DD231949A3 - Verfahren zur fermentativen herstellung von nourseothricin - Google Patents
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Abstract
Es wird ein fermentatives Nourseothricin-Gewinnungsverfahren beschrieben, mit dem unter Verwendung von hexosearmen, di-, oligo- oder polymerhaltigen Kohlenhydratquellen enthaltenden Naehrmedien und entsprechend geeigneten Staemmen im Verlaufe einer etwa 140stuendigen Fermentation bei geregelter Aciditaet hohe Konzentrationen an Nourseothricin akkumuliert werden.
Description
Die Erfindung betrifft die fermentative Herstellung des Antibiotikums Nourseothricin. Es hat ergotrope Wirkung und besitzt demzufolge große ökonomische Bedeutung für die Landwirtschaft und die pharmazeutische Industrie.
Nourseothricin ist ein aus der Kultur von Streptomyces noursei JA 3890 b isoliertes Antibiotikum, welches gegen grampositive und gegen gramnegative Bakterien sowie Mycobakterien wirksam ist und auch antivirale Eigenschaften aufweist (Bradler, G., und Thrum, H., 1963: Nourseothricin A und B, zwei neue antibakterielle Antibiotica einer Streptomyces noursei-Variante. Z. AIIg. Mikrobiol., 3,105-112). Nourseothricin ist ein Gemisch derStreptothricine Fund D (Gräfe, U., Bocker, H., Reinhard, G., und Thrum, H., 1974: Regulative Beeinflussung der Nourseothricinbiosynthese durch o-Aminobenzoesäure in Kulturen des Streptomyces noursei JA 3890b. Z. AIIg. Mikrobiol., 14,659-673).
Es ist bereits ein Verfahren vorgeschlagen worden, nach welchem mit diesem Stamm in einem aeroben Submersverfahren Nourseothricin hergestellt wird. Nachteilig an diesem Verfahren ist der Einsatz von Inhibitoren der Atmungskette vom Typ der Alkaliazide, des Brenzkatechins und/oder des Amytals sowie Hemmstoffen des Aminosäuretransportes. In einem weiteren Vorschlag wird in einem Ausführungsbeispiel ein fermentatives Nourseothricin-Herstellungsverfahren angegeben, bei dem durch periodische Zugabe die ständige Anwesenheit von Glukose in der Kulturlösung gewährleistet wird. Nachteilig ist, daß hierfür größere Mengen Glukose, die erst aus polymere Kohlenhydrate enthaltenden Rohstoffen hergestellt werden muß, benötigt werden.
In einer Veröffentlichung (Gräfe, U., Bocker, H., Reinhard, G., und Thrum, H., 1974: Regulative Beeinflussung der Nourseothricinbiosynthese durch o-Aminobenzoesäure in Kulturen des Streptomyces noursei JA 3890b, Z. AIIg. Mikrobiol. 14, 659-673) wird ein Nährboden beschrieben, in dem Maisstärke als Kohlenstoffquelle eingesetzt wird. Bei diesem Prozeß wird unter Verwendung des Ausgangsstammes von Streptomyces noursei JA 3890 b auch mit Zusatz von Inhibitoren der oben genannten Typen sowie Inhibitoren, beschrieben in der Patentsache WP A61 K/223321, eine so geringe Ausbeute an Nourseothricin erhalten, daß eine ökonomische Herstellung nicht möglich ist.
Die Erfindung beinhaltet das Ziel, Nourseothricin auf hinreichend effektive Weise auf hexosearmen, insbesondere glukosearmen Nährmedien herzustellen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technisch günstiges Verfahren anzugeben, welches die industrielle Herstellung von Nourseothricin mittels einer hexosearmen, di-, oligo- oder polymerhaltigen Kohlenstoffquelle im Nährmedium erlaubt. Es wurde gefunden, daß bestimmte Nourseothricin-produzierende Stämme, die eine ausreichende amylolytische Aktivität aufweisen, mit Stärke als primär hexosearme, polymere Kohlenhydratquelle große Mengen Nourseothricin in der Nährlösung akkumulieren. Überraschend wurde dabei festgestellt, daß diese Stämme auch ohne Zusatz von Inhibitoren der Atmungskette beziehungsweise des Aminosäuretransportes Nourseothricin in diesen großen Mengen akkumulieren. Diese Befunde ergaben sich beispielsweise für die unter den No. ZIMET43700, ZIMET 43701 und ZIMET 43708 in der Hinterlegungsstelle des ZIMET hinterlegten Nourseothricin-produzierenden Stämme.
