DD231255A3 - Analytisches element zur bestimmung von harnsaeure in koerperfluessigkeiten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein analytisches Element zur Bestimmung des Harnsaeuregehaltes in Koerperfluessigkeiten. Ziel ist es, durch geeigneten Aufbau als Schnelldiagnostikum die Gesamtanalysenzeit zu verkuerzen bzw. eine Anwendung durch Nichtfachleute zu ermoeglichen. Die Herstellung des analytischen Elementes soll oekonomisch vertretbar sein. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass die spezifische enzymatische Nachweisreaktion fuer Harnsaeure mit nachfolgenden Indikatorreaktionen in einem trockenchemischen Testsystem vereinheitlicht wird und die Bestimmungsreaktion auf Testfeldern mit unterschiedlicher Sensitivitaet ablaeuft, wodurch Konzentrationsunterschiede zwischen normalem und pathologisch erhoehtem Harnsaeurespiegel durch Ansprechen unterschiedlicher Testfelder bzw. das Auftreten von unterschiedlich gefaerbten Endprodukten erkannt werden koennen. Als Indikatorreaktion werden oxidative Kupplungsreaktion mit differenziertem Reaktionsvermoegen verwendet. Das analytische Element kann in medizinischen Einrichtungen angewendet werden, die sich mit der Kontrolle von Risikofaktoren im Rahmen der Gesundheitsueberwachung der gesamten Bevoelkerung befassen.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein analytisches Element zur Bestimmung der Harnsäurekonzentration in Körperflüssigkeiten, vorzugsweise in Blut und Serum.

Anwendungsgebiet für das erfindungsgemäße analytische Element ist die klinisch-chemische Diagnostik in Einrichtungen des Gesundheitswesens, die sich mit der Gesundheitsüberwachung und der Kontrolle von Risikofaktoren befassen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Harnsäure ist das Endprodukt des Purinstoffwechsels im menschlichen Organismus. Es liegt deshalb in den Körperflüssigkeiten eine bestimmte Harnsäurekonzentration vor, die im Blut bei Frauen 0,14-0,34mMol/l und bei Männern 0,2-0,42 mMol/l beträgt. Beim gesunden Menschen hat die Aufnahme von purinhaltiger Nahrung keinen Einfluß auf diesen . physiologischen Harnsäurespiegel. Bei bestimmten Krankheitsbildern wie Nierenversagen, Leukämie, Lungenentzündung bzw. Gicht tritt eine Erhöhung der Harnsäurekonzentration auf. Ein Serumharnsäuretest ist deshalb ein geeignetes Hilfsmittel zur Diagnose und dient weiter zur Differenzierung von ähnlichen pathologischen Zuständen wie z. B. Gicht und Arthritis, wobei nur die Gicht durch eine abnormale Zunahme der Harnsäure gekennzeichnet ist. Die Prävalenz der sekundären Gicht ist steigend und betrifft bereits 1-2% der Bevölkerung, mit deutlicher Bevorzugung der älteren Menschen. Außerdem besteht neben dem Einfluß anderer Risikofaktoren ein enger Zusammenhang zwischen erhöhtem Harnsäurespiegel und Bluthochdruck, Arteriosklerose bzw. cerebralen Gefäßschäden. Die Hauptursache für eine Hyperuricämie sind Ernährungsgewohnheiten der Betroffenen. Eine frühzeitige und oft wiederholte Kontrolle des Blut-Harnsäurespiegels und daraus abgeleitete Einflußnahme auf das Ernährungsregime gehören deshalb zur allgemeinärztlichen Betreuung.

