DD234280A5 - Verfahren zur herstellung eines polypetids - Google Patents
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Abstract
Es werden Verfahren und Zusammensetzungen fuer die Herstellung von menschlicher Superoxiddismutase und ein neues Protokoll zur Verbesserung der Wirksamkeit der Expression beschrieben. Das menschliche Superoxiddismutase kodierende Gen wird isoliert und in einem Vektor in Verbindung mit einem synthetischen Linker, der fuer eine verbesserte Wirksamkeit der Translation sorgt, eingefuehrt. Der Stamm E. coli D1210 (pSODX8) wurde am 27. September 1983 bei der A.T.C.C. hinterlegt und erhielt die Zugriffsnummer No. 39453. Der Hefestamm 2150-Z-3 (pC1/1GAPSOD) sowie die E. coli-Staemme D1210 (pSOD11) und D1210 (pS2OR) wurden am 9. Mai 1984 bei der A.T.C.C. hinterlegt und erhielten die Zugriffsnummern No. 20708, 39679 bzw. 39680.
Description
Die Erfindung betrifft die Herstellung eines Polypeptids, mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz wie der menschlichen Superoxiddismutase. Die Erfindung ist insbesondere in der Medizin aber auch auf anderen Gebieten anwendbar.
Superoxiddismutase (SOD) stellt eine Vielzahl von unterschiedlichen Enzymen dar, die in den meisten lebenden Organismen auftreten. Eine Funktion in Säugetieren besteht in der Zerstörung von Superoxid, einem Material, das in der Natur während der Phagozytose gebildet wird. Die Superoxiddismutasen werden in Familien unterteilt, und zwar auf Grundlage des Metalls, das mit dem Enzym assoziiert ist, wobei die Metalle Eisen, Mangan, Kupfer und Kupfer-Zink sein können. Superoxiddismutase, z. B. aus Rinderleber, hat klinische Verwendung gefunden, insbesondere als entzündungshemmendes Mittel für Säugetiere . einschließlich Menschen. Andere Anwendungen schließen das Abfangen von Superoxidanionen ein, die gebildet werden, wenn ein Gastorganismus verschiedenen Superoxid-induzierenden Agentien ausgesetzt wird, z. B. Strahlung, Paraquat und dergleichen; die Prophylaxe oder Therapie von bestimmten degenerativen Erkrankungen, z.B. Emphyseme; die Konservierung von Nahrungsmittel und dergleichen.
Die Aminosäuresequenz von menschlicher Erythrocyten-Cu-Zn-Superoxiddismutase wird von Jabusch et al.. Biochemistry (1980) 19: 2310-2316 und Barra et al., FEBS Letters (1980) 120:53-55 beschrieben. Rindererythrocyten-Cu-Zn-SOD wird von Steinman et al., J. Biol. Chem. (1974), 249: 7326-7338 beschrieben. Ein SOD-1-cDNS-Klon wird von Lieman-Hurwitzet al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1982), 79: 2808-2811 beschrieben. Bezüglich des Effektes auf die Wirksamkeit der Translation bei Veränderung der nicht übersetzten (nichttranslationierten Region oberhalb des Initiationskodons, vgl. Gheysen et al., Gene (1982) 17: 55-63; Thummel et al., J. Virol. (1981) 37: 683-697; und Matteucci und Heyneker, Nucl. Acids. ReI. (1983) 11: 3113-3121.
Es ist Ziel der Erfindung, stabile Quellen für physiologisch verträgliche Superoxiddismutase verfügbar zu machen, insbesondere zur Verwendung in vivo als entzündungshemmendes Mittel oder für andere therapeutische Zwecke. Für die Anwendung beim Menschen wäre es vorteilhaft, das homologe Enzym zur Verhinderung oder Minimalisierung möglicher Immunreaktionen zu verwenden.
Wesen der Erfindung -
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mittels rekombinanter DNS-Techniken in wirksamer Weise solche Produkte herzustellen, die die gewünschten biologischen Wirkungen der Superoxiddismutase aufweisen, z. B. immunologische und enzymatische Wirkungen.
