DD224769A1 - METHOD FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO MYELOUS LEUKAEMIE CELLS OF HUMANS - Google Patents
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Abstract
Ziel der Erfindung ist die Herstellung von Antikoerpern hoher Spezifitaet in guten Ausbeuten. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Milzzellen von Balb/c-Maeusen, die mit humanen myeloischen Leukaemiezellen immunisiert wurden, mit X63-Ag8.653 Myelomzellen in der Zellkultur fusioniert, die antikoerperproduzierenden Hybridome selektiert, ihre Bindungsspezifitaet an verschiedene Zelltypen bestimmt und die spezifischen Hybridome fuer die Antikoerperproduktion auswaehlt. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik und Therapie.The aim of the invention is the production of antibodies of high specificity in good yields. The method according to the invention is characterized in that spleen cells of Balb / c mice immunized with human myeloid leukemia cells are fused with X63-Ag8.653 myeloma cells in cell culture, the antibody-producing hybridomas are selected, their binding specificity to different cell types is determined, and selects specific hybridomas for antibody production. Field of application of the invention is medical diagnostics and therapy.
Description
BÖTTGER, VolkerBÖTTGER, Volker
HERIUG, SilviaHERIUG, Silvia
Dr. MICHEEL, BurkhardDr. MICHEL, Burkhard
Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen myeloische Leukämiezellen des MenschenProcess for the preparation of monoclonal antibodies against human myeloid leukemia cells
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen myeloische Leukämien des Menschen. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik und Therapie.The invention relates to a process for the production of monoclonal antibodies against human myeloid leukemia. Field of application of the invention is medical diagnostics and therapy.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Verschiedene Leukämien humanen Ursprungs können in der Zellkultur unbegrenzt gehalten werden. Die Linie K562 wurde nrsprünglich von einem Patienten mit- chronisch-myeloischer Leukämie (CiIL) angelegt (LOZZIO u. LOZZIO, Blood 1975,' !£, 321)· Sie besitzt Eigenschaften einer pluripotenten Stammzelle. Characteristics of the known technical solutions Various leukemias of human origin can be kept indefinitely in the cell culture. The K562 line was originally created by a patient with chronic myeloid leukemia (CiIL) (LOZZIO and LOZZIO, Blood 1975, 161). It has characteristics of a pluripotent stem cell.
Verschiedene monoklonale Antikörper gegen humane Leukämiezellen sind bekannt, es wurden auch schon derartige Antikörper gegen K562-Zellen beschrieben (YOUlTG et al., Proc. Nat.Acad.Sci. 1981, 78, 7073; SCHIElILE u. MÜLLER-RUCHHOLTZ, J. Cancer Res.Clin.Oncol. 1981, 101, 109). Die Herstellung der monoklonalen Antikörper erfolgte durch die bekannten Techniken der Zellfusion und Selektion antikörperproduzierender Hybridome. Die bisher beschriebenen Anti-K562-Antikörper reagieren jedoch nicht ausschließlich mit Leukämiezellen und sind daher für eine medizinische Diagnostik und Therapie nur bedingt einsetzbar.Various monoclonal antibodies to human leukemia cells are known, and such antibodies to K562 cells have already been described (DIGL et al., Proc. Nat. Acad. Sci 1981, 78, 7073; SCHIEILLE and MULLER-RUCHHOLTZ, J. Cancer Res.Clin.Oncol., 1981, 101 , 109). The preparation of the monoclonal antibodies was carried out by the known techniques of cell fusion and selection of antibody-producing hybridomas. However, the previously described anti-K562 antibodies do not react exclusively with leukemia cells and are therefore of limited use for medical diagnosis and therapy.
