.A- -A""-:-ν'--χ'--'
Die Erfindung soll nachstehend an ü Aüsführungsbeispielenerläutert werden: -.. . ' . ,' . ..." -' -.. ': .. · .', \:'[. ' ': "'.·..·'. uV.'..; '.;..CV
1, Beispiel :' : . ' ; ', , . ... ' - ' ' ·.. ^.,s.
15 Einheiten Cytochrom b9 und 10 Einheiten LDH werden auf ein ' . ο · . . . ··. ..'ΓΙΟ mm großes Stuck Zellstoff gegeben. Dieser wird dann zwischen 2 Dialysemembranen mittels eines O-Ringes auf einer Platinelektrode fixiert« die, an einen Polarographen mit . Schreiber angeschlossen, auf +0,25 V gegen Ag/AgCl (Elektrolyt 0,1 MKCl) polarisiert wird· Die Enzymelektrode taucht in 2 ml einer gerührten, auf 250C thermostatlerten Meßlösung von 0,1m ο 1/1 Phoephatpuf fer, pH 6,0, mit 0,1 ram ο 1/1 EDTA4, O/larao 1/1 MgSO4, 1 mmol/1 Kaliumferricyanid und 1 mmol/1 NAUH* Nachdem sich ein konstanter Grundstrom eingestellt hat, erfolgt die Zugabe von 2 ,ul Lactatlösung definierter Konzentration« Dadurch tritt eine Vergrößerung des Stromsignals ein« Der Meßwert ergibt sich als Differenz zwischen dem Grundetrom und dem Maximalwert des Stromsignals. Die Meßlösung wird entfernt, die Elektroden 2 mal mit Meßlösung gewaschen und wiederum Meßlösung vorgelegt· Auf diese Weise werden Lactatlösungen der Konzentrationen 1, 5, 10, 15, 20 mmol/1 gemessen und die Meßwerte als Eichkurve aufgetragen« Nun werden 2 .ul Blut zugegeben, dessen Lactatgehalt zu bestimmen ist· Mit dem Meßwert wird aus der Eichkurve dieser Gehalt abgelesen.
2. Beispiel .' .·, -. ' . : : ; ·· ,'. · ''-:\ [-Ά :-A. ~:",".: A.: .'// ' Eine Enzymelektrode wird präpariert und taucht in eine Meßlösung wie in Beispiel 1.
Die Elektrode wird an einen Polarographen mit Schreiber angeschlossen , bei dem die Schaltstellung "derivativ" eingestellt wird♦ 10 -ul einer Fermentationsprobe, deren Pyruvatgehalt zu bestimmen ist, werden zugegeben« Der Meßwert ergibt sich als Höhe des angezeigten Peaks· Aus einer unter gleichen Bedingungen aufgenommenen Eichkurve mit verschiedenen Pyruvat-
Standardlösungen kann die gesuchte Pyruvatkonzentration abgelesen Werden·"., . - ·.. .,-.. ; - , '..'. ".'- ' ".-"-X' :' : " :'. A . '/
3.?[ Beispiel „V ' ' .. : ' '", ; X-.- ." ' ;./ ;': : "..! ;,' : ..:' '"; 150 Einheiten Cytochrom b« und 100 Einheiten LDH werden in O4I ml einer 5 %igen Gelatinelösung gelöst und auf einer
1 tiro großen Polyethylenunterlage ausgestrichen· 100 Einheiten pyruvatpxidase werden ebenso in 0,1 ml einer 5 %igen Gelatinelösung gelöst und auf 1 cm Polyethylenunterlage gegeben· Beide Präparate werden 12 h bei 40C getrocknet und von der Unterlage entfernt· Von den erhaltenen Membranen werden Stücke von 4 χ 4 mm abgeschnitten und übereinanderliegend und durch eine Dialysemembran voneinander getrennt zwischen 2 Dialysemembranen vor einer Platinelektrode in der Weise fixiert» daß sich die Pyruvatoxidasemembran auf der elektrodenabgewandten Seite befindet· Die Elektrode wird auf+0,25 V gegen Ag/HgCl polarisiert und an einen Polarographen mit Schreiber angeschlossen· Die Meßlösung ist wie in Beispiel Wie in Beispiel 1 wird eine Eichkurve aufgenommen· Nun werden