Es sind eine Reihe von Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure im Blutserum bekannt, die im wesentlichen auf zwei Methoden beruhen:

a) Reaktionen, die auf der reduzierenden Wirkung der Harnsäure beruhen. Die Auswertung erfolgt entweder durch kolorimetrische Messung eines gefärbten Reduktionsproduktes oder durch inverse Kolorimetrie, wobei die Abnahme der Farbintensität eines gefärbten Indikators durch die Reduktion photometrisch verfolgt wird. Die Ergebnisse derartiger Reaktionen werden jedoch durch alle im Blut auftretenden Substanzen mit reduzierenden Eigenschaften störend beeinflußt. Lit. Haury, H. et al. Med. Klin. 61 [1966] 670 Sobrinho-Simoes, M. und M. J.Pereira J.Lab.Clin.Med.65 [1965] 665)

b) Enzymatische Umsetzung der Harnsäure durch Uricase und Auswertung der Reaktion entweder durch spektrophotometrische Messung der Abnahme der Harnsäurekonzentration oder durch Bestimmung des bei der enzymatischen Reaktion gebildeten Wasserstoffperoxids in einer anschließenden Indikatorreaktion. Dazu wird das H2O2 in einer durch Peroxidase katalysierten Reaktion auf einen Farbbildner übertragen, dessen Konzentration photometrisch gemessen wird. Es werden aber auch Verfahren zur Bestimmung des H₂O₂ angewendet, wobei dieses mittels Katalase Methanol zu Formaldehyd umwandelt, der dann in einer weiteren Reaktion mit Diacetylderivaten zu einem Farbprodukt reagiert.

(Lit. Bongaerts, G.P.A. und G. D.Vogels, Biochim. Biophys.Acta 567 [1979] 295 Kageyama, N., C!in.chim.acta31 [1971] 421

Haeckel, R., J.CIin.Chem.Clin.Biochem.14[1976] 101

Gochman, N. und J.M.Schmitz, Cün.Chem. 17 [1971] 1154

US-PS Nr.3862885

US-PS Nr.3349006)

Trotz zahlreicher Varianten dieser beschriebenen Methoden haben alle Verfahren den Nachteil, daß eine Reihe von separaten Reaktionsschritten in verschiedenen Reaktionsgefäßen durchgeführt und die Proben zur Messung in Photometerküvetten übergeführt werden müssen. Wegen des hohen Arbeitsaufwandes bei derartigen naß-chemischen Bestimmungsgemethoden setzen sich international in der klinisch-chemischen Analytik für große Serien immer mehr „Trocken-chemische Tests" durch, bei denen die gesamte Reaktion auf einem Träger durchgeführt wird, der in einem Bindemittel alle benötigten Reagenzien in stabilisierter Form enthält und die Reaktion durch Aufbringen eines Tropfens des Prüfgutes ausgelöst wird. Die Ausertung erfolgt durch visuellen Farbvergleich mit einer Farbskala oder durch Photometer. Allerdings ist es bisher noch nicht gelungen, die Testmittel zur Bestimmung der Harnsäure im Blut oder Serum so zu einem analytischen Element zu vereinheitlichen, daß alle Anforderungen der Praxis wie spezifische Reaktion, Stabilität der Reagenzien, Erfassung des physiologischen und pathologischen Kontentrationsbereiches und Bildung eines stabilen Farbproduktes erfüllt werden.

Es wurde nicht als möglich angesehen, die gekoppelte enzymatische Reaktion unter gleichzeitiger Anwesenheit von Uricase und Peroxidase in einem Reaktionsmilieu durchzuführen, da die beiden Enzyme unterschiedliche pH-Optima aufweisen und außerdem eine Kompetition zwischen Harnsäure und der Farbstoffvorstufe entstehen kann, da beide durch H₂O₂ oxidiert werden

rönnen. So werden analytische Elemente beschrieben, die aus zwei Reagenzträgem in Form von getränkten Papieren bestehen, iie zusammengeklebt werden oder während der Nachweis-Reaktion in Kontaktgebrachtwerden müssen. Derartige analytische Elemente weisen ein kompliziertes Herstellungs- oder Anwendungsverfahren auf. JP-OS Nr.9096-789, DE-OS 2855433, DE-PS 2711201)