Erfindungsgemäß erfolgt die Produktion von Polypeptiden mit der biologischen Wirksamkeit von menschlicher Cu-Zn-Superoxiddismutase durch Herstellung der cDNS des Hauptanteils des strukturellen Gens, der Verbindungen mit einem Gemisch von Adaptern zur Schaffung von verschiedenen Sequenzen, die sich von der ribosomalen Bindungsstelle zu degenerierten Nucleotiden in der Kodierungsregion erstrecken, und die Einführung des kompletten Gens mit seinen Translationssignalen in einen Fx:.ressionsvektor. Die Transformation von Mikroorganismen führt zur wirksamen Herstellung eines kompetenten Polypeptids, das die biologische Wirksamkeit von menschlicher Cu-Zn-Superoxiddismutase zeigt. Das Gen kann weiterhin zur Kombination mit sekretorischen und Verarbeitungssignalen für die Sekretion in einem geeigneten Gastorganismus verwendet werden. Die Expression eines Polypeptids wird verbessert, und zwar unter Einschluß der Verwendung von Gemischen von Adaptern mit unterschiedlichen Sequenzen, die die Initiationsstelle für die Translation flankieren, d. h. in der Region zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und der Initiationsstelle für die Translation und in den verschiedenen lnitiations-5'-Kodons des Polypeptids, soweit dies durch Redundanzeinschränkungen des genetischen Kodes
Die neuen Polypeptide sind an ihren N-Enden acetyliert. Durch die Schaffung einer besonderen Acetylierungssignalsequenz am 5'-Ende des strukturellen Gens für ein gewünschtes Polypeptid wird die N-terminale Aminosäure acetyliert, wenn das Gen in Hefe exprimiert wird. Die Acetylierungssignalsequenz kodiert für mindestens die ersten zwei N-terminalen Aminosäuren, wobei die erste Aminosäure entweder Alanin oder Glycin und die zweite Aminosäure eine polare Aminosäure, normalerweise Threonin, Serin oder Asparaginsäure ist. Die Acetylierung von menschlicher Superoxiddismutase, hergestellt in Hefe, wird demonstriert, wobei die ersten zwei Aminosäuren Alanin bzw. Threonin sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden, welche die biologischen Wirkungen von menschlicher Cu-Zn-Superoxiddismutase („hSOD") zeigen, verwendet eine DNS-Sequenz („hSOD-Gen"), die einen wesentlichen Abschnitt der Aminosäuresequenz von hSOD in Verbindung mit einer für die Expression in dem Expressionsgastorganismus optimierten Translationsinitiationsregion kodiert. Das hSOD-Gen wird in einen geeigneten Vektor für die Expression in einem Gastorganismus eingeführt, und zwar zweckmäßigerweise unter Bedingungen, die eine Sekretion gestatten, so daß der SOD-Produktausdem extrazellulären Medium gesammelt werden kann.
Im folgenden bezieht sich die Acetylierung auf die Addition an das Aminoende von Polypeptiden und Proteinen, im Gegensatz zu Modifizierungen von Aminosäure-Seitenketten, z. B. Lysin, wie dies auch in der Natur beobachtet wird. Die Acetylierung von Polypeptiden und Proteinen ist aus einer Anzahl von Gründen nützlich. Wo die natürlichen Bedingungen des Polypeptids die Acetylierung einschließen, wie dies der Fall bei zytoplasmischer hSOD ist, liefern die Acetylierung einschließende Expressionsverfahren ein Produkt mit der gewünschten natürlichen Struktur und Konformation. Wo das Produkt pharmazeutische und/oder diagnostische (in vitro oder in vivo) Verwendung findet, wird das acetylierte Material die Immunogenizitätbei der Verabreichung an einen Gastorganismus und/oder beim Kontakt mit biologischen Proben verhindern oder auf ein Minimum reduzieren. Weiterhin sind acetylierte Polypeptide normalerweise stabiler und widerstandsfähiger gegenüber dem Abbau durch Proteasen und erfreuen sich somit einer größeren Lebensdauer in Zellen, Blut oder Körper- und Gewebeflüssigkeiten.
