DD231370A1 - Verfahren zur stimulierung des betriebsstoffwechsels von in fluessigkeiten suspendierten mikroorganismen - Google Patents

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DD231370A1 DD24915583A DD24915583A DD231370A1 DD 231370 A1 DD231370 A1 DD 231370A1 DD 24915583 A DD24915583 A DD 24915583A DD 24915583 A DD24915583 A DD 24915583A DD 231370 A1 DD231370 A1 DD 231370A1
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microorganism
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Werner Riedel
Christian Pueschel
Gerda Koschade
Hans Herrmann
Rosemarie Berger
Barbara Von Oheimb
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Wassertech Forschung
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stimulierung des Betriebsstoffwechsels der fuer die Produktion von Antibiotika, Enzymen und organischen Saeuren industriell genutzten Mikroorganismenkulturen. Das Verfahren ist auch zur Umwandlung organischer Stoffe in Kohlendioxid und Wasser geeignet. Ziel der Erfindung ist, eine kontinuierliche Fahrweise der Mikroorganismenkulturen zu erreichen. Erfindungsgemaess wird die Mikroorganismensuspension in einem ersten Reaktor mit 0,005 bis 0,5%, bezogen auf das Biomassetrockengewicht, eines Chelatbildners, vorzugsweise des Diammonium- und/oder Triammoniumsalzes der Nitrilotriessigsaeure, versehen. Danach wird sie in einen zweiten Reaktor mit einem um mindestens 10 K erhoehtem Temperaturniveau von 30 bis 60C mit 0,1 bis 1% bezogen auf das Biomassetrockengewicht, hydrolytischen Enzymen eingebracht und dort 0,5 bis 24 h als Suspension gehalten.

Description

Verfahren zur Stimulierung des Betriebsstoffwechsels von in Flüssigkeiten suspendierten Mikroorganismen
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stimulierung des Betriebsstoffwechsels der für die Produktion von Antibiotika, Enzymen und organischen Säuren industriell genutzten Mikroorganismenkulturen. Das Verfahren ist auch zur Umwandlung organischer Stoffe in Kohlendioxid und Wasser geeignet.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Die großtechnische mikrobielle Produktion von Antibiotika, Enzymen und organischen Säuren erfolgt submers in belüfteten und gerührten Reaktoren (Fermentatoren), wobei meistens Kj die diskontinuierliche Fahrweise vorherrscht. Für den erfolgreichen Ablauf einer Fermentation sind mehrere Vorkulturen zur Beimpfung des Produktionstanks (Hauptfermentation) und sterile Bedingungen erforderlich. Bei der diskontinuierlichen Fermentation wachsen die Mikroorganismen (Bakterien oder Pilze) in der Regel so lange, bis eine essentielle Komponente des Nährmediums limitierend wird. Die Mikroorganismenkultur geht dann von der exponentiellen in die stationäre Wachstumsphase über. Während des Fermentationsprozesses unterliegen die Kulturbedingungen dauernden Veränderungen, was zu einer Änderung des physiologischen Zustandes der Mikroorganismenzellen führt. Meist ist die gewünschte Produktenbildung (Antibiotika, Enzyme ode'r organische Säuren) an einen bestimmten
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physiologischen Zustand der Mikroorganismen während der Fermentation gebunden. Es ist nicht möglich, diesen Zustand bei der diskontinuierlichen Fermentation für längere Zeit aufrechtzuerhalten. So setzt häufig die Enzymausschüttung am Ende der logarithmischen Phase ein und hält über einen mehr oder weniger langen Zeitraum in der stationären Phase an. Antibiotika z. B. werden in den Kulturlösungen oft nicht zur Zeit des stärksten Wachstums gebildet, sondern erst dann, wenn der Produzent zu altern beginnt, d. h. während des Autolysestadiums. Auch die Bildung organischer Säuren, wie z. B. der Zitronensäure setzt erst nach Abschluß des Wachstums des Produzenten ein. Um das zu erreichen, erfolgt die Kultur des Zitronensäurebildners in ITährmedien mit suboptimalen Phosphatmengen.