c —c -
Die Erfindung hat das Ziel, monoklonale Antikörper hoher Spezifität gegen bestimmte Leukämiezellen herzustellen. Diese Antikörper sollen für die immunhistologische und serologische Diagnostik und möglicherweise nach Kopplung mit einem zytοtoxischen Reagens für die Therapie derartiger Leukämien geeignet sein.The invention aims to produce monoclonal antibodies of high specificity against certain leukemia cells. These antibodies should be suitable for immunohistological and serological diagnosis and possibly after coupling with a cytotoxic reagent for the therapy of such leukemias.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen K562- und andere myeloische Leukämiezellen ist dadurch gekennzeichnet, daß man Milzzellen von Balb/c-Mäusen, die mit K562-Zellen immunisiert wurden, mit X63-Ag8.653 Myelomzellen in der Zellkultur fusioniert und die erhaltenen Hybridome in Mikrotestplatten' aussät. Die antikörperproduzierenden Hybridome werden mit Radioimmun-, Immunofluoreszenz- und Rosettentests nachgewiesen. Die reaktiven Hybridome werden kloniert, ihre Spezifität wird erfindungsgemäß mit einer Vielzahl von normalen und leukämischen Zellen und mit Hilfe obengenannter serologischer Tests ermittelt. Die spezifischen Hybridome werden ausgewählt, weitervermehrt, in flüssigem Stickstoff gelagert und bei Bedarf zur Produktion größerer Antikörpermengen auf Mäusen in Aszitesform transplantiert. Bei der Immunisierung von Mäusen mit der Zellinie K562, die zahlreiche Eigenschaften von Stammzellen besitzt, ist dieThe method according to the invention for the production of monoclonal antibodies against K562 and other myeloid leukemia cells is characterized in that spleen cells of Balb / c mice immunized with K562 cells are fused with X63-Ag8.653 myeloma cells in the cell culture and seeded hybridomas in microtest plates. The antibody-producing hybridomas are detected by radioimmuno, immunofluorescence and rosette tests. The reactive hybridomas are cloned, their specificity is determined according to the invention with a variety of normal and leukemic cells and with the aid of the abovementioned serological tests. The specific hybridomas are selected, propagated, stored in liquid nitrogen, and transplanted as needed to produce larger quantities of antibody to ascites form mice. In the immunization of mice with the cell line K562, which has numerous properties of stem cells, is the
diethe
Bildung von verschiedenen Antikörpern zu erwart en ,=&& unterschiedliche weiße Blutzellen sowie Leukämieζeilen verschiedenen histologischen Ursprungs erkennen. Die Bildung von Antikörpern, die nur mit K562-Zellen oder nur mit bestimmten Leukämiezellen reagieren, ist dabei sehr unv/ahrscheinlich.Formation of different antibodies expected, = && recognize different white blood cells as well as leukemia parts of different histological origin. The formation of antibodies that react only with K562 cells or only with certain leukemia cells is very unlikely.
Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden:The invention will be explained in more detail below using an exemplary embodiment:
1) Herstellung der Hybridome aus Milzzellen von BaIb/c-Mäusen und X63-Ag8.653 Myelomzellen. Fusion, Kultivierung, Klonierung etc. in Anlehnung an die Originalarbeit KÖHLER und MILSTEIlT, Nature 1975, 256, 495. Die Myelomlinie X63-Ag8.653 wurde von KEAEBEY et al., J.Immunol. 1979, 123, 1547, hergestellt.1) Preparation of hybridomas from spleen cells of BaIb / c mice and X63-Ag8.653 myeloma cells. Fusion, cultivation, cloning, etc. based on the original work KÖHLER and MILSTEIlT, Nature 1975, 256, 495. The myeloma line X63-Ag8.653 was described by KEAEBEY et al., J. Immunol. 1979, 123 , 1547.
2) Die Selektion antikörperproduzierender Hybridome erfolgte mit einem Radioimmuntest, bei dem vitale K562-Zellen nacheinander mit dem Kulturüberstand der Hybridome und2) The selection of antibody-producing hybridomas was carried out with a radioimmunoassay in which vital K562 cells were sequentially incubated with the culture supernatant of the hybridomas and
1 25 anschließend mit J-markierten Anti-Maus-Ig-Antikörpern inkubiert wurden.1 25 were then incubated with J-labeled anti-mouse Ig antibodies.
