DD227724A1

DD227724A1 - PROCESS FOR SYNCHRONIZING MICRO-ORGANISMS IN CONTINUOUS CULTURES

Info

Publication number: DD227724A1
Application number: DD26631984A
Authority: DD
Inventors: Barbara Uebel; Joachim Bauch; Inge-Lore Genz; Manfred Koehler; Roland Buettner; Thomas Prahl
Original assignee: Univ Ernst Moritz Arndt
Priority date: 1984-08-16
Filing date: 1984-08-16
Publication date: 1985-09-25

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synchronisation von Mikroorganismen in kontinuierlichen Kulturen zur biotechnischen Stoffwandlung mit Hilfe wachsender Zellen. Ziel und Aufgabe sind, ein Verfahren zur Synchronisation und anschliessenden Selbstregulation des synchronen Wachstums von Mikroorganismen in kontinuierlichen Kulturen anzugeben. Dies wird erreicht, indem das Wachstum einer kontinuierlichen Kultur durch ein solches Substrat limitiert wird, das in einer bestimmten Phase des Teilungszyklus verstaerkt benoetigt wird. Das limitierende Substrat wird nicht kontinuierlich, sondern portionsweise zugegeben, so dass die Zellen, die im Moment der Zugabe die hoechste Aufnahmegeschwindigkeit fuer dieses Substrat haben, in der darauffolgenden Generationszeit nahezu mit Dmmax wachsen. Der Abstand zwischen den Zugaben muss jeweils gleich der aktuellen Generationszeit dieser Zellen sein. Dieser Abstand wird automatisch eingehalten, indem die Zugaben jeweils dann ausgeloest werden, wenn das b-fache der Naehrmediummenge, die einem Kulturvolumen entspricht, zugeflossen ist. Der Faktor b ist charakteristisch fuer den Synchronisationsgrad der Kultur und kleiner als ln 2.The invention relates to a method for the synchronization of microorganisms in continuous cultures for biotechnical metabolism using growing cells. The aim and the object are to provide a method for the synchronization and subsequent self-regulation of the synchronous growth of microorganisms in continuous crops. This is accomplished by limiting the growth of a continuous culture through such a substrate that is required to be enhanced in a particular phase of the partition cycle. The limiting substrate is not added continuously, but in portions, so that the cells that have the highest absorption rate for this substrate at the moment of the addition grow almost with Dmmax in the subsequent generation time. The distance between the additions must always be equal to the current generation time of these cells. This distance is automatically maintained by the additions are each triggered when the b-times the NahÄhmediummenge, which corresponds to a culture volume, has flowed. The factor b is characteristic of the degree of synchronization of the culture and less than ln 2.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synchronisation von Mikroorganismen in kontinuierlichen Kulturen zur biotechnischen Stoffwandlung mit Hilfe wachsender Zellen.The invention relates to a method for the synchronization of microorganisms in continuous cultures for biotechnical metabolism using growing cells.

Characteristic of the known technical solutions

Zur Synchronisation des Wachstum von Mikroorganismen sind aus dem Stand der Technik drei prinzipielle Methoden bekannt.For the synchronization of the growth of microorganisms, three principal methods are known from the prior art.