Die Dauer der Fermentation ist ein üirfahrungswert und ist vor allem unter ökonomischen Aspekten zu sehen. Damit der Abbruch der Fermentation zum optimalen Zeitpunkt erfolgen kann, ergeben sich hohe Anforderungen an die Überwachung des Fennentationsprozesses. Im allgemeinen dauert eine normale Fermentation 2 bis 7 Tage. Nach Abbau des produkthaltigen Kulturmediums aus den Fermentern werden diese nach gründlicher Reinigung und Wartung für eine erneute Fermentation vorbereitet (Füllung mit Nährmedium, Sterilisation des gesamten Systems, Beimpfung mit Yorkultur aus den Impftanks).
Von großer industrieller Bedeutung ist die kontinuierliche Fermentation. Diese kommt gegenwärtig nur bei der Produktion von Biomasse und Gärungsprodukten sowie bei der Umwandlung organischer Stoffe in gasförmige Reaktionsprodukte und .Wasser zur Anwendung. Bisher war es nicht möglich, im kontinuierlichen Prozeß solche Reaktionsbedingungen zu schaffen, daß die Freisetzung der gewünschten Produkte aus den Zellen der Mikroorganismen erfolgte. Die Umwandlung organischer Stoffe, z. 3. von Abprodukten, in COg und 7/asser erfolgt nur bei sehr langen Belüftungszeiten in befriedigendem Maße. Bei den ökonomisch vertretbaren Belüftungszeiten kommt es. in hohem Maße zur Neubildung von Biomasse (Baustoffwechsel), die nicht immer einer befriedigenden Nutzung zugeführt werden kann. Bisher waren keine Methoden bekannt, um den Bau-
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Stoffwechsel zugunsten des Betriebsstoffwechsels zu reduzieren. Der kontinuierliche Prozeß stellt bei der Herstellung bestimmter Produkte auch hohe Anforderungen an die Stabilität der Produktionsstamme, da es bei länger andauernder kontinuierlicher Kultur häufig zu Degenerationserscheinungen der Hochleistungsstämme kommt.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist es, bei der Produktion von Antibiotika, Enzymen und organischen Säuren eine kontinuierliche Fahrweise der Mikroorganismenkulturen zu erreichen. Es ist weiterhin Ziel der Erfindung, bei kurzen Behandlungs-zeiten eine weitgehende Umwandlung von organischen Stoffen in CO2 und Wasser zu ermöglichen.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es, den Betriebsstoffwechsel von Mikroorganismenkulturen so zu stimulieren, daß es im nährstoffhaltigen Milieu zu Materialverlusten der Organismen kommt und dadurch der Wachstumsprozeß der Kulturen unterbrochen wird. . Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Mikroorganismensuspension in einem ersten Reaktor mit 0,005 bis 0,5 %, bezogen auf das Biomassetrockengewicht, eines Chelatbildners, vorzugsweise des Diammonium- und/oder Triammoniumsalzes der Nitrilotriessigsäure, versehen wird und in einen zweiten Reaktor mit einem um mindestens 10 K erhöhten Temperaturniveau von 30 bis 60 0C mit 0,1 bis 1 %, bezogen auf das Biomassetrockengewicht, hydrolytischen Enzymen eingebracht wird und dort 0,5 bis 24 h als Suspension gehalten wird.
Bei der Herstellung bestimmter Produkte wird die Mikroorganismensuspension mit dem Chelatbildner bei Nährstoffüberschuß und Sauerstoffzufuhr in der logarithmischen Wachstumsphase kultiviert. Sie wird vorzugsweise mit dem Chelatbildner diskontinuierlich unter sterilen Bedingungen behandelt. In einer besonderen Ausführungsform erfolgt die Zugabe in
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den zweiten Reaktor intermittierend.
Zur Umwandlung von vorhandener Biomasse in GO2 und Wasser wird diese mit dem Chelatbildner 0,5 bis 6 h gemischt und dann mit den Enzymen in den zweiten Reaktor gegeben. In diesem findet unter Sauerstoffzufuhr die Hydrolyse mit unmittelbar anschließender Oxidation statt. Bei ausreichender Sauerstoffzufuhr wird auch das erforderliche Temperaturniveau erreicht.
