DD225621A1 - Verfahren zur herstellung von zelloberflaechen-antigenen aus pilzen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung hochwirksamer Antigene der Pilze zum sicheren Nachweis humoraler und zellulaerer Antikoerper im Blutserum und zur Gewinnung toxinfreier Impfstoffe gegen generalisierte Pilzinfektionen. Durch die Erfindung koennen die kommerziellen Testsysteme verbessert, d. h. empfindlicher und sicherer gestaltet werden. Das erfindungsgemaesse Verfahren erlaubt erstmals eine Optimierung zwischen Antigenausbeute und Wirksamkeit und ist zur Gewinnung aller Pilzantigene anwendbar. Zelloberflaechen-Antigene aus Pilzen werden in serodiagnostischen Laboratorien der Kliniken und Krankenhaeuser benoetigt.
Description
Titel
Verfahren zur Herstellung von Zelloberflächen-Anti- f-encn aus Pilsen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Antigenherstellung sun serologischen ITachweis von I.Iycose-Antikörpern in Blutsertun sowie eines Impfstoffes gegen generalisierte Pilzinfektionen und ist in die IPII A 61 k einzuordnen.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Die bisher als Reagentien hergestellten Antigene sind aus nachfolgend genannten Gründen für serodiagnostische Zwecke ungeeignet:
1. Der Gehalt an ".virksarien Antigenen ist zu gering. 2. Der Gehalt an v/irksamen Antigenen ist sehr unterschiedlich in den Chargen auch bei Anwendung nur eines üctraktionsverfahrens.
3. Verschiedene Extraktionsverfahren liefern unterschiedlich zusammengesetzte Antigenchargen.
4. Proteine v/erden bei allen bisherigen Verfahren modifiziert und denaturiert.
Die Reproduzierbarkeit zur Gewinnung brauchbarer Antigenchargen ist schlecht und die Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen klinischen Einrichtungen wegen Verwendung unterschiedlicher Pilzstämme und Extraktionsverfahren nicht gegeben.
Die wichtigsten Verfahren zur Gewinnung von polysaccharidhaltigen Pilzantigenen sind:
1. . -Naphthol- bzw. Phenol-Extraktion DD-Y/P 113843
2. Extraktion mit V/asser bzw. Puffern unter Erwärmung !TAKjIJIL-IA, 1D. u. 3ALL0U, C.3.: J. Biol. Chem. 249 (1S74) 7679-7634
3. Alkalische Extraktionsverfahren
BISHOP, C.I., 3LAIIX, P. u. GAHDITER, P.E.: Can. J. Chem. 33 (1960) 369-881
4· Desintegration der Biomasse und Gewinnung wasserlöslicher Antigene (Zellinhaltsantigene, somatisches Antigen)
BIGUSS, J., TPJJT VAIT KY, P., PRUIT, J. u. AITDRIEU, 5.: Liycopathol. et Llycol. Appl. ICC7I (1964) 241-256 5. Ausfällung von löslichen Antigenen aus dem Kulturfiltrat (metabolisches Antigen)
HEARIT, V.I.I. , -,7ILoOIT, E.V., PROCTOR, A.G. u. LIACIiEITSIE, D.W.R.: J. Lied. Llicrobiol. V3 (1S30) 451-453 Die unter den Punkten 1 und 5 genannten Verfahren liefern zwar häufiger brauchbare Chargen, jedoch gestatten die Ausbeuten von durchschnittlich 0,3fj bzw. 1-10 mg/1 Kulturfiltrat keine Gewinnung in größeren !.!engen.
Alle weiteren Verfahren liefern aufgrund geringer Selektivität größere !.!engen an Antigenen, jedoch werden die Proteinanteile denaturiert (Verfahren 2 und 3) und es sind ITukleinsäuren und andere unerwünschte Stoffe enthalten (2 und 4).
Sin Verfahren, welches die Gewinnung großer Mengen an Antigen gestattet, beruht auf der Ausnutzung der Kreuzreaktivität der Tmmunseren mit Antigenen gleichen Serotyps unter Verwendung eines apathogenen Stammes, DD-.7? 137403.