3) Die Ermittlung der ileaktionsspezifität der identifizierten Antikörper erfolgte durch Austesten von verschiedenen kultivierten Zellinien, normalen weißen Blutzellen und Leukämiezellen unterschiedlichen histologischen Ursprungs mit dem Radioimmuntest, dem Rosettenimmuntest (Inkubation der vitalen Zellen mit den Antikörpern und anschließend mit Protein-A-markierten Rinder- oder Schaferythrozyten) und in erster Linie mit dem indirekten Immunofluoreszenztest an fixierten Zellen (Inkubation der auf Objektträger angetrockneten und Azeton-fixierten Zellen mit den Antikörpern und anschließend mit Pluoreszsin-markierten Anti-Maus-Ig-Antikörpern)· Die Auswertung erfolgte mit einem Gammastrahlen-Zählgerät unter dem Lichtmikroskop oder unter dem Fluoreszenzmikroskop entsprechend dem angewendeten Test.3) The reaction specificity of the identified antibodies was determined by testing various cultured cell lines, normal white blood cells and leukemic cells of different histological origin with the radioimmunoassay, the rosette immunoassay (incubation of the vital cells with the antibodies and subsequently with protein A-labeled bovine or Sheep erythrocytes) and primarily with the indirect immunofluorescence assay on fixed cells (incubation of the cells dried on slides and acetone-fixed with the antibodies and then with pluorescens-labeled anti-mouse Ig antibodies). The evaluation was carried out with a gamma-ray counting device under the light microscope or under the fluorescence microscope according to the test used.
Bezeichnung derdescription of
Antikörperantibody
ZIK-C1-A/D9 (Laborbezeichnung J; Ig-Subklasse: IgG 1)ZIK-C1-A / D9 (laboratory name J; Ig subclass: IgG 1)
ausschließlich K562 und myelöische Leukämieζeilen (von 35 getesteten Leukämien zeigten 24 eine positive Reaktion, d.h. etwa 70 %) excluding K562 and myeloid leukemia (from 24 leukemias tested, 24 showed a positive response, ie, about 70 %)
ZIK-C1-A/C5 K562 und weißeZIK-C1-A / C5 K562 and white
(Laborbezeichnung C; Blutzellen der(Laboratory designation C;
Ig-Subklasse: lymphatischenIg subclass: lymphoid
IgG 2a ReiheIgG 2a series
ZIK-C1-A/H5 . K562 und weiße (Laborbezeichnung H) Blutzellen derZIK-C1-A / H5. K562 and white (laboratory name H) blood cells of the
granulozytärengranulocytic
Reiheline
Dieser Antikörper bietet sich damit für eine Anwendung in der Diagnostik und Therapie myeloischer Leukämien geradezu an.This antibody is therefore ideal for use in the diagnosis and treatment of myeloid leukemia.
Diese Antikörper sind für immunhistologische Untersuchungen in der. Hämatologie anwendbar.These antibodies are suitable for immunohistological studies in the. Hematology applicable.
4) Herstellung der Antikörper4) Preparation of the antibodies
Die Gewinnung der Antikörper erfolgte aus der Kulturflüssigkeit der kultivierten bzw. aus der Aszitesflüssigkeit der transplantierten Hybridome entsprechend üblicher Methoden (KENTTETT, McKEARU u. 3ECHT0L: Monoclonal Antibodies. Hybridomas: A Nev/ Dimension in Biological Analyses. Plenum Press, New York u. London 1981).The antibodies were obtained from the culture fluid of the cultured or from the ascites fluid of the transplanted hybridomas according to customary methods (KENTTETT, McKEARU and 3ECHT0L: Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A Nev / Dimension in Biological Analyzes, Plenum Press, New York and London 1981).
5) Anwendungsm'dglichkeiten der erhaltenen Antikörper:5) Applicability of the antibodies obtained:
Alle erhaltenen Antikörper können für immunhistologische Tests bei hämatologischen Untersuchungen herangezogen werden. Besonders der Antikörper ZIK-C1-A/D9 bietet sich für eine immunhistologische bzw. serologische Differenzierung von myeloischen Leukämien an. Nach Kopplung mit toxischen Substanzen erscheint eine Anwendung in der Therapie myeloischer Leukämien ebenfalls sinnvoll, entweder durch In-vivo-Injektion oder durch In-Vitro-Behandlung autologer Knochenmarktransplantate bei Patienten mit diesen Erkrankungen.All antibodies obtained can be used for immunohistological tests in haematological examinations. In particular, the antibody ZIK-C1-A / D9 is suitable for immunohistological or serological differentiation of myeloid leukemias. After coupling with toxic substances, use in the therapy of myeloid leukemias also appears useful, either by in vivo injection or by in vitro treatment of autologous bone marrow transplants in patients with these disorders.
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| CN117256565A (en) * | 2023-09-27 | 2023-12-22 | 广东药科大学 | Method for constructing a chronic myeloid leukemia mouse model with conditional overexpression of human EZH2 |
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1984
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