Bei Mikroorganismenkulturen in stark verdünnten Nährmedien, wie sie z.B. bei der Behandlung flüssiger organischer Abprodukte gehalten werden, wird folgende abgewandelte Verfahrensweise gewählt:
Das verdünnte Nährmedium wird mit der Mikroorganismenkultur vermischt oder auch längere Zeit belüftet. Dabei werden die organischen Nährstoffe von den Mikroorganismen aufgenommen. Anschließend erfolgt eine weitgehende Abtrennung des Verdünnungsmediums. Die konzentrierte Mikroorganismensuspension wird nunmehr mit dem Chelatbildner vermischt und dann mit den Enzymen in den zweiten Reaktor gegeben. Hier wird ein Teil der Biomasse in CO2 und Wasser umgewandelt. Die übrige Biomasse wird zur erneuten Verwendung zurückgeführt.
Die Wirkungsweise des Verfahrens ist wie folgt: Der Chelatbildner verursacht eine Schwächung der Struktur der Zellwände der Mikroorganismen, so daß diese bei entsprechender Beanspruchung aufgelöst werden können. In der zweiten Reaktionsstufe bildet sich ein zuerst den Betriebsstoffwechsel, dann die Autolyse oder Sporulation der aus der ersten Reaktionsstufe stammenden Mikroorganismen förderndes Milieu heraus. Dieses enthält neben Resten von Nährsubstanzbestandteilen vor allem, die aus der enzymatischen Hydrolyse der organischen Makromoleküle des Nährmediums entstandenen und mikrobiell leicht verwertbaren niedermolekularen Verbindungen (Zucker, Aminosäuren, Fettsäuren, Alkohole u. a.) und die bereits autolysierten Mikroorganismen oder ihre Fragmente selbst bzw. die gebildeten Sporen.
Bei der Zuführung der mit dem Chelatbildner vorbehandelten Mikroorganismenkultur in dieses Milieu kommt es infolge des
Temperaturunterschiedes von mindestens 10 K zu einem Temperaturschock, wodurch der Betriebsstoffwechsel der Mikroorganismen spontan stimuliert wird und die im Milieu enthaltenen niedermolekularen Hydrolyseprodukte des Nährmediums sowie die niedermolekularen Verbindungen aus den Zellaufsohlüssen teilweise veratmet werden.
Infolge der stärkeren Förderung des Betriebs- als des Baustoff wechseis gehen die Mikroorganismen im Reaktionsmilieu schließlich durch Materialverlust zugrunde, d. h. sie verhungern und gehen in Selbstauflösung über (Autolysestadium) oder versporen schließlich.
Je nach Produkt (Antibiotika, Enzyme, organische Säuren) bzw. je nach Produzent (Art, Stamm) wird die Produktenbildung bereits während des Stadiums des gesteigerten Betriebsstoffwechsels oder erst bei beginnendem Autolysestadium ausgelöst.
Aus der zweiten Reaktionsstufe läuft das Fermentationsmedium kontinuierlich ab und kann der Aufbereitung zugeführt werden.
Die im Fermentationsmedium des Hauptfermenters herrschenden organismenfeindlichen Bedingungen schließen Fremdinfektionen so gut wie aus, so daß auf eine sterile Fermentation in dieser Phase verzichtet werden kann.
Bei der Umwandlung von Biomasse in COg und 7/asaer treten ebenfalls positive Wirkungen auf:
Durch die aus den autolysierten Mikroorganismen freigesetzten intrazellulären Enzymsysteme wird eine Intensivierung der Hydrolyse der organischen Makromoleküle erreicht. Dadurch werden erhebliche Mengen Fremdenzyme eingespart. Die mikrobielle Veratmung der hauptsächlich aus dem enzymatisciien Abbau der organischen Makromoleküle bzw. der aus den Zellaufschlüssen stammenden niedermolekularen Verbindungen (vor allem der hydrophilen Kolloide) verbessert das Trennverhalten der restlichen, nicht abbaubaren Biomasse und anderer Begleitstoffe erheblich.
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Ausführungsbeispiel
Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel erläutert werden.