Das strukturelle Gen für hSOD oder andere Polypeptide schließt eine Acetylierungssignalsequenz an ihrem 5'-Ende ein, diese Signalsequenz veranlaßt einen Hefeexpressionsorganismus zur Bewirkung der Acetylierung. Die Acetylierungssignalsequenz kodiert mindestens die ersten zwei N-terminalen Aminosäuren in dem Polypeptid. Die erste Aminosäure ist entweder Alanin, Glycin oder Serin, die zweite Aminosäure dagegen ist eine polare oder aromatische Aminosäure, normalerweise Threonin, Serin, Asparaginsäure oder Phenylalanin.
Die Aminosäuren können die natürlichen N-terminalen Aminosäuren sein, die normalerweise in dem zu exprimierenden Polypeptid vorhanden sind. Dies ist der Fall bei hSOD, wo die ersten zwei Aminosäuren Alanin und bzw. Threonin sind. Andere natürlich-acetylierte Proteine, die in Hefe exprimiert und acetyliert werden können, schließen die folgenden ein: Protein Quelle Signalsequenz
Cytochrom C Mensch, Rhesus- GLY-ASP
Affe, Hund
Pferd usw
CythochromC Rizinus, Sesam ALA-SER
Mung-Bohne usw.
Glutamat- .. Neurospora SER-ASN
dehydrogenase
Calmodulin Schwein SER-ALA
Myosin
(leichte A 2-Kette) — . SER-PHE
ADH Drosophila SER-PHE
Die vorliegende Erfindung läßt sich auch für die Acetylierung von Polypeptiden und Proteinen anwenden, die nicht natürlich acetyliert sind. Die Acetylierung kann erreicht werden, indem man die Acetylierungssignalsequenz mit dem 5'-Ende des strukturellen Gens für das Polypeptid verbindet. Die Acetylierungssignalsequenz kodiert für mindestens 2 Aminosäuren (wie oben beschrieben) und kann bis zu 10 oder mehr Aminosäuren kodieren, vorzugsweise weniger als 5 Aminosäuren. Die Zugabe von weniger Aminosäuren ist normalerweise erwünscht, um eine Störung oder einen Verlust einer gewünschten Aktivität des Polypeptids zu begrenzen. Zweckmäßigerweise wird die Signalsequenz synthetisiert und mit dem strukturellen Gen verbunden, und zwar unter Verwendung bekannter Techniken.
Als Alternative zur Zugabe der Acetylierungssignalsequenz zu dem strukturellen Gen ist es manchmal möglich, das 5'-Ende des strukturellen Gens zu modifizieren, um eine oder beide der ersten zwei Aminosäuren des Polypeptids zu substituieren. Diese Modifizierung kann mittels einer Vielzahl von üblichen Methoden erreicht werden. Zum Beispiel kann das strukturelle Gen in der Nähe seines 5'-Ende restriktioniert werden, um eine bekannte Anzahl von Nucleotiden zu entfernen. Ein synthetisches Oligonucleotid kann dann an das kohäsive Ende, das nach der Restriktion zurückbleibt, angekoppelt werden. Das Oligonucleotid stellt in der erforderlichen Weise die Basenpaare wieder her und substituiert diese, um die gewünschte Acetylierungssignalsequenz zu schaffen. Alternativ hierzu kann eine ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung z. B. der Phage M13, verwendet werden, um eine geeignete Modifizierung an dem 5'-Ende des strukturellen Gens zu bewirken. Um hSOD herzustellen, ist es erforderlich, daß man über eine DNS-Sequenz verfügt, die für hSOD kodiert. Eine Methode zur Erreichung dieser Sequenz besteht darin, cDNS aus Messenger-RNS aus hSOD produzierenden Zellen zu klonieren. Zweckmäßigerweise werden menschliche Leberzellen zu diesem Zweck verwendet. Nach Klonierung der cDNS, wobei die DNS-Kodierungssequenz unbekannt, jedoch mindestens eine partielle Aminosäuresequenz bekannt ist, kann man dann die cDNS mit Mischungen von Proben „screenen", vobei die Proben sämtliche der möglichen Nucleotidvariationen, die für die spezielle Serie von Aminosäureresten kodieren, aufweisen.