So ist in Dawson, P.S.S., 1965, Canad. J. Microbiol. 11, S.893-903 eine Verfahrensweise beschrieben, bei der durch Substratlimitation das Wachstum der Zellen in einem bestimmten Stadium des Teilungszyklus zum Stillstand kommt, von wo aus durch Zugabe des bis dahin limitierenden Substrates der Beginn des synchronisierten Wachstums erfolgt. Die Substratmenge wird so bemessen, daß sie nur für eine Verdopplung der Biomasse ausreicht. Nach jeder Verdopplung der Biomasse wird die Hälfte der Kulturlösung entnommen und durch die gleiche Menge frischen Nährmediums ersetzt. Diese Methode ist bisher nur für die Synchronisation von semikontinuierlichen Kulturen nutzbar. Durch Einsatz dieser Methode bei der Futterhefeproduktion konnte durch eine Reduktion der Kohlenstoffsubstratzufuhr während etwa Vs der Generationszeit der Zellen einer synchronisierten Hefepopulation eine erhöhte Effektivität der Ausnutzung der C-Quelle bei der Biomasseproduktion erzielt werden (Heinritz, B. et al., 1983, Acta Biotechnol. 3, S. 125-131; Kardos, J. et al., Dynamische Grundoperationen der Verfahrenstechnik, Akademie-Verlag Berlin, 1984, S. 107).Thus, in Dawson, P.S.S., 1965, Canad. J. Microbiol. 11, S.893-903 describes a procedure in which by substrate limitation the growth of the cells comes to a standstill at a certain stage of the division cycle, from where the addition of the hitherto limiting substrate, the beginning of the synchronized growth takes place. The amount of substrate is such that it is sufficient only for a doubling of the biomass. After each doubling of the biomass, half of the culture solution is removed and replaced with the same amount of fresh nutrient medium. So far, this method has only been usable for the synchronization of semi-continuous cultures. By using this method in forage yeast production, by reducing the carbon substrate feed during about Vs of the generation time of the cells of a synchronized yeast population, increased efficiency of utilization of the C source in biomass production could be achieved (Heinritz, B. et al., 1983, Acta Biotechnol 3, pp. 125-131; Kardos, J. et al., Dynamic Basic Operations of Process Engineering, Akademie-Verlag Berlin, 1984, p. 107).

Bei der großtechnischen Nutzung dieses Verfahrens können eine Reihe von Schwierigkeiten auftreten. So ist eine genaue Bestimmung der mittleren Generationszeit der Zellen im Großfermentor in jeder Generation notwendig, da die Verdünnung der Kulturlösung erst dann erfolgen darf, wenn sich die Zellzahl verdoppelt hat. Die Bestimmung dieses Zeitpunktes ist bisher für die industrielle Biomasseproduktion oder Produktherstellung auf n-Alkanen oder feststoffhaltigen C-Quellen nicht automatisierbar und erfordert ständige mikroskopische Kontrolle. Kleine Schwankungen bei der Prozeßsteuerung oder der Qualität des Substrates oder Inhomogenitäten im Fermentor können die Generationszeit der Zellen erheblich beeinflussen. Daher ist der geeignete Zugabezeitpunkt nicht genau vorauszuberechnen, und es muß eine größere Anzahl von Proben über einen längeren Zeitraum kontrolliert werden.In the industrial use of this method, a number of difficulties can occur. Thus, an accurate determination of the average generation time of the cells in the large fermentor in each generation is necessary, since the dilution of the culture solution may be made only when the cell number has doubled. The determination of this point in time can not be automated for industrial biomass production or product production on n-alkanes or solid C sources and requires constant microscopic control. Small variations in the process control or the quality of the substrate or inhomogeneities in the fermentor can significantly affect the generation time of the cells. Therefore, the appropriate time of addition is not accurately predicted and a larger number of samples must be monitored over a longer period of time.

Bei einer weiteren Methode wird die erforderliche Wachstumshemmung durch geeignete physikalische Parameter, wie z. B. Temperatur oder pH-Wert, erzielt. Durch eine Aufhebung der das Wachstum hemmenden Umweltbedingungen wird das synchronisierte Wachstum der Population gestartet (Somova, LA. et al., 1972, Versuch einer Synchronisation kontinuierlicher Kulturen von Hefen (russ.), in: „Nepreryvnoe i periodiceskoe kul'tivirovanie mikroorganismov", Krasnojarsk, S. 123-127; Pecurkin, N.S.,Terskov, I.A., 1975, „Analyse der Kinetik des Wachstums und der Evolution in Mikroorganismenpopulationen" (russ.), Nowosibirsk, S.79-83).In another method, the required growth inhibition by suitable physical parameters such. As temperature or pH, achieved. By reversing the growth-inhibiting environmental conditions, the synchronized growth of the population is started (Somova, LA, et al., 1972, attempt to synchronize continuous cultures of yeasts (Russian), in: "Nepreryvnoe i periodiceskoe kul'tivirovanie mikroorganismov", Krasnoyarsk, pp. 123-127, Pecurkin, NS, Terskov, IA, 1975, "Analysis of the kinetics of growth and evolution in microorganism populations" (Russ.), Novosibirsk, p.79-83).