Ein Impfschutz gegen generalisierte Pilzinfektionen (z.B. gegen Candida albicans) ist gegenwärtig noch nicht möglich. Jedoch gibt es erste Portschritte durch die Anwendung von Candida albicans-Ribosomen im Tierexperiment (SIlGAL, 3. u. SAiTOVSICI-LOSICA, H.: Sabouraudia 19 (1 S31) 267-273.
Die Erfindung hat das Ziel, mit geringem Aufwand hochantigene Zelloberflachenmaterialien von Pilzen zu gewinnen. Diese Antigene müssen für serodiagnostische Zwecke frei sein von den nicht-antigen wirksamen und störenden Zellinhaltsstoffen; für Jnpfzwecke dürfen keine toxischen Stoffe enthalten sein.
'.'/esen der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zu entwickeln, mit welchem man durch spezielle Verfahrensschritte Zelloberflächenantigene von der Zelloberfläche ablöst, ohne dabei die Zelle zu zerstören.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man die Biomasse, welche auf AgamährbÖden bzw. in Flüssigkultur gebildet wurde, erntet, falls erforderlich wäscht, in wäßriger Lösung suspendiert und anschließend mechanisch beansprucht. Diese mechanische Beanspruchung erfolgt durch Snergieeintrag mittels Ultraschall, durch Vibration, durch Schütteln mit Glaskügelchen, durch Rührung u.a. überraschenderweise wurde gefunden, daß durch Steuerung dieses Pr ο zesses einerseits selektiv hochantigene nichttoxische Stoffe von der Zellwand der Organismen abgelöst wurden, andererseits die Viabilität der Organismen kaum beeinträchtigt wird. Durch Verwendung von Salzen, Detergentien, Lösungsmitteln und anderen chemischen Zusätzen kann dieser Prozeß zusätzlich gesteuert v/erden. ITach Abtrennen der Llikroorganismen durch z.B. Zentrifugation werden niedermolekulare Verbindungen von hochmolekularen Antigen abgetrennt, das-Antigen durch Ausfällen mit wassermischbaren organischen Losungsmitteln , die Ilichtlöser für das Antigen sind, bzw. durch Gefriertrocknung u.a. gewonnen. Das Verfahren erlaubt erstmals eine Optimierung zwi-. sehen Ausbeute und V/irksamkeit der Antigene und ist generell zur Gewinnung von Pilzantigen anwendbar.
Die erfindungsgemäß hergestellten Antigene unterscheiden sich von den durch herkömmliche Sztraktionsmethoden gewonnenen Antigenen sowohl hinsichtlich ihres Protein- und Phosphatgehaltes als auch hinsichtlich ihrer Zuckerzusammensetzung. So enthält ein aus Candida albicans durch Citrateictraktion gewonnenes Produkt 1,1^ P und 46?i Protein, das aus einem Teil des gleichen Ausgangsmaterials erfindungsgemäß gewonnene Antigen dagegen 1,6fj P und 11, 6£ Protein.
Hinsichtlich der Zuckerzusammensetzung der beiden Antigene ergibt sich folgendes Bild:
Hannose Galaktose Glucose
Citrateztrakt 39,7% - 1,
i/o
erfindungsgemäßes Antigen Gl,2% 4,7£ 3,0%
Einen ähnlichen Unterschied findet man auch bei der Aiii trennung der beiden Antigene mittels ültradümischichtisoelektrofokussierung. Während das durch Citratextraktion gewonnene Antigen mehrere Proteinbsw. Glucoproteinbanden bei unterschiedlichen iso-
elektrischen Punkten liefert, zeigt das Antigen, das gemäß dem beschriebenen Verfahren aus dem gleichen Ausgangsmaterial gewonnen wurde, praktisch nur eine Bande, die sich in der Denzitometrie als weiter aufspaltbar erweist.