Im Ergebnis dieses Befundes wird das erfindungsgemäße Verfahren wie folgt durchgeführt:
Vegetatives Impfmaterial des verwendeten Nourseothricin-bildenden Stammes, welches aus Mycelkonserven in an sich bekannter Art und Weise in mehreren Stufen angezüchtet worden war, dient zum Beimpfen von Fermentationsnährmedien folgender Grundzusammensetzung:
— Stärke, insbesondere Maisstärke, als Hauptkohlenhydratquelle in einer Menge von 50 bis 150 Gramm pro Liter
— Komplexe Stickstoffquellen in Form von Erdnußextraktionsschrot oder Sojaextraktionsschrot in einer Menge von 5 bis 25 Gramm pro Liter und/oder Maisquellwasser in einer Menge von 1 bis 10 Gramm pro Liter
— Anorganische Stickstoffquelle, beispielsweise Ammoniumsulfat in einer Menge von 5 bis 15 Gramm pro Liter
— Calziumkarbonat, beispielsweise in Form von Kreide, in einer Menge von 4 bis 20 Gramm pro Liter
— Entschäumer, beispielsweise Entschäumer auf Silikon- oder Polyäthylenglykol-Basis oder/und pflanzliche Fette.
Im Verlauf einer 72- bis 196stündigen Fermentation bei Temperaturen von 28 bis 3OX mit und ohne Nachdosierung von verflüssigten, konzentrierten polymeren Kohlenhydratquellen unter Verwendung von Enzympraparaten m.t amylolvtischer Aktivität beispielsweise Brauereienzym, in an sich bekannter Art und Weise, sowie be. Konstanthaltung der Ac.d.tat der KuTurSung Surch Zugabe von 25%!ger Ammoniumhydroxydlösung auf einem pH-Wert-Niveau von 5,0 b.s 8,0, bevorzugt jedoch bei pH 5,5 bis 6,5 wird eine hohe Konzentration von Nourseothricin in der Kulturlosung erreicht. Die Aufarbeitung des Nourseothricins erfolgt in an sich bekannter Art und Weise.
Ausführungsbeispiele
Die Erfindung soll an Beispielen näher erläutert werden:
Beispiel Ί
Aus einer Mycelkonserve des Stammes Streptomyces noursei ZIMET 43700 werden Vorkulturen angelegt. Diese enthalten m 500-ml-Steilbrustflaschen jeweils 100ml bzw. in 2,5-l-Erlenmeyerkolben jeweils400ml des Anzuchtmed.ums folgender Zusammensetzung: Je Liter Leitungswasser Erdnußextraktionsschrot 15g, Maisquellwasser '^«^^f^aTstl^bie Maltose40g,Ammoniumsulfat5g,Calziumcarbonat6g. Der pH-Wert wird vor der Sterilisation auf pH 6,5 bis 6,8 eingestellt. Die Sterilisation erfolgt über 35 Minuten bei 1210C. . .,,.nnn ._„
Die erste Anzuchtstufe wird 48 Stunden bei 29°C bis 3OX auf einem Rundschwingschutteltisch kultiviert. Nach Vorliegen einer ausreichenden Mycel menge erfolgt die Übertragung von je20mlVorkulturlösung als Impfmaterial auf d.eaveite Anzuchtphase, die unter gleichen Bedingungen 24 Stunden kultiviert wird. „^«h««»
Zur Beimpfung eines 15-l-Fermentors mit 101 Nährlösung wird der Inhalt von zwei Anzuchtkolben der zweiten Anzuchtphase
Zusammensetzung der Nährlösung: je Liter Leitungswasser Maisstärke 80g, Erdnußextraktionsschrot 25g, MaiequeMwasser 10g, Ammoniumsulfat 10g, Sonnenblumenöl 3g, Rügenkreide 5g. Der pH-Wert wird vor der Sterilisation au^68b,s7 0 eingestellt. Die Sterilisation erfolgt über 30 Minuten bei 121 "C. Im Verlaufe der Fermentation werden zweimal 300g Starke (nach Behandlung mit Brauereienzym in bekannter Art und Weise) zugegeben. Die Acidität der Fermentat.onslosung wird mittels Ammoniumhydroxyd auf einem pH-Wert von 6,2 konstant gehalten. Nach Ablauf einer 144stündigen Fermentation bei einer Drehzahl von 360 UPM und einer Belüftungsrate von 0,75VVM wurden 7,2 Gramm Nourseothricin pro Liter Kulturlosung
bestimmt.