Diese Synchronisierungsverfahren umgehen die Schwierigkeiten der Methode der semikontinuierlichen Kultivierung dadurch, daß sie eine kontinuierliche Kultur nach dem Turbidostat-Prinzip einsetzen. In diesen Kulturen regelt sich die Durchflußrate auf den Wert der spezifischen Wachstumsrate der Zellen. Die Generationszeit g der Zellen kann damit automatisch aus der Durchflußrate D nach der Beziehung g = In2/D bestimmt werden. Turbidostatkulturen sind bei technisch interessanten Biomassekonzentrationen nur dann stabil, wenn alle essentiellen Nährstoffe im Überschuß angeboten werden. Sie arbeiten daher ökonomisch ineffektiv. Die Synchronisation dieser Kulturen wird durch eine solche zeitweilige Temperatur- oder pH-Änderung erreicht, die zu einem Entwicklungsstillstand der Zellen führt, wenn eine bestimmte Phase.des Teilungszyklus erreicht ist. Die ungünstige Bedingung muß so lange einwirken, bis praktisch alle Zellen mit der unter diesen Bedingungen herabgesetzten Wachstumsgeschwindigkeit bis zu diesem Stadium des Teilungszyklus herangewachsen sind. Erst dann wird wieder der optimale Wert (z. B. pH oder Temperatur) eingestellt, und es schließt sich eine Generationszeit des synchronen Wachstms bei optimalen Bedingungen an, nach der die Kultur wiederum in dieser bestimmten Phase des Teilungszyklus zum Wachstumsstillstand gebracht wird. Aus diesen beiden Gründen ist dieses Verfahren zur Verbesserung der Ökonomie technischer Verfahren ungeeignet. Nach Romanowski, Stepanova, Cernavski, „Mathematische Modellierung in der Biophysik" (russ.), Moskau 1975, ist es theoretisch möglich, die Synchronisation einer kontinuierlichen Kultur durch kurzzeitig wirkende wachstumsfördernde Reize im zeitlichen Abstand von einer Generationszeit der synchronisiert wachsenden Zellen zu erreichen. Über eine praktische Realisierung dieses Prinzips im Labor- oder Industriemaßstab ist bisher nichts bekannt. Eine AnwendungThese synchronization methods circumvent the difficulties of the semicontinuous cultivation method by employing a continuous culture according to the turbidostat principle. In these cultures, the flow rate is controlled by the value of the specific growth rate of the cells. The generation time g of the cells can thus be determined automatically from the flow rate D according to the relationship g = In2 / D. Turbidostat cultures are only stable at technically interesting biomass concentrations when all essential nutrients are offered in excess. They therefore work economically ineffective. The synchronization of these cultures is achieved by such a temporary temperature or pH change, which leads to a developmental arrest of the cells when a certain phase of the division cycle is reached. The unfavorable condition must be effective until practically all cells have grown with the growth rate reduced under these conditions up to this stage of the division cycle. Only then is the optimum value (eg pH or temperature) set again and a generation time of the synchronous growth at optimal conditions follows, after which the culture is again brought to standstill in this particular phase of the division cycle. For these two reasons, this method is unsuitable for improving the economy of technical processes. According to Romanowski, Stepanova, Cernavski, "Mathematical Modeling in Biophysics" (russ.), Moscow 1975, it is theoretically possible to achieve the synchronization of a continuous culture by short-acting growth-stimulating stimuli at a time interval from a generation time of synchronized growing cells. So far nothing is known about a practical realization of this principle on a laboratory or industrial scale