Die Auswahl der Reste, für die die Sequenz kodiert, ist in gewissem Umfang willkürlich, obwohl die ausgewählten Reste gewöhnlich ausgewählt sind, um die Anzahl von unterschiedlichen zu synthetisierenden Sequenzen zu minimieren. Für hSOD wird zweckmäßigerweise eine DNS-Sequenz verwendet, die mindestens für die Aminosäurereste 19—24 kodiert, insbesondere eine Probe mit mindestens etwa 15 Basen und nicht mehr als etwa 20 Basen, insbesondere etwa 17 Basen. Man läßt dann Restriktionsenzyme diejenigen Klone abbauen, die mit den markierten Proben zu hybridisieren scheinen, fraktioniert die DNS-Fragmente und wiederholt die Hybridisierung, insbesondere unter Verwendung einer zweiten Reihe von Proben, die zu DNS-Sequenzen hybridisieren, welche für eine unterschiedliche Reihe von Aminosäureresten in hSOD kodieren. Diese Aminosäurereste können zweckmäßigerweise 109-114 sein. Ein Klon oder mehrere können gefunden werden, die gegenüber beiden Proben positiv sind, und diese können als eire Quellefür cDNS verwendet werden, diefür mindestens einen wesentlichen Abschnitt von hSOD kodiert.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß die für hSOD veröffentlichten Aminosäuresequenzen in einer signifikanten Anzahl von Resten sich von der durch die cDNS kodierten Aminosäuresequenz unterschieden. Dort, wo sich die zwei veröffentlichten
Sequenzen unterscheiden (Jabusch et al.. Biochemistry [1980] 19: 2310-2316 und Barra et al., FEBS Letters [1980] 120:153-156), sind die richtigen Zuordnungen die folgenden: Rest 11, Asparaginsäure; Rest 17, Isoleucin; Rest 26, Asparagin; Rest 49, Glutamat; Rest 52, Asparaginsäure; Rest 53, Asparagin; Rest 92, Asparaginsäure; Rest 98, Serin (vgl. Fig. 4). Wegen der Ungewißheiten bezüglich der Wirkung auf die Translation der Trennung zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Translationsinitiationskodon, normalerweise AUG, liefert das hier behandelte Verfahren eine Technik zur Änderung des Abstandes und der die ribosomale Bindungsstelle von dem Initiationskodon trennenden Nucleotide. Gewöhnlich gibt es etwa 6-15, häufiger etwa 6-12 Nucleotide in dem Spacer zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Initiationskodon. Da die Basensequenz „stromabwärts" von der Initiationsstelle auch die Effizienz der Translation beeinflussen kann, schafft das erfindungsgemäße Verfahren auch die Möglichkeit, die Nukleotidsequenz (nicht jedoch die Länge), und zwar innerhalb der anfänglichen mehreren 5'-Kodons des Polypeptids, soweit dies durch die Redundanzeinschränkungen des genetischen Kods ermöglicht ist, zu variieren. Diese Degenerierung kann 4 Kodons, häufiger gewöhnlich 2 Kodons, „stromabwärts" von der Initiationstelle einschließen.
Eine Vielzahl von Linkern werden hergestellt, bei denen mindestens 2 Nucleotide, gewöhnlich mindestens 3 Nucleotide, gewöhnlich mindestens 3 Nucleotide und nicht mehr als 10 Nucleotide, gewöhnlich nicht mehr als etwa 6 Nucleotide werden, so daß sie Glieder mit jedem der 4 Nucleotide, wenn sie sich innerhalb des Spacers befinden, oder 2,3 oder 4 Nucleotiden, wie durch die Redundanz des genetischen Kodes erlaubt, wenn sie sich innerhalb des strukturellen Gens für das Polypeptid befinden, einschließen. Zusätzlich werden die Linker mit unterschiedlichen Anzahlen von Nucleotiden hergestellt, so daß eine Gruppe von Linkern geschaffen wird, die sich nicht nur in der Sequenz, sondern auch in der Länge unterscheiden. Der Unterschied in der Länge kann erreicht werden, indem man Abschnitte des Trägers während der Linkersynthese entfernt, und, soweit zutreffend, die Synthese in einer anschließenden Stufe fortsetzt, so daß man Linker erhält, die eine abgestufte Anzahl von Sequenzlängen aufweisen. Gewöhnlich unterscheidet sich das Linkergemisch in der Länge durch mindestens 1 Nucleotid und um nicht mehr als über einen Bereich von 6 Nucleotiden, gewöhnlich nicht mehr als um 4 Nucleotide.