Zwei Schüttelf laschen (2,5I) mit je 400 ml Nährlösung werden mit je 0,5 ml einer Mycelkonservenaufschwämme des Stammes Streptomyces noursei ZIMET 43701 beimpft und 48 Stunden bei 29°C auf einem Rundschwingschüttelt.sch kultiviert. Zusammensetzung der Nährlösung: je Liter Leitungswasser Maisstärke 15g, Sojaextraktionsschrot 15g, KaNumdihydrogenphosphat 0,3g, Natriumchlorid 5g, Calziumcarbonat 1 g. Der pH-Wert der Lösung wird vor der Sterilisation auf pH 6,5 bis 6,8 eingestellt. Die Sterilisation erfolgt über 30 Minuten bei 1210C.
Der vereinigte Inhalt der ersten Vorkulturen dient zum Beimpfen eines 250-l-lmpftanks mit 1501 Nährlosung der 9 eichen Zusammensetzung wie in der ersten Vorkultur. Die Kultivierung erfolgt bei 29°C über 40 Stunden be. einer Drehzahl von 240 UPM und einer Belüftungsrate von 0,5VVM. . .
451 dieser Impfkultur werden als Inokulum für 4001 Nährlösung eingestellt auf eine Acidität von pH 6,8 bis 7,0 in einem 720-l-Fermentor verwendet. Die Kultivierung wird bei einer Belüftungsrate von 1,0WM und einer Drehzahl von 320UPM bei 29°C durchgeführt. Die Acidität der Kulturlösung wird durch Zugabe von 25%iger Ammoniumhydroxyd-Losung auf einem pH-Wert von 6,2 automatisch konstant gehalten.
Die Nährlösung hat folgende Zusammensetzung: je Liter Leitungswasser Maisstärke 60g, Erdnußextraktionsschrot 10g Maisquellwasser 2g, Ammoniumsulfat 8g, Zinksulfat 0,05g, Mangansulfat 0,03g, Sonnenblumenöl 0,5g, Rugenkreide 3,75g.
Die Acidität des Nährlösungsansatzes wird vor der Sterilisation auf einen pH-Wert von 6,8 bis 7,0 eingestellt. Die Sterilisation erfolgt mit Direktdampf bei 12OX während 30 Minuten. Im Verlaufe der Fermentation werden 6mal 6 kg Maisstärke die in an sich bekannter Art und Weise mit Brauereienzym als konzentrierte Lösung (ca. 30%ig) verflüssigt wurde, zur 30., 45., 54., 70., 100. und
120. Stunde zudosiert. . . .
Nach 120stündiger Fermentation wurde eine Kulturlösung von 5501 geerntet, deren Konzentration an Nourseothr.cin 6,53 Gramm pro Liter betrug.