dieses Prinzips auf die üblichen Turbidostatkulturen würde wegen der prinzipiell schlechten Substratnutzung bei diesem Kultivierungsverfahren keine besonderen Vorteile versprechen. Bei der Anwendung auf eine Chemostatkultur bleiben die o. g. Schwierigkeiten bei der Bestimmung der Generationszeit der synchronisiert wachsenden Zellen bestehen. Um den Nachteil der üblichen Turbidostatkultivierung bei Substratüberschuß zu beseitigen, wird in dem DD-WP C 12 N 260836/1 ein Verfahren zur substratlimitierenden Steuerung kontinuierlicher Kulturen vom Turbidostat-Typ vorgeschlagen. Nach diesem für alle bekannten Formen von Turbidostaten anwendbaren Verfahren wird mindestens eine wachstumsessentielie Komponente des Nährmediums nicht über die der Wachstumsgeschwindigkeit proportionale Regelung, sondern mit konstanter, die Wachstumsrate limitierende Geschwindigkeit zur Kultur zugeführt. Mischlimitationen können bei vorgewählten limitierenden Angeboten der einzelnen Komponenten im Verhältnis zur Biomassekonzentration eingestellt werden. Die dritte prinzipielle Methode zur Synchronisation des Wachstums von Mikroorganismen ist aus Vrana, D., 1976, Biotech. Bioerig. 18, S. 297 bekannt und beinhaltet die Gewinnung von Zeilen in gleicher Phase des Teilungszyklus durch Abtrennung der kleinen Knospen einer wachsenden Hefezellpopulation, z. B. durch Zentrifugation und deren Einsatz als Inokulum.für eine synchronisiert wachsende batch-Kultur. Diese Methode ist jedoch lediglich für diskontinuierliche Prozesse anwendbar.this principle to the usual Turbidostatkulturen would promise no special advantages because of the poor substrate use in this cultivation process. When applied to a chemostat culture, the o. G. Difficulties in determining the generation time of synchronized growing cells exist. In order to eliminate the drawback of conventional turbidostate cultivation at substrate excess, DD-WP C 12 N 260836/1 proposes a method for substrate limiting control of continuous turbidostatic type cultures. According to this method, applicable to all known forms of turbidostates, at least one growth-sensitive component of the nutrient medium is fed to the culture not via the growth rate-proportional control but at a constant rate limiting the rate of growth. Mixed limits can be set with preselected limiting offers of the individual components in relation to the biomass concentration. The third principal method for the synchronization of the growth of microorganisms is from Vrana, D., 1976, Biotech. Bioerig. 18, p. 297, and involves obtaining lines in the same phase of the division cycle by separating the small buds of a growing yeast cell population, e.g. By centrifugation and their use as inoculum. For a synchronously growing batch culture. However, this method is only applicable to discontinuous processes.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Synchronisation von Mikroorganismen in kontinuierlichen Kulturen anzugeben, mit dem die praktische Ausnutzung der Vorteile synchron wachsender Mikroorganismen in kontinuierlich betriebenen biotechnologischen Verfahren verbessert wird und es somit zu einer Steigerung der Effektivität solcher Prozesse kommt.The aim of the invention is to provide a method for the synchronization of microorganisms in continuous cultures, with which the practical exploitation of the benefits of synchronously growing microorganisms in continuously operated biotechnological processes is improved and thus there is an increase in the effectiveness of such processes.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, unter Ausnutzung der Eigenschaften einer substratlimitierend gesteuerten Kultur vom Turbidostat-Typ eine Selbstregelung der Synchronisation der in einer solchen kontinuierlichen Kultur wachsenden Mikroorganismen zu erreichen.The object of the invention is to achieve a self-regulation of the synchronization of the microorganisms growing in such a continuous culture by utilizing the properties of a turbidostatic type substrate-limited culture.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß von einer substratlimitierend hergestellten Kultur vom Turbidostat-Typ ausgegangen wird. Danach wird eine Komponente der Nährlösung als limitierendesSubstrat ausgewählt, die vorwiegend in einer bestimmten Phase des Teilungszyklus von den Zellen benötigt und aufgenommen wird.According to the invention, the object is achieved by starting from a substrate-limiting culture of the turbidostat type. Thereafter, a component of the nutrient solution is selected as the limiting substrate that is needed and received by the cells primarily at a particular stage of the division cycle.

Die konstante Zuflußgeschwindigkeit des limitierenden Substrates wird so gewählt, daß die kontinuierliche Kultur auf Grund dieser Limitation mit einer weit unterhalb von /x_max liegenden spezifischen Wachstumsrate μ-, wächst. Der Wert von μ, sollte im Bereich von 0,01 μ^,, bis 0,6μ_ΙΤ13Χ' vorzugsweise im Bereich 0,05μ_Γη3Χ bis 0,2μ_Γη3Χ liegen.The constant rate of flow of the limiting substrate is chosen so that the continuous culture grows due to this limitation with a specific growth rate μ- much below / x _max . The value of μ, should be in the range of 0.01 μ ^ ,, to _0,6μ ΙΤ13Χ 'is preferably in the range are to _{_0,2μ} Γη3Χ 0,05μ Γη3Χ.