Das erfindungsgemäß hergestellte Antigen erwies sich bei Imnunisierungsunt er suchungen an I.Iäusen im untersuchten Bereich als nichttorisch.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen näher beschrieben.
10g ?euchtbiomasse der Hefe Candida albicans werden in 30 ml 0,15 H Kochsalslösung suspendiert. In diese Suspension wird in einem Glasgefäß Ultraschall einer Leistung von 200 7/ 1 bis 2 Lünuten bei 0 0C eingetragen, wobei die Temperatur während der Beschallung 5 0C nicht übersteigen darf. Anschließend werden die Zellen in einer Ivühlsentrifuge abgetrennt und der erhaltene klare Überstand im Hülilraum bis zur Kochsalsfreiheit gegen destilliertes ',/asser dialysiert.
Anschließend wird das salzfreie Material im Vakuumrotationsverdampfer bei einer Sadtemperatur von 20 0C auf 10 ml eingeengt und anschließend lyophilisiert. Es werden 120 mg hochwirksames Zelloberflächenantigen erhalten.
Eine Suspension aus 10· g Feuchtbiomasse der Hefe' Candida albicans und 20 ml physiologischer Kochsalslösung, die mit 0,1 IvI Phosphatpuffer auf pH 7,2 eingestellt wurde, wird in einem Edelstahlgefäß eines Tibralionshomogenisators gerade mit soviel Glaskügelchen (0,1 bis 0,5 mm Durchmesser) versetzt, daß die gesamte Suspension von den Glaskügelchen aufgenommen wird. Llan trägt unter Kühlung auf 4 0C 30 LIinuten 30 '.7 mittels eines Vibrationshomogenisators in die Zellsuspension ein. Anschließend werden die Glaskügelchen auf einer groben Glasfritte von der Zellsuspension abgetrennt und mit 0,15 1.1 Kochsalslösung nachgewaschen. Zur Abtrennung der Hefesellen wird die Suspension 10 J.Iinuton bei 3000 :c g zentrifugiert-, der klare Überstand abgetrennt und im Kühlraum gegen destilliertes ".Vasser bis SlU" Kochsalsfreiheit dialysiert. Llan engt auf ca. 10 ml im Yakuumrotationsverdampf er ein und fällt das hochmolekulare Antigen durch Zugabe des 5-fachen Volumens an Ethanol aus. Das ausgefällte · Antigen wird abgetrennt, erneut in destilliertem ' » 'asser (ca. 10 bis 15 ml) aufgenommen und durch Eingießen der Lösung in die 10-fache Menge an Ethanol lyophil gefällt. Llan saugt ab und trocknet. Es werden 105 ng des Zelloberflächenantigens erhalten.
Zine Suspension von 10 g iyeuchtbiomasse der Hefe Candida albicans in 100 ml 1 Ll Harnstoff lösung wird unter Kühlung auf 7 C in einem Becherglas mit einem Laborrührwerk mittels eines starren Plügelrührers bei 500 U/min gerührt. Im Anschluß daran wird die Biomasse absentrifugiert und der klare Überstand durch Dialyse gegen destilliertes ',Vasser vom Harnstoff befreit. Die harnstofffreie Lösung des Zelloberflächenantigens wird durch Ultrafiltration auf ca. 10 ml eingeengt und Ivophiliciert. Es werden 30 mg Zelloberflächenantigen erhalten.
Claims (2)
- . Verfaliren zur Herst«genen aus Pilzen für den klinisch-diagnostischen Gebrauch, dadurch gekennzeichnet, daß man durch Eintrag mechanischer Energie in die wäßrige Suspension der I.Iikroorganisnen hochwirksames Zelloberflächenantigen freisetzt und dieses in bekannter V/'eise weiter reinigt und gewinnt.
- 2. Verfaliren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Freisetzung der Zelioberflächenantigene in Gegenwart von Puffersubstanzen, Salzen, Harnstoff oder mit V/asser mischbaren organischen Lösungsmitteln erfolgt.
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