Zur Impfmaterialanzucht wird eine lyophil an Glukose-Gelatine getrocknete Mycelkonserve (Bruttogewicht des Konserveninhaltes ca. 300mg) des Stammes Streptomyces noursei ZIMET 43708 mit 3ml physiologischer Kochsalzlosung aufqeschwämmt. Von dieser Suspension dienen 0,5ml als Inokulum von 400ml Vorzuchtmedium der ersten Stufe. Das Vorzuchtmedium enthält je Liter Leitungswasser folgende Einsatzstoffe: Glukose 40g, Sojaextraktionsschrot 15g, Kaliumdihydrogenphosphat 0,3g, Natriumchlorid 5g und Calziumcarbonat 3g. .„,.,. . ·,
Die Acidität wird vor der Sterilisation auf den Wert pH 6,5 eingestellt. Je 400ml dieses Mediums werden in 2.5I fassende, mit Wattestopfen verschlossene Steilbrustflaschen abgefüllt. Die Sterilisation erfolgt bei 12OX im Autoklaven wahrend 35 Minuten. Diebeimpften Kulturen werden aufRundschwingschütteltischen bei 29Xüber48 Stunden bebrütet. M'tJOOml der so erhaltenen Kulturlösung der ersten Vorzuchtstufe wird alszweite Stufe ein mit 1801 dampfsterilisiertem Med.um (45 Minuter.bei 120 C) der gleichen Zusammensetzung wie in der ersten Vorzuchtstufe gefüllter Edelstahlfermentor (Bruttovolumen 250I) beimpft. D.e Kultivierung erfolgt über einen Zeitraum von 40 Stunden (pH-Wert 5,1 bis 5,3 erreicht) bei 28X b.s 29X, einer Drehzahl von 240 UPM und einer Belüftungsrate von 1,0WM. Für die Hauptkultur dient ein Edelstahlfermentor (Bruttovolumen 42001), der mit
2500I Nährlösung folgender/auf 1 Liter Leitungswasser bezogener Zusammensetzung gefüllt ist. Maisstarke 62,5, Glukose Z,5g, Sojaextraktionsschrot 12g, Ammoniumsulfat 11 g, Magnesiumsulfat 2g, Natriumchlorid 1 g, Calziumcarbonat 6g, Zinksulfat 0 5q Polypropylenglykol 0,5g. Die Acidität wird vor der Sterilisation auf den pH-Wert 6,2 eingestellt. Die Sterilisation des Nährmediums (ohne Glukoseanteil) erfolgt in situ durch Vorwärmen mit Manteldampf auf 75X und anschließende Erh.tzung mittels Direktdampf auf 120X für 15 Minuten. Nach Abkühlung auf 29Xwirddiein Form einer40%igen wäßrigen Losung durch 30minütiges Erhitzen auf 12OX getrennt sterilisierte Glukose unter aseptischen Bedingungen zugesetzt. Vor der Beimpfung erfolgt die Einstellung der Start-Acidität der Nährlösung mit Schwefelsäure auf den pH-Wert 6,8 ± 0,1.
Der mit 4% Inokulum aus der zweiten Vorzuchtstufe beimpfte Fermentationsansatz der Hauptkultur wird 140 Stunden bei 290C, einer Belüftungsrate von 0,5VVM (0. bis 20.Stunde) bzw. 1,0WM (20. bis 14O.Stunde) bei 0,03MPa Überdruck unter Rühren mit 180 UPM kultiviert. Die Acidität der Kulturlösung wird nach physiologisch bedingtem langsamem Absinken vom Start-pH-Wert auf einen pH-Wert von 6,0 ± 0,1 mit 25%iger Ammoniumhydroxydlösung konstant geregelt. Im biologischen Test wurden in der Kulturlösung folgende Produktmengen bestimmt: Fermentationsstunde Nourseothricin (h) (g-r1)
| 68. | 3,9 |
| 92. | 5,2 |
| 116. | 7,5 |
| 140. | 9,7 |
Die Vorkultivierung erfolgt wie in Beispiel 3 beschrieben; es findet ebenfalls der Stamm ZIMET 43708 Verwendung. Zur Hauptkultur wird ein Edelstahlfermentor (Bruttovolumen 7201) verwendet, der mit 5001 Nährlösung folgender, auf 1 Liter Leitungswasser bezogener Zusammensetzung gefüllt ist: Maisstärke 62,5g, Glukose 2,5g, Sojaextraktionsschrot 12g, Ammoniumsulfat 11g, Magnesiumsulfat 2g, Natriumchlorid 1g, Calziumcarbonat 6g, Eisen-(lll)-sulfat 0,1g, Polypropylenglykol 0,5g. Die Acidität der Lösung wird vor der Sterilisation auf den pH-Wert 6,2 eingestellt. Die Sterilisation des Nährmediums (ohne Glukoseanteil) erfolgt in situ durch Vorwärmen mit Manteldampf auf 75°C und anschließende Erhitzung mittels Direktdampf auf 12O0CfUr 15 Minuten. Nach Abkühlung auf 290C wird die in Form einer 50%igen wäßrigen Lösung durch 30minütiges Erhitzen auf 120°C getrennt sterilisierte Glukose unter aseptischen Bedingungen zugesetzt. Vor der Beimpfung erfolgt die Einstellung der Start-Acidität der Nährlösung mit Schwefelsäure auf den pH-Wert 6,8 ±0,1.