Ebenso kann eine beliebige Kultur vom Turbidostat-Typ dadurch in den für die Synchronisation geeigneten Ausgangszustand gebracht werden, daß man nach Erreichen der vorgesehenen Biomassekonzentration nur die Zufuhr der als limitierendes Substrat ausgewählten Komponente abschaltet und das Absinken der spezifischen Wachstumsrate bis zu dem geeigneten Wert abwartet.Likewise, any turbidostatic type culture may be brought into the initial state suitable for synchronization by switching off only the supply of the component selected as the limiting substrate after reaching the intended biomass concentration and awaiting the decrease of the specific growth rate to the appropriate value.

Zu einer solchen substratlimitierten kontinuierlichen Auxostatkultur wird zu einem Zeitpunkt 11 eine bestimmte Menge des limitierenden Substrates zugesetzt. Diese Menge soll so groß sein, daß damit der volle Bedarf derjenigen Zellen gedeckt wird, die sich im Moment dieser Zugabe in dem Stadium ihres Teilungszyklus befinden, in dem der erhöhte Bedarf an dem limitierenden Substrat auftritt. Damit können diejenigen Zellen, die diese Substratmenge bevorzugt aufgenommen haben, für die Dauer einer Generationszeit mit einer spezifischen Wachstumsrate, die größer als μ_: ist, wachsen. Jeweils im Abstand von einer Generationszeit der schneller wachsenden Zellen erfolgen weitere Zugaben des limitierenden Substrates, wobei die jeweils zugegebene Menge entsprechend dem erreichten Synchronisierungsgrad erhöht wird.To such a substrate-limited continuous Auxostatkultur at a time 11, a certain amount of the limiting substrate is added. This amount should be sufficient to meet the full needs of those cells which are at the moment of this addition at the stage of their division cycle in which the increased demand for the limiting substrate occurs. Thus, those cells that have taken up preferentially this amount of substrate for the duration of a generation time with a specific growth rate that is greater than _μ: is growing. In each case at a distance from a generation time of the cells growing faster, further additions of the limiting substrate are made, the amount added in each case being increased in accordance with the degree of synchronization achieved.

Bei der ersten Zugabe beträgt die zugegebene Menge des limitierenden Nährstoffes unter 50%, vorzugsweise 3-15% der Nährstoffmenge, die für unlimitiertes Wachstum während einer Generationszeit für die gesamte Biomassemenge im Fermentor erforderlich wäre. Bei den folgenden Zugaben wird diese Menge entsprechend dem erreichten Synchronisierungsgrad erhöht.In the first addition, the amount of limiting nutrient added is less than 50%, preferably 3-15%, of the amount of nutrient that would be required for unlimited growth during a generation time for the entire biomass amount in the fermentor. In the following additions, this amount is increased according to the achieved degree of synchronization.

Siesoll im synchronisierten kontinuierlichen Betrieb etwa 40-95% der für die Gesamtbiomasse erforderlichen Nährstoffmenge, vorzugsweise 60-85% dieser Menge betragen.In synchronized continuous operation, it should be about 40-95% of the amount of nutrients required for the total biomass, preferably 60-85% of this amount.

Zur Bestimmung des Abstandes zwischen den Zugaben werden die Zellen zunächst im gleichen Fermentor bei den vorgesehenen Kultivierungsbedingungen der zu synchronisierenden Kultur nach dem üblichen Auxostatverfahren kultiviert, wobei der für diese Kultivierungsbedingungen zutreffende Wert D = μ_Γπ3Χ gemessen wird.To determine the distance between the additions, the cells are first cultured in the same fermenter at the intended culture conditions of the culture to be synchronized by the usual Auxostatverfahren, wherein the value applicable for these cultivation conditions D = μ _{Γπ3Χ is} measured.

Nach Beginn derzurZeitti eingeleiteten Synchronisierung wählt man die Zeit Atzwischen den Zugaben des limitierenden Substrates entsprechend Ιη2/μ·,>Δΐ> Ιη2/μ_ΓΤ13Χ. Nach Erreichen eines merklichen Synchronisierungsgrades wird At auf den Wert der Generationszeit der synchronisiert wachsenden Zellen eingestellt.After the beginning of the synchronization initiated at the time, one selects the time Δt between the additions of the limiting substrate corresponding to Ιη2 / μ ·,>Δΐ> Ιη2 / _μΓΤ13Χ . After reaching a significant degree of synchronization, At is set to the value of the generation time of the synchronously growing cells.