2 yUl einer pyruvatenthaltenden Fermentationsprobe« deren Lactatgehalt zu bestimmen ist, zugegeben· Der gesuchte Lactatgehalt ergibt sich aus dem Maximalwert des Stromsignals und der Eichkurve·
4. Beispiel
EineCytochrom b2-LDH-Membran wird wie in Beispiel 3 hergestellt. 30 Einheiten Lactatmohooxygenase werden in 0,05 ml einer 10 %igen Gelatinelösung gelöst, auf einer 1 cm großen Unterlage ausgestrichen und bei 40C 12 h getrocknet. Mit 4 χ 4 mm von beiden Membranen wird wie in Beispiel 3 eine Enzymelektrode präpariert« Die Elektrode wird an ein Glukoraeter GKM 02 angeschlossen und auf +0,25 V polarisiert, 1 ml einer Meßlösung wie in Beispiel 1 wird in die Meßzelle gegeben·
• " ' · '' · «. 7 "» ' " ' ' ' '
Eine Eichkurve für die ALT~Aktivität wird folgendermaßen aufgenommen; je 100 yUl von Standardlösungen mit definierter ALT-Aktivität (1 U, 5 U1 10 U1 15 U, 20 U) werden mit 100 'ja!.. 0,1 mol/1 Phosphatpuffer, pH 7,4, enthaltend 0,8 mol/1 Alanin und 18 mrnol/l ^-Ketoglutarat,versetzt. Nach 2 min werden 100 yUl davon in die Meßzelle gegeben. Ale Meßwert dient die sich einstellende digitale Glukometeranzeige· Nach Spülung und Vorlage einer neuen Meßlösung erfolgt die Zugabe der nächsten vorinkubierten Standardlösung· Aus den Aktivitäten und den Meßwerten wird die Eichkurve gebildet« Nun werden 100 λιΧ einer Blutprobe, deren ALT-Aktivität zu bestimmen ist, ebenso behandelt wie die ALT-Standardlösungen. Aus der Glukometeranzeige und der Eichkurve ergibt sich die gesuchte Aktivität«
Claims (1)
- Erfindungsanspruch, Verfahren zur elektrochemischen Bestimmung von Lactat* Pyruvat und der Aktivität von Alaninaminotransferase in Lösung mittels einer akzeptoranzeigenden Elektrode» gekenn« zeichnet dadurch, daß die Elektrode mit einer Enzymschicht * in der Cytochrom b~ und Lactatdehydrogenase aufgebracht sind, versehen ist« da& der Meßlösung NADH zugesetzt wird und daß gegebenenfalls vor der Enzymschicht eine Schicht angeordnet ist, dieι Pyruvatoxidase oder Lactatmonooxygenas® enthält»
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| DD26001884A DD222896A1 (de) | 1984-02-13 | 1984-02-13 | Verfahren zur elektrochemischen bestimmung von lactat, pyruvat und der aktivitaet von alaninaminotransferase |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4126692A1 (de) * | 1991-08-13 | 1993-02-18 | Inst Molekularbiologie Ak | Immunosensor-vorrichtung und verfahren zur bestimmung von antigenen 2000 dalton |
-
1984
- 1984-02-13 DD DD26001884A patent/DD222896A1/de not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| DE4126692A1 (de) * | 1991-08-13 | 1993-02-18 | Inst Molekularbiologie Ak | Immunosensor-vorrichtung und verfahren zur bestimmung von antigenen 2000 dalton |
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