Dies kann bequem illustriert werden, wo sich die fehlenden Basen am Ende befinden. Nach jeder Stufe wird ein Abschnitt des Trägers entfernt, und die Synthese wird mit den an den Träger gebundenen Strängen fortgeführt, wobei alle 4 Nucleotide (dNTP) in jeder Stufe'geschaffen bzw. zur Verfugung gestellt werden. Diese Einzelstränge werden dann zu einem Einzelstrang hybridisiert, der teilweise komplementär ist, wo die variable Region ein überhängendes Ende ist. Somit erhält man eine abgestufte Reihe von Linkern mit Überhängen, die sich sowohl hinsichtlich ihrer Nucleotidsequenzen als auch ihrer Längen unterscheiden. An einem geeigneten Punkt während der anschließenden Hybridisierung, der Ligation oder der Klonierungsoperation werden die Überhangregion bzw. die Überhangregionen ausgefüllt, um doppelsträngiges Material zu schaffen, das weiterer Verarbeitung zugeführt werden kann. Dies wird gewöhnlich und bevorzugt in vitro durchgeführt, z. B. unter Verwendung des Klenow-Fragmentes der DNS-Polymerase I; alternativ kann bei bestimmten Konstruktionen der Überhang als ein Einzelstrang kloniert werden, wobei das Auffüllen in vivo in dem transformierten odertransfizierten Gastorganismus erfolgt. Die Hybridisierung zu einem komplementären Strang kann erreicht werden, indem man eine 5'-Sequenz „stromaufwärts" von der variablen Nucleotidreihe vorsieht, die komplementär zu einer in derterminalen Sequenz, an die der Linker gebunden werden soll, vorhandenen Sequenz ist. Die fehlenden Basen können dann in vitro oder in vivo aufgefüllt werden.
Die Linker schließen innerhalb ihrer Sequenz mindestens einen Abschnitt der Region zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Initiationskodon ein, vorzugsweise die zu dem Initiationskodon proximalen Nucleotide. Der Linker kann auch das Initiationskodon und Abschnitte des strukturellen Gens, der ribosomalen Bindungsstelle sowie Basen „stromaufwärts" von der ribosomalen Bindungsstelle, die gegebenenfalls die Transkription regulierende Sequenzen enthalten können, einschließen. Gewöhnlich umfaßt der Linker mindestens etwa 5 Basen, insbesondere mindestens etwa 20 Basen, und gewöhnlich nicht mehr als 200 Basen, insbesondere nicht mehr als etwa 100 Basen. Wenn der Linker größer als etwa 35 Basen ist, wird er gewöhnlich zusammengesetzt, indem man einzelsträngige Sequenzen von etwa 10 bis 35 Basen verwendet, die mit lediglich einem Teil eines komplementären Stranges homolog sind; dadurch wird für komplementäre überlappende Sequenzen mit Überhängen gesorgt, so daß die verschiedenen Einzelstränge hybridisiert und ligiert sowie der degenerierte und/oder mit variablen Längen versehene Übergang, wie oben angegeben, aufgefüllt werden kann, um den gewünschten Linker mit kohäsiven und/oder stumpfen Enden herzustellen.
Wenn das strukturelle Gen eine geeignete Restriktionsstelle aufweist, gewöhnlich nicht mehr als etwa 50 Basen „stromabwärts" von dem Initiationskodon, kann ein das strukturelle Gen enthaltendes Fragment restriktioniert und mit einem komplementären kohäsiven Ende des Linkers verbunden oder zur Schaffung eines stumpfendigen Endes aufgefüllt werden, wobei das stumpfe Ende mit einem stumpfen Ende des Linkers verbunden werden kann. Der Linker wird so aufgebaut, daß gewährleistet ist, daß das strukturelle Gen vollständig ist und sich in einem lesbaren Rahmen mit dem Initiationskodon befindet.