Der im kontinuierlichen Betrieb erreichbare Synchronisierungsgrad liegt unter 100%, da die Konzentration des limitierenden Substrates in der Zeit zwischen den Zugaben möglichst weit unterhalb des für ein Wachstum mit μ_Π13χ notwendigen Wertes liegen soll, d.h. ein bestimmter Teil der Zellen in der Kultur muß stark limitiert wachsen, um die Substratkonzentration auf dem angegebenen niedrigen Wert zu harten.The degree of synchronization achievable in continuous operation is less than 100%, since the concentration of the limiting substrate in the time between additions should be as far below the value required for growth with _μΠ13χ , ie a certain part of the cells in the culture must be strongly limited grow to hard the substrate concentration at the specified low value.

Die Durchflußrate D dieser Kultur kann während eines Teilungszykius schwanken. Ein dem Fließgleichgewicht äquivalenter Zustand ist erreicht, wenn der Synchronisierungsgrad und die Generationszeit der synchronisierten Zellen konstante Werte erreicht haben. In diesem Zustand der Kultur ist die spezifische Wachstumsrate μ₉ der Gesamtmenge an Biomasse im Fermentor etwas kleiner als die spezifische Wachstumsrate μ₃ = I n2/g_s für die synchronisierten Zellen. Für die Generationszeit g_s und damit für den Abstand At zwischen den Zugaben der Kultur muß At = g_s = a I n2/D gelten. Der Faktor a ist stets kleiner als 1.The flow rate D of this culture may vary during a split cycle. An equilibrium steady state state is reached when the degree of synchronization and the generation time of the synchronized cells have reached constant levels. In this state of culture, the specific growth rate μ _{9 of} the total amount of biomass in the fermentor is slightly smaller than the specific growth rate μ ₃ = I n 2 / g _s for the synchronized cells. For the generation time g _s and thus for the distance Δt between the additions of the culture At = g _s = a I n2 / D must hold. The factor a is always less than 1.

Er wird durch den Synchronisierungsgrad der Kultur bestimmt und ist bei konstantem Synchronisierungsgrad konstant.It is determined by the degree of synchronization of the culture and is constant at a constant degree of synchronization.

Fluktuationen oder Verschiebungen der Kultivierungsbedingungen, die die Generationszeit g_s der synchronisierten Zellen verändern, ändern in gleicherweise die Durchflußrate D der Kultur. Indem man nach Erreichen des gewünschten Synchronisierungsgrades den Faktor a bestimmt und automatisch die Zugabe des limitierenden Substrates jeweils dann auslöst, wenn die Nährlösungsmenge a V · I n2 zugeflossen ist (V = Kulturvolumen), bleibt die Synchronisation automatisch auch bei schwankenden Kultivierungsbedingungen erhalten. Voraussetzung dafür ist jedoch, daß sich der Ausbeutekoeffizient für das limitierende Substrat nicht merklich ändert. Modelluntersuchungen lassen erwarten, daß die Stabilität des Synchronisationsgrades erhöht wird, wenn At ein wenig größer als g_s gewählt wird, vorzugsweise im Bereich 1,01 g_s bis 1,1 g_s, wobei die höheren Werte für kleinere Synchronisationsgrade angewandt werden.Fluctuations or shifts of cultivation conditions which change the generation time g _{s of} the synchronized cells likewise change the flow rate D of the culture. By determining the factor a after reaching the desired degree of synchronization and automatically triggering the addition of the limiting substrate in each case when the nutrient solution volume a V · I n2 has flowed in (V = culture volume), the synchronization automatically remains even under fluctuating cultivation conditions. The prerequisite for this, however, is that the yield coefficient for the limiting substrate does not change appreciably. Model studies suggest that the stability of the degree of synchronization may be increased if At is chosen to be a little greater than g _s , preferably in the range of 1.01 g _s to 1.1 g _s , with the higher values being used for smaller degrees of synchronization.