Der mit 4% Inokulum aus der zweiten Vorzuchtstufe beimpfte Fermentationshauptansatz wird 116 Stunden bei 290C, einer Belüftungsrate von 0,5VVM (0. bis 20. Stunde) bzw. 1,0WM (20. bis 116. Stunde) bei 0,03MPa Überdruck unter Rühren mit 320 UPM kultiviert. Die Acidität der Kulturlösung wird nach physiologisch bedingtem langsamem Absinken vom Start-pH-Wert auf einen pH-Wert von 6,0 ± 0,2 mit 25%iger Ammoniumhydroxydlösung konstant geregelt. Im biologischen Test wurden in der Kulturlösung folgende Produktkonzentrationen bestimmt: Fermentationsstunde Nourseothricin (h) (g-r1)
| 44. | 2,2 |
| 68. | 4,0 |
| 92. | 5,2 |
| 116. | 6,5 |
Die Vorkultivierung erfolgt wie im Beispiel 3 beschrieben; es findet ebenfalls der Stamm ZIMET 43708 Verwendung. Zur Hauptkultur wird ein Edelstahlfermentor (Bruttovolumen 450I) verwendet, der mit 300I Nährlösung folgender, auf 1 Liter Leitungswasser bezogener Zusammensetzung gefüllt ist: Maisstärke 120g, Glukose 5g, Sojaextraktionsschrot 24g, Ammoniumsulfat 11g, Magnesiumsulfat 2g, Natriumchlorid 1g, Calziumcarbonat 6g, Zinksulfat 0,5g und Polypropylglykol 0,5g.
Zur Verflüssigung des hohen Anteils an polymerer Kohlenhydratquelle wird Brauereienzym in an sich bekannter Art und Weise eingesetzt. Nach der enzymatischen Hydrolyse der Stärke werden die restlichen Nährbodenbestandteile eingefüllt. Die Sterilisation des Nährmediums erfolgt durch Erhitzung auf 120°C für 15 Minuten. Nach Abkühlung auf Betriebstemperatur erfolgt vor der Beimpfung die Einstellung der Start-Acidität des Nährmediums mit Schwefelsäure auf den pH-Wert 6,8 ± 0,1. Der mit 4% Inokulum aus der zweiten Vorzuchtstufe beimpfte Fermentationshauptansatz wird 124 Stunden bei 29°C, einer Belüftungsrate von 0,5WM (0. bis 20.Stunde) bzw. 1,0WM (20. bis 124. Stunde) bei 0,03MPa Überdruck unter Rühren mit 400UPM kultiviert.
Zur 16. Fermentationsstunde erfolgt im Zusatz von 12mg· I ~1 Phosphat-Phosphor (als Kaliumdihydrogenphosphat) in Form einer sterilisierten wäßrigen Lösung. Die Acidität der Kulturlösung wird nach physiologisch bedingtem langsamem Absinken vom Start-pH-Wert auf einen pH-Wert von 6,0 ± 0,2 mit 25%iger Ammoniumhydroxydlösung konstant geregelt. Im biologischen Test wurden in der Kulturlösung folgende Produktkonzentrationen bestimmt Fermentationsstunde Nourseothricin (h) (g-r1)
| 44. | 2,6 |
| 68. | 6,3 |
| 92. | 9,4 |
| 116. | 12,4 |
| 124. | 15,1 |
Die Vorkultivierung erfolgt wie im Beispiel 3 beschrieben; es findet der Stamm 43708 Verwendung.
Die Nährlösung und ihre Präparation entsprechen ebenfalls dem in Beispiel 3 Dargestellten. Es werden zwei Edelstahlfermentoren (Bruttovolumen 720I), die mit je 500I Nährlösung gefüllt sind, eingesetzt.
Die Inokulummenge und das Prozeßregime entsprechen gleichfalls dem in Beispiel 3 Dargestellten. Bei einem Fermentationsansatz erfolgt zur 12. Fermentationsstunde ein Zusatz von 10 mg · l~1 Phosphat-Phosphor (als Kaliumdehydrogenphosphat) in Form einer sterilisierten wäßrigen Lösung. Der andere Fermentationsansatz erhält keinen Zusatz.