Wie bereits angegeben, sorgt man bei der Herstellung des Linkers dafür, daß eine Reihe von Linkern vorliegen, die eine regellose Reihe von Nucleotiden aufweisen, d. h. jedes der 4 möglichen Nucleotide in dem Kodierungsstrang (unter Berücksichtigung der oben genannten Einschränkungen durch den genetischen Kode), und die größenmäßig abgestuft sind, wobei ein Nucleotid oder mehrere, die die Region zwischen der ribosomalen Bindungssielle und dem Initiationskcdon definieren oder diesj überbrücken, fehlen. Diese Linker, die aus Einzelsträngen hergestellt werden, können mit anderen Einzel- oder Doppel-DNS-Strängen verbunden werden, um verlängerte Linker zu schaffen, die nicht nur die ribosomale Bindungsstelle, sondern Basen „stromaufwärts" von der ribosomalen Bindungsstelle einschließen. Alternativ können die Linker relativ klein sein, sie beginnen an einer Stelle innerhalb oder benachbart zu der ribosomalen Bindungsstelle und erstrecken sich „stromabwärts" zu einer Stelle an dem Initiationskodon oder innerhalb des strukturellen Gens.
Die besondere Reihenfolge zur Verbindung der verschiedenen Fragmente zur Herstellung der Verbindungen der Erfindung ist gewöhnlich nicht kritisch; zweckmäßigerweise kann das strukturelle Gen zuerst mit dem Linker verbunden werden. Diese DNS-Verbindung schließt nicht nur das strukturelle Gen, sondern auch die ribosomale Bindungsstelle und jegliche zusätzliche Nucleotide „stromaufwärts" von der ribosomalen Bindungsstelle ein. Zusätzlich können die Nucleotide und Anzahlen der Nucleotide zwischen dem ribosomalen Bindungsort und dem Initiationskodon erheblich v?niert werden. Die betreffende DNS-Verbindung wird in einem geeigneten Expressionsvektor eingeführt, der „stromaufwärts" die erforderliche Initiations-Regulationssequenzen für die Transkription aufweist, weiterhin die Beendigung der die Transkription regulierenden Sequenzen „stromabwärts" von dem Einführungsort der betreffenden DNS-Verbindung. Der Linker ist somit an seinem 5'-Ende von die
Initiation der Transkription regelnden Signalsequenzen und an seinem 3'-Ende mit mindestens einem Teil einer Kodierungsregion sowie die Transkription und Translatation beendenden Sequenzen flankiert. (5' und 3'- bezeichnen die Richtung der Transkription).
Nach der Herstellung des Plasmids oder der Virus-DNS für die Einführung in einen geeigneten Gastorganismus (dies schließt gewöhnlich bei einer geeigneten Stufe der Verfahrensschritte das Auffüllen der variablen Überhangregionen ein) wird der Gastorganismus transformiert bzw. transfiziert, sowie kloniert, die Klone werden „gestreakt", und individuelle Klone werden für die effiziente Expression selektioniert, indem man sie hinsichtlich der Produktion des gewünschten Produktes, z. B. hSOD, überprüft. Die Anzahl der zu überprüfenden Klone zur Bestimmung der unterschiedlichen Produktionsraten für das Produkt hängt ab von und ist proportional zu dem Ausmaß der Längenvariabilität sowie zu der in den synthetischen Linker eingeführten Sequenzdegeneration. Wie sich zum Beispiel aus der vorliegenden Ausführungsform ergibt, ist bei vier Längenvariablen und einer vierfachen Sequenzdegeneration bei jedem der sechs Nucleotide in dem Linker die Zahl der möglichen rekombinanten Sequenzen 5.440. Gewöhnlich werden mindestens einige hundert, vorzugsweise mehrere tausend oder mehr Klone überprüft. Die Überprüfung kann effizient durchgeführt werden, indem man Western-Blots (Entdeckung von Antikörpern bei dem Produkt) aus Gastzellkolonien oder Virusplaquen, überführt auf Nitrozellulosefilter oder andere geeignete