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Ausfürhrungsbeispiel _ .._. .. ....Implementation example _ .._. .. ....

Die Erfindung soll nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispieles näher erläutert werden. Aus der Literatur (Jeter, J. R. et al., 1982, Cytobios, 35, S.47-62) ist bekannt, daß z. B. Magnesium in bestimmten Zeitintervallen des Teilungszyklus verstärkt von den Zellen benötigt und aufgenommen wird. Demzufolge wird Magnesium zur Synchronisation der Hefekultur als limitierendes Substrat gewählt. Zunächst wird die zu synchronisierende Hefe nach einem Turbidostatprinzip und anschließend mit Mg⁺⁺-1imitierender Steuerung im Laborfermentor gezüchtet. Die Kultivierungsbedingungen sollen denen beim geplanten Produktionsprozeß möglichst ähnlich sein. Das betrifft insbesondere die Biomassekonzentration und den O₂-Eingang pro Einheit Kulturvolumen. Als Ausgangswerte für die Synchronisation werden dabei folgende Parameterbestimmt: die unter diesen Bedingungen mögliche maximale spezifische VVachstumsrate /x._max, die Ertragskoeffizienten des limitierenden Substrates sowohl bei /x_max, als auch bei mehreren spezifischen Wachstumsraten im Bereich von 0,01 ß_max bis 0,85|u,_max. Diese Werte werden in der Form 1/Y = f(/x) graphisch dargestellt. Aus dieser Kurve wird der Mg⁺⁺-Bedarf bei/x_max für 2-10% der in der Kultur vorhandenen Biomasse errechnet. Diese Menge ist die 1. Portion, die zu der im steady state befindlichen Mg"⁺-Iimitiert gesteuerten Kultur zugegeben wird. Nach dieser Zugabe wird der kontinuierliche Mg⁺⁺-Zulauf abgestellt, wenn das limitierende Substrat nicht die C-Quelle ist. Die nächsten Zugaben erfolgen jeweils im Abstand von wenig mehr als I η2/μ_ηΐ3χ Stunden. Die Mg⁺⁺-Mengen werden von Zugabe zu Zugabe schrittweise erhöht. Bei großer Differenz (/u._max-D) können diese Schritte entsprechend größer gewählt werden. Ist ein ausreichender Synchronisationsgrad erreicht, bleiben die Mg⁺⁺-Mengen je Zugabe konstant. Zu diesem Zeitpunkt wird die Generationszeit der synchron wachsenden Zellen g_a und die Durchflußrate der Gesamtkultur D_a bestimmt. Daraus wird der Faktor b = a · I n2 = g_aD_a berechnet. Eine der technisch bekannten Regeleinrichtungen kontrolliert die Durchflußrate D der Kultur und löst die weiteren Mg⁺⁺-Zugaben jeweils im Abstand von At = g_s = b/D Stunden aus.The invention will be explained in more detail with reference to an embodiment. From the literature (Jeter, JR et al., 1982, Cytobios, 35, pp. 47-62) it is known that z. B. Magnesium at certain time intervals of the division cycle is increasingly needed and absorbed by the cells. Accordingly, magnesium is chosen to synchronize the yeast culture as a limiting substrate. First, the yeast to be synchronized is cultivated on a turbidostat principle and then with Mg ⁺⁺ -1imitierender control in Laborfermentor. The cultivation conditions should be as similar as possible to those in the planned production process. This applies in particular to the biomass concentration and the O ₂ input per unit culture volume. The following parameters are determined as output values for the synchronization: the maximum specific rate of supply / x possible under these conditions. _max , the yield coefficients of the limiting substrate both at / x _max , and at several specific growth rates in the range of 0.01 ß _max to 0.85 | u, _max . These values are plotted in the form 1 / Y = f (/ x). From this curve, the Mg ⁺⁺ requirement at / x _{max is} calculated for 2-10% of the biomass present in the culture. This amount is the 1st portion added to the steady state Mg " ⁺ " -impeded culture and after this addition the continuous Mg ⁺⁺ feed is turned off when the limiting substrate is not the C source The next additions are carried out at intervals of a little more than 1 η2 / μ _{ηΐ3χ hours.The} Mg ⁺⁺ quantities are increased stepwise from addition to addition.With a large difference (/ u _max -D), these steps can be correspondingly increased. is a sufficient degree of synchronization is reached, the Mg ⁺⁺ quantities depending adding remain constant. At this time, the generation time of the synchronously growing cells g _a, and the flow rate of the total culture D _a is determined. this is the factor b = a · I n2 = g _A D _A calculated. One of the industrially known control means controls the flow rate D of the culture and further solves the Mg ⁺⁺ -Zugaben at intervals of at = g _s = b / D of hours.