Im biologischen Test wurden in den Kulturlösungen folgende unterschiedlich schnell ansteigende Nourseothricin-Konzentrationen ermittelt:
| Fermentationsstunde | Nourseothricin | r1) | mit |
| (h) | (g· | Phosphat-Phosphor-Zusatz | 4,1 |
| ohne | 5,6 | ||
| 3,8 | 7,4 | ||
| 68. | 4,9 | 7,5 | |
| 92. | 6,1 | ||
| 116. | 7,1 | ||
| 140. |
Die Vorkultivierung erfolgt wie im Beispiel 3 beschrieben; es findet ebenfalls der Stamm ZIMET 43708 Verwendung. Zur Hauptkultur wird ein Edelstahlfermentor (Bruttovolumen 720I) verwendet, der mit 500I Nährlösung folgender, auf 1 Liter Leitungswasser bezogener Zusammensetzung gefüllt ist: Maisstärke 62,5g, Glukose 2,5g, Sojaextraktionsschrot 16g, Ammoniumsulfat 11g, Magnesiumsulfat 2g, Natriumchlorid 1g, Calziumcarbonat 6g, Aluminiumsulfat-Hydrat 0,13g, Polypropylenglykol 0,5g. Die Acidität der Lösung wird vor der Sterilisation auf den pH-Wert 6,2 eingestellt. Die Sterilisation erfolgt durch Erhitzung auf 120°C für 15 Minuten. Nach Abkühlung auf 29°C wird vor der Beimpfung die Start-Acidität des Nährmediums mit Schwefelsäure auf den pH-Wert 6,8 ± 0,1 eingestellt.
Der mit 4% Inokulum aus der zweiten Vorzuchtstufe beimpfte Fermentationshauptansatz wird 116 Stunden bis 29°C, einer Belüftungsrate von 0,5WM (0. bis 20. Stunde) bzw. 1,0WM (20. bis 116. Stunde) bei 0,03 MPa Überdruck unter Rühren mit 320 UPM kultiviert. Die Acidität der Kulturlösung wird nach physiologisch bedingtem langsamem Absinken vom Start-pH-Wert auf einem pH-Wert von 6,0 ± 0,3 mit 25%iger Ammoniumhydroxydlösung konstant gehalten. Im biologischen Test wurden in der Kulturlösung folgende Produktkonzentrationen bestimmt: Fermentationsstunde Nourseothricin <h) (g-r1)
| 44. | 2,5 |
| 68. | 4,9 |
| 92. | 7,2 |
| 116. | 9,3 |
Claims (4)
- Erfindungsanspruch:1. Verfahren zurfermentativen Herstellung von Nourseothricin mit Stämmen von Streptomyces noursei unter submersen aeroben Kulturbedingungen in einem Medium mit geeigneten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie ausreichenden Konzentrationen an Mineralsalzen bei einer Temperatur von 28°Cbis32cC unter Konstanthaltung der Acidität der Kulturlösung auf einem festgelegten Grenzwert im Bereich von pH 5,0 bis 8,0, gekennzeichnet dadurch, daß Leistungsmutanten oder Selektanten von Streptomyces noursei mit hinreichend hoher amylolytischer Aktivität verwendet werden und die Kultivierung für die Dauer von 72 bis 196 Stunden unter Verwendung von hexosearmen, insbesondere glukosearmen, di- und/oder oligo- und/oder polymerhaltigen Kohlenhydratquellen, jedoch auch ohne Anwesenheit spezieller Inhibitoren der Atmungskette beziehungsweise des Aminosäuretransportes erfolgt.
- 2. Verfahren nach Punkt 1., gekennzeichnet dadurch, daß als Stämme von Streptomyces noursei mit hinreichend hoher amylolytischer Aktivität die Stämme ZIMET 43700, ZIMET 43701 oder ZIMET 43708 verwendet werden.
- 3. Verfahren nach Punkt 1. und 2., gekennzeichnet dadurch, daß als hexosearme, polymerhaltige Kohlenhydratquelle Stärke, bevorzugt Maisstärke, eingesetzt wird.
- 4. Verfahren nach Punkt 1., 2., und 3., gekennzeichnet dadurch, daß die Stärke nach in an sich bekannter Art und Weise erfolgter Behandlung zur Erhöhung der Fließfähigkeit ihrer wäßrigen Suspensionen in voller Menge am Fermentationsbeginn und/ oder portionsweise beziehungsweise kontinuierlich während des Fermentationsprozesses in das Kulturmedium gegeben wird.
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