Materialien, verwendet. Alternativ kann man die Elektrophorese einsetzen und eine Vielzahl von Bahnen vorsehen, wobei jede Bahn ein individueller Klon ist; es kann ein sofortiger und direkter Vergleich durchgeführt werden, um zu ermitteln, welche Klone am wirksamsten in der Expression sind, und zwar durch Sichtbarmachung der Intensität der Anfärbung, durch Autoradiographie oder durch Prüfung der Produktbande im Westem-Blot-Test. Diese Überprüfung wird gewöhnlich ausreichen, obwohl weitere quantitative Immunoassays oder Enzym-assays eingesetzt werden können, soweit dies erforderlich bzw. geeignet ist. Falls erwünscht, kann die aufgebaute Verbindung in einen anderen Gastorganismus überführt werden, der die Regulationssignale der Expressionsverbindung oder der durch Einführung von erforderlichen Regulationssignalen an geeigneten Stellen modififzierten Expressionsverbindung erkennt, so daß man eine wirksame Expression in einem alternativen Gastorganismus schafft. Falls erwünscht kann das hSOD-Gen mit sekretorischen Führungs- und Verarbeitungssignalen verbunden werden, um für die Sekretion und Verarbeitung des hSOD zu sorgen. In der Literatur sind verschiedene sekretorische Führungs- und Verarbeitungssignale beschrieben worden; vgl. US-PS 4336336 und 4338397 sowie die anhängigen Anmeldungen No. 522909 vom 12. August 1983 und 488857 vom 26. April 1983, auf deren wichtige Teile hier Bezug genommen wird. Von besonderem Interesse als Gastorganismen sind einzellige Mikroorganismen, sowohl Prokaryonten als auch Eukaryonten, wie zum Beispiel Bakterien, Algen, Fungi und dergleichen. Insbesondere können E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, Streptomyces, Neurospora als Gastorganismen verwendet werden.
Für die Verwendung in einzelligen Mikroorganismen steht eine breite Vielfalt von Vektoren zur Verfügung, wobei diese Vektoren von Plasmiden und Viren abgeleitet sind. Die Vektoren können Einzelkopie- oder niedrige oder hohe Vielfachkopie-Vektoren sein. Die Vektoren können für die Klonierung und/oder Expression verwendet werden. In Anbetracht der einschlägigen Literatur über Vektoren, die Handelsüblichkeit zahlreicher Vektoren und sogar Katalogen, die Vektoren und ihre Restriktionskarten sowie Eigenschaften beschreiben, ist hier keine tiefgreifende Diskussion erforderlich. Es ist bekannt, daß die Vektoren normalerweise Marker einschließen, die die Selektion gestatten; diese Marker können Resistenz gegenüber cytotoxischen Agentien, Prototrophie oder Immunität schaffen. Häufig ist eine Mehrzahl von Markern vorhanden, die für unterschiedliche Eigenschaften sorgen.
Zusätzlich zu den Markern weisen die Vektoren ein Replikationssystem auf. Expressionsvektoren weisen zusätzlich gewöhnlich die Regulationssignale sowohl für die Initiierung als auch für die Terminierung der Transkription auf, z.B. Promoter, die Einzelpromoter oder mehrfache Tandempromoter sein können, eine mRNS-Capping-Sequenz, eine TATA-Box, Beschleuniger, Terminatoren, Polyadenylationssequenzen sowie ein Stopkodon oder mehrere, die mit dem Terminator assoziiert sind. Für die Translation liegen häufig eine ribosomale Bindungsstelle sowie ein Stopkodon oder mehrere vor, obwohl Stopkodons gewöhnlich mit einem strukturellen Gen assoziiert sind. Alternativ können diese regulatorischen Sequenzen auf einem Fragment vorliegen, das das strukturelle Gen, welches in den Vektor eingeführt ist, enthält.
Gewöhnlich liegen eine Restriktionsstelle oder mehrere vor, die in geeigneter Weise für die Einführung des strukturellen Gens in den Expressionsvektor angeordnet sind. