DD228906A1

DD228906A1 - Verfahren zur festphasen-sequenzierung von nucleinsaeurefragmenten

Info

Publication number: DD228906A1
Application number: DD26599784A
Authority: DD
Inventors: Andre Rosenthal; Hans-Dieter Hunger
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1984-08-06
Filing date: 1984-08-06
Publication date: 1985-10-23
Also published as: DD228906B1; JPS6254166A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Festphasen-Sequenzierung von Nucleinsaeurefragmenten. Sie hat die Aufgabe, ein Sequenzierungsverfahren zu entwickeln, das die gleichzeitige Sequenzierung grosser Stueckzahlen von langen und kurzen Nucleinsaeurefragmenten ermoeglicht und automatisierbar ist. Erfindungsgemaess wird ein mechanisch stabiler Flaechentraeger mit Anionenaustauscheigenschaften verwendet, an den radioaktiv markierte Nucleinsaeurefragmente immobilisiert werden. Das immobilisierte Fragment oder mehrere immobilisierte Fragmente werden gleichzeitig mit oder ohne Reagenzueberschuss chemisch modifiziert und nach Waschen einzeln mit Piperidin umgesetzt, wobei gleichzeitig die Elution der Fragmente vom Traeger erfolgt. Neben der Elution mit chemischen Mitteln wird auch die Elution mit ionischen und elektromagnetischen Mitteln verwendet. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Molekularbiologie und die Gentechnik.

Description

Verfahren zur Festphasen—Sequenzierung von Nucleinsäure— fragmenten

Anwendungsgebiet der Erfindung;

Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Sequenzanalyse von Nucleinsäurefraginenten (DIiA und ElIA) in der Molekularbiologie und Gentechnik bzw. die Sequenzanalyse von Oligodesoxy- und Oligoribonucleotiden nach chemischer Synthese dieser Abschnitte.

Charakterisierung der bekannten technischen Lösungen

Im Dez. 1983 wurde von zwei sowjetischen Autoren (S»A· Chuvpilo und V.V. Kravchenko: Bioorg. Khim .2(12) (1983) 1634-1637) erstmalig ein Pestphasenverfahren allerdings nur zur Sequenzierung langer DNA-Abschnitte und unter Nutzung eines kommerziell erhältlichen DEAE-Papieres (DS 81 der Firma Whatman) beschrieben· Es besteht aus den Schritten: 1) Immobilisierung des 5¹- oder 3*-markierten DNA-Fragmentes an den Träger; 2) Waschen; 3) chemische Modifikationsreaktionen ohne Reagenzüberschuß (d.h. nicht in einem Reaktionsgefäß) nach Maxam und Gilbert (A.M. Masam und W. Gilbert: Methods in Snzymol. 62 (1980) 499-560); 4) Waschen; 5) Piperidin-Reaktion unter Standardbedingungen (nur 20 % Verlust der radioaktiven Fragmente); 6) Waschen;

7) 2 2 Elution der Fragmente vom Träger mit 1 M NaCl bei 60⁰C;

8) Ethanol-Precipitation zur Ausfällung des Materials und 2 2: Waschen mit 90 % Ethanol.

Nachteilig in diesem Verfahren sind:

- Die sehr schlechte mechanische Stabilität des DE 81 Papieres erschwert sehr die Manipulierung mit dem Träger in wässrigen

9003-i

.Puffern (.vor allem bei höheren Temperaturen)· Ss kommt zum schnellen Zerreißen, Auflösen und Abfledern des Trägers·

- Die Verwendeten Modifikationsreaktionen führen in der A+G-, T+C— und C-' Eeaktion zu nahezu 100 % Verlusten, wenn sie in Eeaktionsgefäßen (z.B. in Eppendorf-Hütchen) mit Eeagenzüberschuß ausgeführt werden.

- Aufgrund der schlechten mechanischen Eigenschaften des DE Trägers ist die gleichzeitige· Sequenzierung großer Stückzahlen von Nucleinsäurefragmenten in einem Reaktionsgefäß nicht möglich.

- Insgesamt sind 8 Operationen nötig, wobei die Operation der Sthanol-Precipitation (Nr. 8) prinzipiell nicht für eine automatische Betriebsweise geeignet ist.

- Oligonucleotide - 8 Einheiten können nach diesem Verfahren nicht sequenziert werden, da die ersten 5^ständigen Nucleotide bei der Umfällung verloren gehen und damit die' Sequenzierungsmuster nicht vollständig gelesen werden können.

Aufgrund aller dargestellten Nachteile ist das beschriebene Verfahren erstens nicht automatisierbar und zweitens können, selbst bei manuellem Betrieb keine großen Stückzahlen gleichzeitig sequenziert werden« Kurze Nucleinsäurefragmente (DJM- und EITA-Oligomere) können nicht sequenziert werden·

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Sequenzierung großer Stückzahlen von kurzen und langen Fucleinsäurefragmenten bei gleichzeitiger Einspaarung von Zeit und Eeagenzien sowie die vollständige Automatisierung aller Operationen der Sequenzanalyse ο

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Sequenzierungsverfahren zu entwickeln, das die gleichzeitige Sequenzierung großer Stückzahlen von kurzen und langen Nucleinsäurefragmenten erlaubt und auch vollständig automatisierbar ist. Erfindungsgemäß wird das Verfahren zur Festphasen-Sequenzierung von Uucleinsäurefragmenten unter Verwendung eines mechanisch stabilen Flächenträgers mit Anionenaustauscheigenschaften durchgeführt« Die Immobilisierung des oder der markierten Fragmente an diesen Träger erfolgt in an sich bekannter Weise z«,B. durch Auftropfen oder durch Slektroelution aus Gelen (pro Fragment 4 Träger). Diese Träger werden gewaschen und anschließend

werden das immobilisierte Fragment oder mehrere immobilisierte Fragmente gleichzeitig chemisch modifiziert. Die chemischen Modifikationsreaktionen erfolgen in speziellen Reaktionsgefäßen (z. B. Eppendorf-Hütchen, Glasreaktoreh mit dosierbarem Zu- und Ablauf (Automat), Reaktorkammern für größere Flächenträger) mit Reagenzüberschuß bzw. ohne Reagenzüberschuß. Ohne Reagenzüberschuß werden die Flächenträger auf eine chemisch inerte Matrix wie Glasplatten oder Kunststoffolien aufgelegt und gerade soviel Reagenzien mit Mikropipetten auf einen Flächenträger aufgetragen, daß er nur befeuchtet ist.

Nach einem Waschprozeß werden die sortierten Fragmente einzeln mit Piperidin umgesetzt und mit chemischen, ionischen oder elektromagnetischen Mitteln eluiert.

Als mechanisch stabiler Flächenträger mit Anionenaustauscheigenschaften wird ein Flächenträger verwendet, der durch Umsetzung an sich bekannter geformter oder nicht geformter makromolekularer Massen mit Verbindungen der allgemeinen Formel I,

- R"

χ - R -

- R

2 3

in der

2 R , R

= NH₂-, OH- oder SH-Gruppierungen = Alky!gruppen mit 1-10 C-Atomen, Aromaten, photolytische Gruppen wie substituierte o-Nit.robenzy!ester bzw. substituierte Methylphenancylester oder Heterocyclen = Alky!gruppen rait 1-4 C-Atomen oder H-

Atomen

Y = Halogenide, Hydroxylgruppen

bedeuten, entsteht» Verbindungen der allgemeinen Formel I kann man gegebenenfalls intermediär erzeugen. Zur Immobilisierung werden 1 oder η 5^Γ- oder 3'-markierte lange oder kurze Nucleinsäurefragmente auf 4 oder 4 χ η einzelne mechanisch stabile Flächenträger (ca. 1 bis 2x1 bis 2 ram) mit Anionenaustauscheigenschaften aufgetragen.

in r-	L.	Ll	I	ID ED CD LJ	I
ID □ -¹			ίϋ Γ

G- A+G- T+C- G-Eeaktion ein Fragment

DG GQ

Fragmente

α α π α

Q U 9 □ D U U Q α .α U U

Oder η 5^Τ~ oder 3'-markierte lange oder kurze Hucleinsäurefragmente werden jeweils auf 4- einzelne aber geometrisch größere Flächenträger so immobilisiert, daß alle η Fragmente mit einem Sicherheitsabstand jeweils auf einem Flächenträger fixiert sind.

G- Reaktion A+G- Eeaktion Ϊ+0- Eeaktion C- Eeaktion

Alle Flächenträger müssen speziell gekennzeichnet sein. Das nachfolgende Waschen des Flächenträgers erfolgt 2 χ nacheinander in Wasser und in Ethanol, wobei sie von Salzen oder anderen Verunreinigungen befreit werden· Danach werden sie kurz an der Luft oder gegebenenfalls mit erwärmter Luft getrocknet.

Zur chemischen Modifikation wird

a) 1 Fragment auf 4· einzelnen Flächenträgern mindestens 4- verschiedenen chemischen Modifikationsreaktionen (G, A+G, T+C, G) unterworfen. Jeweils ein Flächenträger (1 bis 2 mm. χ 1 bis 2 mm) wird dazu in einem speziellen Eeaktionsgefäß z.B. Eppendorf-Hütchen, Glasreaktor mit automatischer Zu- und Ablaufregulation (Automat) plaziert. Der Flächenträger wird dann mit Beagenzüberschuß behandelt, d«h. er schwimmt im Eeaktionsmedium während der Eeaktion. Folgende Modifikationsreaktionen können verwendet werden: G-Eeaktion mit DMSj A+G—Eeaktion mit Ameisensäure, Piperidinförmiat pH 2 oder mit'Diethylpyrocarbonatj CC>C-Eeaktion mit galiumpermanganat oder"Osmiumtetros±dj C-Eeaktion mit Hydrosylamin. lach Beendigung der Eeaktion wird der Flächenträger manuell mit z.B. einer Pinzette aus dem Eeaktionsgefäß entfernt bzw. der Eeagenzüberschuß wird im automatischen System durch Ablassen entfernt.

b) η Fragmente, die auf 4· χ η I¹I äche η trägern aufgetragen (immobilisiert) sind, werden in G, A+G—, T+C- und G-Fragmen— te sortiert. Jeweils die n—G, n—A+G, n—T+C und n-G—Fragmente werden in 4 Reaktionsgefäßen nach a) gleichzeitig mit Reagenzüberschuß der jeweiligen Modifikationsreaktion unterworfen·

c) 1 Fragment auf 4 einzelnen Flächenträgern oder η Fragmente auf 4 χ η einzelnen Flächenträgern werden nicht in Reaktionsgefäßen sondern auf chemisch inerten Unterlagen wie Glasplatten oder Kunststoffolien einzeln aufgebracht und ohne Seagenzüberschuß den 4 einzelnen Modifikationsreaktionen unterworfen. Dazu werden gerade sovi-el Seagenzien mit Mikropipetten auf einen Flächenträger aufgetragen, daß er nur befeuchtet ist (für 1 bis 2 mm χ 1 bis 2 mm eines Gellulosepapieres mit Anionenaustauscheigenschaften ca» 1-5 JQl Eeagenz).

d) η Fragmente werden nicht auf 4 χ η (1 bis 2 mm ) großen

Flächenträgern aufgetragen, sondern auf 4 geometrisch größere Flächenträger derart aufgetragen, daß alle η Fragmente mit einem Sicherheitsabstand jeweils auf einem Flächenträger fixiert sind· Fach a) oder c) werden mit oder ohne Reagenzüberschuß diese Flächenträger den Modifikationsreaktionen unterworfen. Uach a) sind dabei 4 den geometrisch größeren Flächenträgern angepaßte Eeaktionskammern nötig. Nach c) sind entsprechend größere Volumina zur Befeuchtung zu wählen.

STach Beendigung der Modifikationsreaktionen werden die chemisch modifizierten Flächenträger 2 χ nacheinander mit Wasser und Ethanol sorgfältig gewaschen. Das geschieht manuell, in dem die Flächenträger mit der Pinzette in die entsprechenden Lösungsmittel getaucht, jeweils zwischen Fließpapier gelegt und durch Druck getrocknet werden. Die nach Ό) sich ergebende größere Anzahl an Flächenträgern können gemeinsam gewaschen, müssen aber danach wieder auseinander sortiert werden. In automatischen Systemen wird nach Ablassen der Modifikations-Eeagenzien die Träger in den Reaktoren mit Fritte ebenfalls durch kontinuierliche oder diskontinuierliche Zudosierung von Wasser und Ethanol gewaschen. Anschließend werden alle Flächenträger mit nur einem immobilisierten Fragment einzeln mit einer frischen 10 %igen wässrigen Piperidinlösung 15-45 &i£ "bei 90⁰G behandelt« Dabei kommt es zum DITA-Strangbruch und gleichzeitig erfolgt die Slution vom Träger. Die geometrisch größeren Flächenträger mit η immobilisierten

Fragmenten werden so zerschnitten, daß aus einem größeren Träger η einzelne Stücke entstehen. Diese werden wie oben einzeln mit Piperidin behandelt·

Zur Elution der Fragmente vom Träger werden chemische, ionische oder elektromagnetische Mittel verwendet· Zur ionischen Elution verwendet man hohe Ionenstärkan von Salzen wie (M₄)HCO₃, (HH^)₂OO₃, Et₃NHCO₃, St₃EHAc, M₄Ac, K₂HPO₄ u.a. Das erfindungsgemäße Verfahren hat folgende Vorteile:

1. Während sämtlicher Manipulationen ist eine hervorragende mechanische Stabilität gewährleistet« Diese mechanische Stabilität verbunden mit der chemischen Slution während der Piperidin-Reaktion ermöglicht die vollständige Auto— matisierbarkeit, da keine Fällungsschritte im Gesamtprozeß durchzuführen sind.

2. Die mechanische Stabilität der Flächenträger eröffnet die Möglichkeit, bei Reagenzüberschuß d.h. im Reaktionsgefäß eine große Anzahl von Nucleinsäurefragmenten gleichzeitig zu sequenzieren.

3· Aufgrund der chemischen Elution während der Piperidin-Reaktion kann eine ionische Elution vermieden werden, die Fällungsreaktionen notwendig macht und dadurch den Verlust kurzer Fragmente bewirkt. Kurze DitA/RKA-Oligomere lassen sich vorteilhaft sequenzieren.

4. Es ist sowohl die manuelle als auch die automatische Sequenzierung großer Stückzahlen von kurzen und langen ITucleinsäurefragmenten möglich.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Synthese des Anionenaustausch-Flächenträgers auf Papier— basis

Cellulose-Papier z.B. Whatman 5^0 Papier wird nach WP C08L / 262265 / 7 mit Cyanurchlorid aktiviert. Das auf diese Weise oberflächenbehandelte Papier (5 x 7 ein ) wird aus seiner verschweißten und bei -20⁰C unter ϊΤρ~ Begasung gelagerten Verpackung entnommen und in eine gläserne Reaktionskammer gelegt, in der 500 mg i-.Brom-2-aminoethan—hydrobromid in 7 ^l .acetonitril vorgelegt wurden.

Die Reaktion wird sodann unter Zugabe von 5 nil Triethylamin gestartet. Die Reaktionskammer wird mit Parafilm abgedichtet und ca. 12 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Beendigung der Reaktion wird das Papier mehrmals mit Wasser gewaschen und auf Fließpapier getrocknet.

Beispiel 2

Manuelle Sequenzierung einzelner Oligonucleotide mit Kettenlängen von 4 bis 15 Einheiten

2.1 · Radioaktive Markierung__djer_DM-Sequenz_¥en_ 10-50 pmol Oligonucleotid (oder längeres Fragment) wird am 5^f-Bnde mit ^ P-ATP und Polynucleotid-Kinase nach üblichen Methoden markiert. Nach Beendigung der Kinase-Reaktion wird das Gesamtvolumen auf ein z.B. 20% Poljacrylamid-GeI, das gegebenenfalls Harnstoff (7 M) enthält, aufgetragen und gelelektrophoretisch von ATP und anderen Verunreinigungen wie nicht erwünschten Nebenprodukten abgetrennt» Die gewünschte DHA-Bande wird durch kurze Autoradiographie auf Röntgenfilm'sichtbar gemacht und aus dem Gel herausgeschnitten. Das Gelstück wird zerkleinert und in ein Sppendorf-Hütchen überführt. Das markierte Oligonucleotid wird durch 2 χ Blution mit Wasser zwischen 37 und 60⁰C 30 min wiedergewonnen-»·

2.2. £iamobilij3ie.rung der DHA-Se quenzen auf den Flächen träger mit, Anionenaustaus^h-Sigenschaften_

1-2 ul der unter 2.1. erhaltenen wässrigen Lösung, die neben dem markierten Oligonucleotid gegebenenfalls Salze und Harnstoff enthält, werden auf mindestens 4 ca. 2 mm χ 2 mm große Stücken des Flächenträgers aufgetropft. !lach kurzer Trocknung der Papier-Stückchen bei Raumtemperatur oder mit erwärmter Luft wird die Operation des Auftropfens so lange wiederholt, bis ca. 10000 bis 50000 cpm pro Flächenträger an einem Scintillationsmeßgerät gemessen -werden· Die Papiere werden dann mit einer Pinzette 2 χ nacheinan—· der in Wasser und Ethanol gewaschen (ca. 1 min), nach jeder Waschoperation zwischen Fließpapier kurz mittels Druck getrocknet.

2.3· Chemische Modifikationsreaktionen für die Oligomicleotide d(TCTA), d(TGTAGA), d(GTGAAUÜGAG), dOTTGTTGTACAGAGGG) und d(TGATGAGATGGGTTT) mit Reagenzüberschuß im Reaktionsgef äß ._

Die nach 2.2. von jedem Oligonucleotid erhaltenden 4 Papierstückchen mit immobilisiertem markierten Fragment werden jeweils einzeln in ein Eppendorf-Hütchen plaziert. Die Eppendorf-Hütchen sind entsprechend der verwendeten Modifikationsreaktion gekennzeichnet. Insgesamt liegen nunmehr von den 5 Oligonucleotiden 5 %. 4 = 20 Eppendorf-Hütchen vor. folgende Reagenzien werden zupipetiert:

G-Reaktion - 200 /ul Kakodylat-Puffer pH 8 oder 200 pl

Ammoniumformiat-Puffer pH 3»5 - 1 bis 2 pi DBIS

A+G-Heaktion - 80 nl 88% Ameisensäure

—4 T G-Reaktion - 80 ul einer 10 M KMnO,.-Lösung, die

—2

kurz zuvor aus einer 10 ffl Stammlösung

hergestellt wurde

G-Eeaktion - 40 pl einer 4 M Hydroxylamin Lösung pH S,

die aus Hydroixylsjnin-hydrochlorid mittels Triethylamin hergestellt wurde.

Die Reaktionszeiten betragen für die G— 10 min und für alle anderen Reaktionen 20 min. Außer den erwähnten Reaktionen können auch die T>G-Eeaktion mit Osmiumtetroxid (80 pl einer 5 ^ OsO^-Lösung + 1 /ul Pyridin, 15 ^ii^ bei O⁰G), die A+G-Reaktion mit Piperidinformiat (80^uI Piperidinformiat pH 2, 1h bei 37⁰G) oder Diethylpyrocarbonat (150 yul A-Puffer (50 mM liatriumacetat pH 5 + 1 mM EDTA) + 5 bis 10yul einer frisch hergestellten 10 % DEPG-Lösung in Ethanol, 20 min bei 90⁰G). Die T+G- und G-Seaktionen mit Hydrazin nach Maxam und Gilbert bzw. die AXJ-Reaktion mit 1,2 M NaOH Lösung führen zum vollständigen Verlust der Radioaktivität und können deshalb nicht verwendet werden. Während der o.g. Modifikationsreaktionen treten folgende Verluste auf: 20 % in der G- , 50 % in der A+G- , 0 % in der T G- und 5O-8O % in der G-Eeaktion. Diese werden durch doppelte oder vierfache Radioaktivität in der A+G- bzw. in der G-Reaktion ausgeglichen werden.

Die Modifikationsreaktionen werden dadurch beendet, daß mit Hilfe einer Pinzette die Papiere aus den Seaktionsge— fäßen entfernt und nacheinander 2 χ mit Wasser und Ethanol gewaschen werden.

2ο4. Piperidin-Reakjfci^n_zur_l^z^U£ung^de_s_DNA-Sjbran_igbruches_ E¹²Q S)¹S. £l£i^tLzeitj.ge_n_Elutiori__der Fragmente^ vom Träger__

Die 20 Papier-Träger werden einzeln in 20 neue Sppendorf-Hütchen plaziert. Nach Zugabe von 50 /ul einer 10 % wässrigen Piperidin-Lösung werden sie 30 min bei 90 ⁰C thermostatiert. Fach Beendigung der Reaktion werden die Papiere mit einer Pinzette aus den Sppendorf-Hütchen entfernt, die Lösungen

1 min bei -200^CC z.B. in flüssiger Luft aufbewahrt und i,V. lyophilisiert (ca. 1h)» Der Lyophilisationsschritt wird

2 χ mit 10 bis 20/al Wasser wiederholt (ca. jeweils 30 min). Die Proben sind dann fertig zum Auftragen auf die Gelelektrophorese.

Beispiele der Autoradiogramme für die o.g. Oligonucleotide:

12 3 4

12 3 4 2 2a 3 4

Ga

c τ

τ r^

12 3 4 5

c ^Λ

υψ

A^A

G « T

Beispiel 3

Manuelle gljsichzej.ti.ge Sequenzierung von ^ligo_2iuc_lejOt_iid_ien_mit__Se_i ^aS^eS^zii^^:ci faß

Markierung und Immobilisierung von 5 Pentadecanucleotiden d(TTGTTCTAGAGAOCC), d(TGATCAGATGGCTTT), d(CTCGTGGGCATTCCT) d(GGGTACCCAGAAGTG) und d(TCGCTGAGATCAGCA) erfolgt wie unter Beispiel 2 (2.1. und 2,2.) beschrieben. Die chemischen Modifikationsreaktionen werden nunmehr nur in 4 Eppendorf-Hütchen durchgeführt, wobei in jedem jeweils 5 Papier-Träger enthalten sind. Die Seaktionsbedingungen und die nachfolgenden Waschoperationen sind wie in 2·3· Nach Waschung und Trocknung der Papiere werden die vorher gekennzeichneten Träger wieder auseinander sortiert, so daß jeweils wieder 4 einzelne Papiere pro Oligonucleotid vorliegen und für die nachfolgende Piperidin-Reaktion jeweils einzeln in ein Bppendorf-Hütchen plaziert werden können. Die Piperidin— !Reaktion erfolgte analog Beispiel 2 (2.4.).

Beispiele der Autoradiogramme für die o.g. Oligonucleotide

.1 2 3

G ^Z ^G* AG

_C -»c -- gC

^T — ^c * - _e ^G

A — ^ — G

Beispiel 4

Ma2uelle__§le_ichz^iti£e_Se_quenzi.erung_großer Stückzahlen von ^lJ.^nucj.e^tj.d^i^mit^Seagenzüb^rschTiß jLn_Heaktionsj2;e— fäßen

Die Markierung der 5 Pentadecanucleotide von Beispiel 3 erfolgt wie "unter 2.1. "beschrieben. Die Immobilisierung der Fragmente erfolgt diesmal nicht auf 4 χ η (η = 5) also 20 ( 2 mm χ 2 mm) großen Stücken des Flächenträgers, sondern auf 4 ( 2 mm χ 20 mm) großen Stücken dadurch, daß ca. 1-2 pl jedes Oligonucleotides auf eine Fläche von 2 mm χ 2 mm aufgetropft und insgesamt alle 5 Oligonucleotide auf den Gesamt-Flächenträger aufgebracht werdenο Die 4 größeren Flächenträger werden in größeren Reaktionsgefäßen (entsprechend der Größe der Flächenträger) den bereits beschriebenen Modifikationsreaktionen unterworfen. Nach Waschen und Trocknung der Träger werden die 4 (2 mm χ 20 mm) großen Flächenträger mit Hilfe einer Schere in jeweils 5 kleinere (2 mm χ 2 mm) große Papierstücken zerschnitten und für die Piperidin-Reaktion in insgesamt 20 Bppendorf— Hütchen einzeln plaziert· Piperidin-Heaktion und Lyophilisierung erfolgt wie bereits beschrieben.

Beispiel 5

Ma^uelle_S_equenzierung_von__langen pJtfA-Seauenzen mit Rea-_ genzüberSchuß, in Eeakti_onsgef äßen__

Lange DNA-Sequenzen werden völlig analog,wie in den Beispielen 2, 3 und 4- beschrieben, sequenziert· Einzig die fieaktionszeiten der unter Beispiel 2 (2·3·) aufgelisteten Modifikationsreaktionen müssen auf folgende Werte verkürzt werden: G— 3 bis 5 %£·& und alle anderen Reaktionen 10 min· Die Verluste an Radioaktivität sind bei den langen DUA-Fragmenten während der Modifikationsreaktionen wesentlich geringer.

Beispiel 6

Manuelle Sequenzierung von DHA-Sequenzen ohne Reage_nz-__ Überschuß

Markierung und Immobilisierung der DHA-Sequenzen erfolgt analog Beispiel 2 (2.1. und 2.2.) und 4. Die Flächenträ-

ger werden nunmehr niciit in Eeaktionsgefäßen wie JSppendorf-Hütchen sondern auf eine ebene, mit einer Plastikfolie bedeckten Unterlage plaziert und mit nur soviel Volumina der Modifikations-Eeagenzien (siehe 2·3·) versetzt, daß sie gerade durchfeuchtet sind. In der Segel betrageti die Volumina für 2 mm χ 2 mm große Papiere ca· 1—3/al· Werden größere Flächenträger z.B„ 2 mm χ 2Q mm verwendet, muß das Volumen der Eeagenzien etwas erhöht werden. Alle anderen Operationen wie Dauer der Modifikationsreaktionen, Waschen und Piperidin—Eeaktion worden,wie bereits beschrieben, durchgeführt·

Beispiel 7

Automati^che__Durciiführung de_s Verfahrens^

Sin DM/SNA-Sequenzierungsautomat ist wie folgt aufgebaut« Im einfachsten Fall zur Sequenzierung nur eines Uucleinsäurefragmentes werden 4- mit einer Fritte ausgerüstete, thermostatierbare Eeaktoren mit einem Fassungsvolumen von maximal 250 pl mit dosierbarem Zu- und Ablauf parallel angeordnet· Die 4 einzelnen Flächenträger (2 mm χ 2 mm) mit den immobilisierten markierten Nucleinsäurefragmenten werden in die Eeaktoren plaziert· Fun erfolgt nach einem vorgegebenen Programm der automatische Ablauf der Operationen: 1) Waschen; 2) Chemische Modifikationsreaktionen; 3) Waschen; 4) Piperidin—Eeaktion (Elution)· Dazu werden die'individuellen Eeagenzien nach Beispiel 2 (2·3·) über Dosierpumpen hinzugegeben und verbleiben für die festgelegte Zeit bei geschlossenem Ablaufventil im Eeaktor« !fach Beendigung der Eeaktionen werden die Ventile der Seaktoren geöffnet und die Eeagenzien fließen gegebenenfalls unter leichtem Luftdruck ab· Alle Waschschritte mit Wasser und Ethanol können kontinuierlich, (bei geöffnetem Ablaufventil werden in die Eeaktoren abwechselnd o.g· Lösungsmittel geleitet) oder diskontinuierlich erfolgen (100 pl Volumina o.g· Lösungsmittel werden bei geschlossenem Ablaufventil in den Eeaktor geleitet und verbleiben dort für kurze' Zeit, bevor sie wieder abgelassen werden). Bei diskontinuierlichem Waschen bzw. am Ende des kontinuierlichen Waschprozeßes können die Träger gegebenenfalls für wenige Sekunden mit erwärmter Luft

getrocknet werden. Zur Durchführung der Piperidin—Seale tion wird ca. 25-5O /^l 10 % wässrige Piperidin-Lösucg in die 4 Reaktoren gepumpt (bei geschlossenem Ablaufventil) und der (die) Reaktoren auf 90°G für 30 min erwärmt. I-Tach Öffnen der Ablaufventile werden die Piperinvoluraina unter leichtem Luftdruck in 4 einzelne Zippendorf-Hütchen geblasen, die über Teflonschläuche (0 o,4 - 1 mm) mit den Reaktoren verbunden sind. Die 4 Eppendorf-Hütchen mit den eluierten Fragmenten werden entweder direkt im Atomat innerhalb einer speziellen Vakuumkammer lyophilisiert oder die Lyophilisation wird außerhalb des Systems vorgenommen. Im ersten Fall wird nach der ersten Lyophilisation die Prozedur mit jeweils 10 bis 20 yul Wasser, die automatisch zugeführt werden, wiederholt (2 bis 3 mal). Die Gesamtzeit des Operationszyklus beträgt ca. 2,5 h. Im zweiten Fall mit manueller Lyophilisation betragt die Gesamtzeit ca. 20-30 min. Die Proben sind dann fertig für die Gelelektrophorese. Im komplizierteren Fall zur Sequenzierung großer Anzahlen von DUA-Fragmenten müssen die 4 Reaktoren räumlich andere Ausmaße besitzen. Die Grundfläche eines Reaktors beträgt bei 8—15 zu sequenzierenden Fragmenten ca. 0,5 cm χ δ cm. Die 4 (0,4 cm 2 5i5 cm) großen Flächenträger mit aufgetragenen 8-15 Fragmenten werden wiederum in die Reaktoren plaziert und die Operationen 1) und 2) selbstverständlich mit größeren Volumina an Reagenzien durchgeführt. Nach Ablassen der Reagenzien der Modifikationsreaktionen schließt sich ein Waschen (0peration3)) an. Danach werden die getrockneten Flächenträger automatisch durch ein bestimmtes zu realisierendes technisches Prinzip in die einzelnen, kleineren Stücken zerschnitten und dabei gleichzeitig jeweils in unterschiedliche Piperin-Reaktoren mit Fritte und Ablaufventil (ca. 50 Reaktoren) plaziert. Am besten gelingt das durch die Konstruktuion von 4 beweglichen Modifikations-Reaktoren, die sich nach Operation 3) um 180 senken und sich dann am Reaktordeckel öffnen. Die Flächenträger werden dabei in 4 bewegliche (vertikale Verschiebung) Schneidevorrichtungen gebracht. Durch Abschneiden kleiner Stücke von den Flächenträgern in den 4 vertikal verschiebaren Schneidevorrichtungen werden die 4 χ 8 bis I5 = 32 bis 45 Piperidin-Reaktoren

gezielt mit nur einem Fragment "beschickt· Die Piperidin-Reaktionen laufen analog, wie bereits beschrieben, ab. !lach Beendigung der Reaktion werden die Piperidin-Lösungen mit den eluierten Fragmenten durch leichten Luftdruck in die mit den Beaktoren über Teflon-Schläuche verbundenen Eppendorf-Hütchen (ca. 50 Stück) überführt und anschließend lyophilisierto

Beispiel 8

Sequenzierung mittels Yerw^ndung^hoher^I^ne^nstärken zur Slution der llu£le_insäurefragmente vom Sräger^