Bei der Maßstabvergrößerung wird prinzipiell in jeder weiteren Stufe das gleiche Synchronisationsverfahren, ausgehend von einem steady state mit substratlimitierender Steuerung, angewandt. Wenn die Ähnlichkeit der Kultivierungsbedingungen mit hinreichender Sicherheit gleiches ß_max für nicht Mg⁺⁺-Iimitierendes Wachstum sowie gleiche Y_Mg ⁺⁺-Werte wie im Laborfermentor erwarten lassen, kann die vorausgehende Kultivierung bei /A_max entfallen. Bei dem relativ langsamen Übergang dieser Kulturen in den streng limitierten Zustand, der für die Einleitung der Synchronisation erforderlich ist, bedeutet das erhebliche Zeiteinsparung bei den Stufen mit höherem Kulturvolumina. Der Faktor b muß jedoch in jeder Stufe neu ermittelt werden. Entsprechend dem Steuerprinzip muß diese Bestimmung aber im Prinzip nur jeweils für eine Generationszeit durchgeführt werden. Nur wenn die Möglichkeit einer Veränderung von Y_H+ besteht, durch die sich die Biomassekonzentration und damit der Limitations- und Synchronisationsgrad der Kultur verändern würde, ist eine Überprüfung bzw. Neubestimmung des Faktors b erforderlich.When scaling up, the same synchronization method is used in principle in each further step, starting from a steady state with substrate-limiting control. If the similarity of the cultivation conditions with sufficient certainty can expect the same ß _max for non-Mg ⁺⁺ -implementing growth and the same Y _Mg ⁺⁺ values as in the laboratory fermentor, the preceding cultivation at / A _{max can be} omitted. The relatively slow transition of these cultures to the strictly limited state required for the initiation of synchronization means significant time savings in the higher culture volume stages. However, the factor b must be redetermined at each stage. According to the control principle, this determination must, however, in principle only be carried out for a generation time. Only if there is the possibility of a change of Y _H +, which would change the biomass concentration and thus the limitation and synchronization of the culture, a review or redetermination of the factor b is required.

Claims

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Invention claims:

1. A method for the synchronization of microorganisms in continuous cultures for biotechnical conversion using growing cells, starting from a substrate-limited controlled culture of the turbidostat type, characterized in that the substratlimitierend controlled culture in portions, each at a distance of a generation time of faster growing cells, at least one limiting substrate selected from the nutrient solution is added separately from the nutrient solution, wherein the amount of the first addition of the limiting substrate is below 50%, preferably 3-15% of the nutrient amount required for unlimited growth during a total biomass generation period is that, and that in the following additions the amount is increased according to the achieved degree of synchronization so that it is in synchronized operation 40-95%, preferably 60-85% of the total biomass required amount of nutrients and da the limiting substrate is supplied in such a ratio to the biomass concentration of the culture, that the flow rate of the culture before the start of synchronization by this limitation to a value of D <^ _max, preferably between 0.05 μ / u _max and 0.2 ^ reduced becomes.

2. A method for the synchronization of microorganisms according to item 1, characterized in that in the culture used by the turbidostat type, the regulation of the growth-proportional nutrient solution supply is constructed so that the nutrient medium is added in portions in equal amounts, the number (z) of Portions which together result in a culture volume, preferably greater than 30, so that the synchronizing additions of the limiting substrate take place after a fixed number η of additions of the nutrient medium, where η takes on the value η = b · ζ · In2.

3. A method for the synchronization of microorganisms according to item 1 and 2, characterized in that upon reaching the optimum degree of synchronization of the culture, the generatons g _s of synchronous growing cells and the flow rate D _{a of} the culture are determined as an average over this generation time g _s and that the degree of synchronization achieved and the characteristic quotient b = g _s / D _a that is characteristic for this is kept constant during the further cultivation.