:s sind auch eine Reihe von einfacheren analytischen Elementen beschrieben, doch diese beruhen auf der unter a) >eschriebenen unspezifischen reduzierenden Wirkung der Harnsäure

US-PS Nr.3.536.488, DE-OS 2.550.634; DD-AP 139030, DE-PS 2744046)

Soll ein analytisches Verfahren durch Anwendung eines analytischen Elementes auf der Basis von „Trocken-chemischen "estsystemen" rationalisiert werden, so ist es außerdem erforderlich, daß das analytische Element so aufgebaut ist, daß die 3estimmungsreaktion—obwohl sie bei Zimmertemperatur abläuft — zu einer ausreichend erkennbaren Konzentration an jefärbten Endprodukt abläuft. Es sind für naß-chemische Bestimmungsverfahren der Harnsäure eine Reihe von Farbbildnern jeschrieben worden, deren Farbdichte aber unter den Reaktionsbedingungen des analytischen Elementes nicht zur )ifferenzierung der vergleichsweisen geringen Harnsäurekonzentration im Blut ausreichen. Bei naß-chemischen Methoden >ehebt man diesen Nachteil, indem die Schichtdicke der Photometerküvette erhöht wird, wodurch sich die effektive Dichte des irzeugten Farbstoffes erhöht. Die Erhöhung der Schichtdicke des analytischen Elementes ist für den vorgesehenen ^nwendungszweck unzweckmäßig, da sich dadurch z. B. die Reaktionszeit verlängert oder die benötigte Blutmenge vergrößert verden muß.

üel der Erfindung

)as Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines mit ökonomisch vertretbarem Aufwand herstellbaren stabilen analytischen ilementes, daß durch seinen Aufbau die spezifische Bestimmung von Harnsäurekonzentrationen im Blut oder Serum ationalisiert, wobei die Auswertung im zeitlichen Abstand zur Anwendung stattfinden kann. Die Anwendung soll so einfach ein, daß es auch von Nichtfachleuten angewendet werden kann, so daß sich das Anwendungsspektrum erweitert, indem es licht nur im klinischen Labor, sondern auch von unterwiesenen Patienten zu Hause verwendet werden kann, wodurch sich die läufigkeit der Artzkonsultationen bzw. die Belastung der klinisch-chemischen Labore stark reduziert.

larlegung des Wesens der Erfindung

)er Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein analytisches Element zur Bestimmung von Harnsäure im Blut oder Serum zu chaffen.

)ie erfindungsgemäße Lösung der Aufgabe erfolgt durch Entwicklung eines trockenen Reagenzträgers in Form eines nalytsichen Elementes, das die Bestimmung der Harnsäure im physiologischen und pathologischen Konzentrationsbereich urch Durchlicht- oder Auflichtauswertung von Farbstoffkonzentrationen ermöglicht, die unter Verwendung der bekannten aß-chemischen gekoppelten Reaktion von Uricase und Peroxidase und einem oxidierbaren Phenylendiaminderivat bei mwesenheit von Harnsäure im Prüfgut in stöchiometrischer Reaktion entstehen.

>as erfindungsgemäße analytische Element ist dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens zwei Testfelder aufweist, die bei 'erwendung von Gelatine als Bindemittel—gegebenenfalls mit einem gefärbten Träger—auf einer ebenen Unterlage so fixiert ind, daß eine Durchlicht- und/oder Auf lichtauswertung möglich ist. Im Falle der Verwendung von Cellulosevlies oder Papier als indemittel sind die Testfelder auf einer ebenen Unterlage so fixiert, daß eine Auflichtauswertung möglich ist. Weiterhin ist die rfindung dadurch gekennzeichnet, daß die Testfelder eine unterschiedliche Sensitivität besitzen, wobei die Testfelder hoher ensitivität eine kuppelnde Verbindung der allgemeinen Formel I und die Felder geringer Sensitivität kuppelnde Verbindungen er allgemeinen Formel Il oder III enthalten. Der pH-Wert ist in allen Testfeldern mit an sich bekannten Puffern auf 8,5-10 ingestellt. Die Testfelder mit Gelatine als Bindemittel und einem Träger bestehen erfindungsgemäß aus einer oder mehreren chichten, wobei in den mehrschichtigen Testfeldern Enzymkonzentrationsgradienten vorhanden sind. Die Enzymkonzentration immt in den Schichten von oben zum Träger hin zu. Das analytische Element enthält als Bindemittel für die Nachweis- und idikationsreagenzien Gelatine, Cellulosevlies oder Papier. Bei Verwendung dieser Bindemittel besteht die Möglichkeit, ihre hysikalischen Eigenschaften wie Quellfähigkeit oder Naßfestigkeit durch bekannte Methoden so zu modifizieren, daß die .ufnahme eines definierten Volumens an aufgetropftem Prüfgut gestatten, wodurch ein exaktes Abmessen des rüfgutvolumens durch den Anwender entfällt. Zusätzlich haben diese Bindemittel die Eigenschaft, die Stabilität von Enzymen j erhöhen, wodurch Enzyme in einem Reaktionsmilieu in derartigen Bindemittel eingebracht werden können, die in flüssiger hase in Inaktivierung dieser Biokatalysatoren bewirken können. Außerdem besitzen Enzyme in derartigen Bindemitteln eine ute Lagerstabilität. Die aus der Photofilmtechnik bekannte gute Lichtdurchlässigkeit von Gelatineschichten ermöglicht es, eagenzträger für chemische Nachweisreaktionen, die Gelatine als Bindemittel enthalten, nach einer Reaktion, die zu einem arbprodukt geführt hat, in einem Photometer quantitativ mittels Durchlichtmessung auszuwerten, wodurch die Genauigkeit es Testes erhöht wird. Reagenzgläser mit Papiervliesen als Bindemittel können nach der Reaktion durch visuellen Farbvergleich lit einer vorgegebenen Farbskala oder durch Reflexionsmessung mit einem speziellen Reflektometer ausgewertet werden, ie genannten Bindemittel besitzen außerdem gute lösungsvermittelnde Eigenschaften, so daß darin auch relativ :hwerlösliche Verbindungen eingebracht werden können. Das ist z. B. für die Einbringung der Indikationsreagentien von edeutung,da dadurch die Palette der verwendbaren farbgebenden Substanzen wesentlich erweitert wird, as analytische Element kann nach bekannten Technologien hergestellt werden, in dem entweder geeignete Filterpapiere mit er Reagenzlösung getränkt werden oder die Gelatine-Reagentiensuspension auf einen inerten Träger, vorteilhafterweise auf bliche Acetatfolie vergossen wird.

Zur Erzielung bestimmter Farben beim Reaktionsendprodukt kann als Reagenzträger eine eingefärbte Filmacetatfolie verwendet werden. So kann mit einer Grün-Folie und einem gelben Farbprodukt ein blauer Farbeindruck erzielt werden. Die getränkten Filterpapiere bzw. die Filmbahnen werden in ca. 0,25cm² große rechteckige Testfelder zerteilt und auf eine Unterlage, wie Plastfolie oder Papier geeigneter Stabilität in bekannter Weise befestigt.

Das analytische Element enthält mindestens 2 Testfelder, die auf der Unterlage so fixiert sind, daß bei Verwendung von transparenten Filmreagenzträgern sowohl eine Durchlicht- als auch Auflichtauswertung in Photometern oder Reflektometern möglich ist. Auflichtauswertung ist mit analytischen Elementen möglich, wenn entwederfürdieFilmtestfeldereinetransparente Unterlage z. B. Plastfolie verwendet wird oder die Testfelder auf den Rändern entsprechender Öffnungen in der nichttransparenten Unterlage fixiert werden (s. Abbildung). Die Auflichtauswertung kann bei tranparenten Testfeldern erfolgen, wenn das analytische Element gegen einen weißen Hintergrund gehalten wird. Im Falle der Verwendung von Cellulosevliesen oder Papieren als Reagenzträger ist nur eine reflektometrische oder visuelle Auswertung durch Farbvergleich möglich. Die Testfelder werden durch Verschieben in einem geeigneten Küvettenadapter nacheinander in den Strahlengang der Auswertegeräte gebracht