Unter sterilen Bedingungen in zwei 5000-1-Vorfermentern bei 24 °C auf einer Variante des Maisquellwasser-Lactose-JMährbodens und bei Anwesenheit von jeweils 10 g eines Gemisches des Diammonium- und Triammoniumsalzes der Nitrilotriessigsäure diskontinuierlich wachsende und ca. 20 Stunden alte Submerskulturen von Penicillium spec, werden alternierend in Abständen von jeweils 10 Minuten einem 5000 1 fassenden Hauptfermenter kontinuierlich"zugeführt, der bereits auf 35 0G vorgewärmtes Fermentationsmedium enthält. Die Permentationszeit im Hauptfermenter beträgt ca. 12 Stunden, d. h. das ist die Zeit, bei der die Penicillinbildung maximal ist.
Pro 100 Liter zugeführten Kulturmediums aus den Vorfermentern werden jeweils 0,1 g in der lOOfachen Menge Leitungswasser vorgelöster hydrolytischer Enzyme, wie /3-Glucqnase, ct-Amylase, Proteasen und Lipase, ständig zudosiert. Das Fermentationsmedium wird während der unsterilen Fahrweise mit einer Pumpe ständig umgewälzt, und unter Zuführung von Wärmeenergie (z. B. Dampf) wird die erforderliche Permentationstemperatur aufrechterhalten. Pro 24 Stunden werden dem Hauptfermenter also 10000 1 Kulturmedium aus den Vorfermentern zugeführt, so daß sich ein Durchsatz von 10000 l/Tag ergibt. Gegenüber der normalen Penicillin-Fermentation, die im allgemeinen 100 Stunden dauert, beträgt die Permentationsdauer beim Zweiphasenverfahren nur noch ca. 36 Stunden.
Das aus dem Hauptfermenter kontinuierlich ablaufende Fermentationsmedium wird der Aufbereitung zugeführt. Das hauptsächlich autolysiertes Mycel und infolge der hydrolytischen Wirkung der zudosierten Enzyme kaum hydrophile Kolloide enthaltende Permentationsmedium bereitet bei der Filtration keine Schwierigkeiten.
Die Hauptfermentation kann über mehrere Tage durchgehend erfolgen, während die nur für die Vermehrung des Mycels ge-
nutzten- Vorfermenter ca. 2Q Stunden vor ihrem Einsatz immer neu angefahren, werden müssen, so daß für die kontinuierliche Beschickung des 5000-1-Hauptfermenters bei Berücksichtigung der anfallenden Abbau- und Vorbereitungszeiten 3 Vorferment erp aar e erforderlich sind.
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Claims (8)

  1. Erf inching a ansp rue h
    1. Verfahren zur Stimulierung des Betriebsstoffwechsels von in Flüssigkeiten suspendierten Mikroorganismen, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikroorganismensuspension mit 0,01 bis 1 %, bezogen auf die organische Trockensubstanz, hydrolytischen Enzymen in einen Reaktor eingeführt wird, der ein um mindestens 10 K erhöhtes Temperaturniveau von 30 bis 60 0C aufweist und dort 0,5 bis 24 h gerührt wird.
  2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß-die Mikroorganismensuspension vor der enzymatischen Behandlung mit 0,005 bis 0,5 %, bezogen auf' die organische Trockensubstanz, eines Chelatbildner behandelt wird.
  3. 3. Verfahren 'nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet -dadurch, daß als Chelatbildner das Diammonium- und/oder Triammoniumsalz der Nitrilotriessigsäure verwendet wird.
  4. 4. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikroorganismensuspension mit dem Chelatbildner bei NährstoffÜberschuß und Sauerstoffzufuhr in der logarithmischen r/achstumsphase kultiviert- wird.
  5. 5. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikroorganismensuspension mit dem Chelatbildner diskontinuierlich unter sterilen Bedingungen gehalten wird.
  6. 6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikroorganismensuspension in den zweiten Reaktor intermittierend zugegeben wird.
  7. 7. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikroorganismensuspension im zweiten Reaktor intensiv
    - belüftet wird.
  8. 8. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß in, den ersten Reaktor eine Mikroorganismensuspension eingeleitet wird, die in einem Belüftungsbecken kultiviert und anschließend unter Wasserabtrennung konzentriert wurde, die Mikroorganismensuspension mit dem Chelatbildner vermischt wird und im zweiten Reaktor unter aeroben Bedingungen mit Enzymen behandelt wird, wobei.die Mikroorganismensuspension wieder in das Belüftungsbecken rückgeführt wird.
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