Bei Verwendung des beschriebenen Flächenträgers kann die Elution der Fragmente vor der Piperidin-Eeaktion auch mit 1 bis 2 M Lösungen der Salze von 1IH^HCO₃, (HH^)₂OO,, HELAc, StoMilc u*a. erfolgen· Die Slution wird dadurch erreicht, daß die Flächenträger einzeln in Eeaktionsgefäßen wie Sppendorf-Hütchen 2 χ mit 50 /til o.g· Salzlösungen bei 60⁰C versetzt werden. Bei Oligonucleotiden werden die Sluate lyophilisiert, wobei sich die Salze bei wiederholter Lyophilisation mit wässrigem Ethanol verflüchtigen lassen. Bei langen DM-Fragmenten kann man die Salze auch mittels Sthanol-Precipitation entfernen« Danach erfolgt dann die übliche Piperidin-Reaktion in homogener Phase.

Claims

Erfindungsanspruch

1 2 °i

E , B , Ir Alkylgruppen mit 1-4 C-Atomen oder H-Atomen

Y Halogenide oder Hydroxyl-Gruppen sind.

1. Verfahren zur Festphasen—Sequenzierung von NucleInsäure— fragmenten, dadurch gekennzeichnet, daß ein mechanisch stabiler Flächenträger mit Anionenaustausch—Eigenschaften verwendet wird, die Immobilisierung der Fragmente an diesen Trägern In an sich bekannter Weise erfolgt, anschließend das immobilisierte Fragment oder mehrere immobilisierte Fragmente gleichzeitig gegebenenfalls mit Eeagenzüberschuß chemisch modifiziert werden, nach Waschen die sortierten Sucleinsäurefragmente einzeln mit Piperidin umgesetzt werden und die Slution mit chemischen, ionischen oder elektromagnetischen Mitteln erfolgt.

2. Verfahren zur Festphasen-Sequenzierung von Bucleinsäurefragmenten nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein mechanisch, stabiler Flächenträger mit Anionenaustausch—Eigenschaften verwendet wird, der durch Umsetzung geformter oder nicht geformter makromolekularer Massen, die

- aus einer makromolekularen Verbindung in einer Konzentration von 5-80 Vol%

- aus einer makromolekularen Verbindung mit 4-,6—Dihalogen-1,3 >5-triazin-Gruppierungen in einer Konzentration von 1-80 Vol%

- aus 2,4-,6-Trihalogen-1,3>5-triazin in einer Konzentration von 0,5-50 Vol%

- aus Halogeniden in einer Konzentration bis zu 20 Vo1% gegebenenfalls aus puffernden Substanzen bis zu 5 VoUS

- und gegebenenfalls aus einem flüssigen Dispersionsmittel bestehen,

mit Verbindungen der allgemeinen Formel I erhalten wird, wobei

X-E-N-E²

^X ^2-, OH- oder SH-Gruppierungen H Alkylgruppen mit 1-10 G-Atomen, Aromaten,

photοIytisehe Gruppen wie substituierte o-Hitrobenzylester oder Methylphenancyl-

ester sowie Heterocyclen

3· Verfahren zur Festphasen-Sequenzierung von Nucieinsäurefragmenten nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Immobilisierung von η Fragmenten auf mindestens 4 χ η einzelnen Stücken des Flächenträgers erfolgt.

4· Verfahren zur Festphasen—Sequenzierung von iiucleinsäurefragmenten nach Punkt 1, gekennzeichnet- dadurch, daß die Immobilisierung von η Fragmenten auf mindestens 4 geometrisch größeren Flächenträgern erfolgt, wobei auf jedem einzelnen Flächenträger η Fragmente aufgetragen werden, und daß nach den Modifikationsreaktionen und den Waschoperationen jeder einzelne der 4 Flächenträger in η einzelne Stücke zerschnitten und für die Piperidin-Beaktionen sortiert werden·

5· Verfahren zur Festphasen-Sequenzierung von JSucleinsäurefragmenten nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß zur Elution chemische Mittel wie primäre, sekundäre oder tertiäre Amine insbesondere z.B. wässrige Piperidin- oder wässrige Anilinlösungen verwendet werden·

6. Verfahren zur Festphasen-Sequenzierung von Fucleinsäurefragmenten nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß zur Elution hohe Ionenstärken von Salzen wie z»B. HSJSCO^, (UEy₂OOo, Et₃MHCO₃, St₃HHAc, ITH₄Ac, K₂HPO₄, NaCl u.a. gegebenenfalls bei höheren Temperaturen verwendet werden.