Dem Reaktionsablauf bei der Harnsäurebestimmung mit dem analytischen Element liegen folgende Reaktionen zugrunde:

Uricase

a) Harnsäure + O₂ + 2H₂G ~ } Allantion + H₀O₃ + CO₂

Peroxidase

b) H^O₂ + DH₂ -~-f D + 2H₂O

Chromogen Farbstoff

Wegen der geringen Mengen an nachzuweisender Harnsäure im Blut oder Serum bzw. der diagnostischen Bedeutung von geringfügigen Änderungen des Harnsäurespiegels ist es vorteilhaft für die Anwendung des analytischen Elementes als Indikatoren Farbbildner einzusetzen, deren Oxidationsproduktesich durch einen hohen molaren Extinktionskoeffizienten bei einer durch das menschliche Auge gut differenzierenden Wellenlänge auszeichnen. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß diese Anforderung durch Verwendung von Kupplungsfarbstoffen im analytischen Element erfüllt werden, vor allem auch dadurch, daß durch diese Verbindungen für ein- und dieselbe Bestimmungsreaktion unter identischen Reaktionsbedingungen verschieden gefärbte Endprodukte mit stark differenzierter Sensitivität erzeugt werden können.

Die Eigenschaft des erfindungsgemäßen analytischen Elementes, daß unterschiedliche Harnsäurekonzentrationen im Prüfgut durch das Ansprechen unterschiedlicher Testfelder bzw. durch das Entstehen unterschiedlich gefärbter Endprodukte angezeigt werden, erleichtert die Auswertung der Analysen ganz erheblich.

Dadurch ist es z. B. Patienten, die eine Selbstkontrolle durchführen, leichter möglich, eine pathologisch erhöhte Konzentration von der physiologischen Konzentration zu unterscheiden. Die unterschiedliche Sensitivität der Testfelder wird erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß sich die Testfelder in der Konzentration der Enzyme unterscheiden, als auch farbbildende Substanzen mit unterschiedlicher Reaktivität als Indikatoren zur Anwendung kommen. In einem Testfeld sind die Reagenzien so abgestimmt, daß nur bei Normalwerten der Harnsäurekonzentration eine Reaktion eintritt. Dadurch ist gleichzeitig eine Kontrolle der sachgemäßen Anwendung analytischen Elementes gewährleistet. Auf den weiteren Testfeldern werden erhöhte bzw. stark erhöhte Harnsäurekonzentrationen angezeigt.

Vorteiihafterweise ist das Farbstoffendprodukt der Harnsäurebestimmungsreaktion mit dem erfindungsgemäßen analytischen Element ein stabiles Kupplungsprodukt, so daß die Auswertung der Reaktion im zeitlichen Abstand zur Anwendung durchgeführt werden kann. Das trägt wesentlich zur Rationalisierung der Arbeitsabläufe im klinisch-chemischen Labor bei. Außerdem können dadurch auch Teste, die Patienten über einen längeren Zeitraum zu Hause selbst durchgeführt haben, durch den betreuenden Arzt bei einer Konsultation kontrolliert werden.

Erfindungsgemäß wird dieses stabile Farbstoffendprodukt dadurch erreicht, daß zusätzlich zu der üblichen Indikatorreaktion, die in einer durch Peroxidase katalysierten Oxidation eines Chromogens durch das gebildete H2O2 besteht, im analytischen Element kuppelnde Verbindungen enthalten sind. Das Testfeld mit hoher Sensitivität enthält eine kuppelnde Verbindung der allgemeinen Formel I (s.Abb.), wodurch ein Purpurfarbstoff entsteht. Die Testfelder mit geringer Sensitivität enthalten eine kuppelnde Verbindung der Formel Il oder III (s. Abb).

Bei Verwendung von Kupplern der Formel Il entsteht ein gelbes Farbprodukt. Durch die geringe Reaktivität der Kuppler spricht die Sensitivität des Testfeldes nur auf hohe Harnsäurekonzentration an.

Der pH-Wert ist in allen Testfeldem mit bekannten Puffern, vorzugsweise Boratpuffer, auf pH 8,5-10 eingestellt. Durch die o.g. stabilisierende Wirkung der Bindemittel auf die Reagenz-Enzyme Uricase und Peroxidase ist es nicht erforderlich, das Reaktionsmilieu auf pH 7 zu halten. Der pH-Bereich 8,5-10 bringt bei dem erfindungsgemäßen analytischen Element zwei Vorteile. Einmal entspricht dieser pH-Bereich dem pH-Optimum der Uricase-Reaktion, wodurch die Konzentration an diesem teuren Enzym gegenüber der beim Reaktions-pH von 7 drastisch gesenkt werden kann und trotzdem noch ein schneller Umsatz der Harnsäure gewährleistet ist, so daß die Kompetition zwischen Harnsäure und dem Chromogen bei der nachfolgenden Peroxidase-Reaktion nicht mehr von Bedeutung ist. Weiterhin ist es durch Einstellen des pH-Bereiches 8,5-10 möglich, der bekannten farbstoffbildenden Oxidation des Phenylendiaminderivates zu einem instabilen Farbprodukt eine Kupplungsreaktion anzuschließen, die zu einem farbstabilen Endprodukt führt, was von entscheidender Bedeutung für die Anwendung des analytischen Elementes in der Praxis ist.

Die Testfelder bestehen aus zwei oder mehreren Schichten, die Enzymkonzentrationsgradienten aufweisen, wobei die obere Schicht eine Konzentration beider Reagenzenzyme aufweist, die ca.40-65% von den in den darunter befindlichen Schichten beträgt. Das Konzentrationsverhältnis von Uricase zu Peroxidase soll in der oberen Schicht 1:15 bis 1:30 und in den unteren Schichten 1:25 bis 1:45 betragen. Durch diese Konzentrationsanordnung der Enzyme wird erfindungsgemäß erreicht, daß die drei im analytischen Element stattfindenden Nachweis- bzw. Indikatorreaktionen so definiert ablaufen, daß das Ergebnis der Konzentrationsbestimmung nicht durch mögliche Kompetitionen der Reaktionspartner und Zwischenprodukte beeinflußt wird. Der erforderliche Enzymkonzentrationsgradient kann durch Aufbringen mehrerer Schichten der Bindemittel-Reagenzemulsion auf den Träger realisiert werden. Dadurch wird gleichzeitig einen geeignete Schichtdicke der Testfelder erreicht, die Voraussetzung für die Aufnahme eines ausreichenden Volumens an Prüflösung ist. Vorzugsweise soll die Trocken-Schichtdicke

)as erfindungsgemäße analytische Element zeichnet sich dadurch aus, daß es mit ökonomisch vertretbarem Aufwand nach lekannten Technologien unter Verwendung von handelsüblichen Ausgangsstoffen hergestellt werden kann. Der Einsatz an ieagentien ist den bekannten und z.Z. gebräuchlichen naß-chemischen Verfahren adäquat, aber durch einfache Handhabung les analytischen Elementes ist eine weitgehende Rationalisierung der z.Z. üblichen Harnsäurebestimmung in klinischhemischen Laboren möglich bzw. der Anwendungsbereich kann wesentlich verbreitert werden, da das analytische Element in ler erfindungsgemäßen Form auch von Nichtfachleuten verwendet werden kann.

!ei Verwendung des analytischen Elementes beträgt die Reaktionszeit zur Bestimmung von Harnsäure im BlutoderSerumca.10 /linuten, während die z.Z. üblichen naßchemischen Verfahren eine Gesamtanalysezeit von ca.75 Minuten benötigen.

teispiel 1 tegußlösung a

τ 100 ml einer 8%igen Gelatinelösung, die mit Boratpuffer auf pH 8,5 eingestellt ist und entsprechende Zusätze an in der ilmindustrie üblichen Emulgatoren und vernetzenden Reagentien enthält, werden 1 mMol/l p-Diethy-phenylendiamin-sulfat als arbbildner und 2,5mMol/l einer kuppelnden Verbindung der Formel I als diffusionsverhindemde und kuppelnde Komponente es Indikatorsystems gelöst. Der Begußlösung werden 30 Units Uricase und 2150 Units Peroxidase zugesetzt und die fertige legUßlösung so auf eine Celluloseacetatfolie aufgetragen, daß eine Reaktionsschicht von ca. 20μ.ιη entsteht. Der trockene :eagenzfilm wird in quadratische Testfelder von ca. 5 χ 5 mm Länge zerteilt (Testfeld 1).

egußlösung b

\l\e Begußlösung a, nur werden als kuppelnde Verbindung 2mMol/l einer Verbindung der Formel Il verwendet.

s werden 20 Units Uricase und 1500 Units Peroxidase eingesetzt. Dertrockene Reagenzfilm wird zur Herstellung des Testfeldes verwendet.

e ein Testfeld 1 bzw. Testfeld 2 werden auf einer geeigneten Unterlage befestigt. Zur Analyse der Hamsäurekonzentration im erum werden beide Testfelder mit je 1 Tropfen Serum betropft, überschüssiges Prüfgut nach 5 Minuten abgewischt und ühestens nach weiteren 5 Minuten der Farbeindruck visuell beurteilt. Bei normalen Harnsäurewerten zeigt nur Testfeld 1 eine sichte Verfärbung. Erhöhte Serumharnsäurewerte werden an einer Gelbfärbung des Testfeldes 2 erkannt, Testfeld 1 zeigt dann ine tiefe Purpurfarbe.

eispiel 2

ur photometrischen Auswertung der Harnsäurebestimmung wird ein analytisches Element hergestellt, das aus 2 nterschiedlich sensitiven Testfeldern besteht, auf denen jeweils ein purpurfarbener Farbstoff entsteht. Die Testfelder besitzen inen mehrschichtigen Aufbau.

I Testfeld 1

1100 ml einer 5% Gelatine werden wie unter Beispiel 1a) 1,5mMol/l p-Diethylphenylendiaminsulfat und 3mMol/l der jppelnden Verbindung gelöst. Zu 50ml dieser Begußlösung werden für die I.Schicht des Reagenzsystems 20 Units Uricase nd 1 200 Units Peroxidase zugesetzt und auf dem Träger aus Polyesterfolie vergossen. Auf diese Schicht wird eine weitere chicht aufgetragen, für die zu 50ml obiger Begußlösung 10 Units Uricase und 750 Units Peroxidas zugegeben werden. Die chichtdicke soll zwischen 25 und 32/xm liegen.

I Testfeld 2

'ie für Testfeld 1 beschrieben wird ein 2schichtiges Reagenzsystem hergestellt, nur werden als kuppelnde Komponente 2 m Mol/ äiner Verbindung der Formel III verwendet.

jr Herstellung des analytischen Elementes werden die beiden Testfelder wie unter Beispiel 1 beschrieben verwendet.

ach dem Kontakt des harnsäurehaltigen Prüfgutes kann die Farbstoffkonzentration durch Photometrie bei 540nm bestimmt erden. Zur Auswertung dienen die mit Kontroll-Lösungen ermittelten Konzentrations-Extinktiqnsbeziehungen für die beiden 3stfelder.

äispiel 3

jr Herstellung eines analytischen Elementes, mit dem visuell zwischen normalen Harnsäurewerten, erhöhten und stark höhten differenziert werden kann, werden Testfelder auf einer Unterlage kombiniert, die nach Beispiel 1 a, 1 b und 2b hergestellt orden sind.

iispiel 4

jr Herstellung eines analytischen Elementes werden Testfelder nach Beispiel 1 kombiniert, wobei die Begußlösung b für das Testfeld auf einer hellgrüngefärbten Folievergossen wird. Bei erhöhten Harnsäurekonzentrationen entsteht auf dem 2. Testfeld η blauer Farbeindruck.

iispiel 5

ir Bestimmung der Hamsäurekonzentration im Harn wird für die Herstellung des analytischen Elementes ein geeignetes lpiervlies mit der Reagenzmischung getränkt.

3ZU werden 50ml Tauchlösung hergestellt, indem in 50ml einer0,1 Mol/l Boratpufferlösung vom pH 8,5, die 1 mg irboxymethylzellulose und 0,25ml eines üblichen Netzmittels enthält, 10 Units Uricase und 600 Units Peroxidase eingebracht erden.

ir Herstellung des Testfeldes 1 enthält die Tauchlösung 1 mMol/l p-Diethyl-phenylendiaminsulfat und 2mMol/l einer ppelnden Verbindung der Formel I, die in 1 ml 0,1 uNaOH gelöst wurde.

ir Herstellung des Testfeldes 2 werden der Tauchlösung als kuppelnde Verbindung 2 mMol/l einer Verbindung der Formel Il gesetzt.

it diesen Tauchlösungen wird Filterpapier bis zur Sättigung imprägniert, getrocknet undfürTestfeiderder Größe 5 x 5 mm rschnitten. Diese Testfelder werden auf stäbchenförmige Folien aufgeklebt. Zur Testung von Harn wird das analytische 3ment in eine 1 + 9-verdünnte Probe von 24-Stunden-Sammelurin getaucht und nach ca. 5 Minuten der Farbeindruck !urteilt.

Formel ι H₂C

O=C,

C-R₁

R. R₁ = Alkylrest mit C = 15-21 R₉ = SuIfo-phenoxi-phenyl-Rest

Formel II

NH-CO-CH₂-CO-

NH-CO-R₂

Formel ill

L = Phenoxi-phenyl-Rest mit

- COOl·! substituiert I_n = Alkylrest mit C = 15-21

R- = Sulfo-phenoxi-phenyl-Rest R₀ = Alkylrest mit C = 15-21

Abb".:' Schnitt eines analytischen Elementes

Testfei der ' ' ' '

V / f 7 7λ \7 7 7 7 7/

Bindemittelschicht mit Reagentien .

· Trärj er folie Unterlage

Claims (3)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Analytisches Element zur Bestimmung von Harnsäure im physiologischen und pathologischen Konzentrationsbereich für Durchlicht- und Auflichtauswertung, unter Verwendung der bekannten gekoppelten Reaktion von Uricase und Peroxydase und oxydierbaren Phenylendiaminderivaten, mit Gelatine — gegebenenfalls mit transparentem Träger-Cellulosevliese oder Papier als Bindemittel für Nachweis-und Indikatorreagenzien, mit mindestens zwei Testfeldern gekennzeichnet dadurch, daß die Testfelder eine unterschiedliche Sensitivität besitzen, wobei die Testfelder hoher Sensitivität eine kuppelnde Verbindung der allgemeinen Formel I und die Felder geringer Sensitivität kuppelnde Verbindungen der allgemeinen Formel Il oder IM enthalten, daß der pH-Wert in allen Testfeldern mit an sich bekannten Puffern auf 8,5-10 eingestellt ist und daß dieTestfelder mit Gelatine als Bindemittel und einem Träger aus einer oder mehreren Schichten bestehen, wobei in den mehrschichtigen Testfeldern Enzymkonzentrationsgradienten vorhanden sind.
2. 2. Analytisches Element nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Enzymkonzentration in den Schichten von oben zum Träger hin zunimmt.
3. 3. Analytisches Element nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Testfelder auf Öffnungen in der Unterlage fixiert sind.

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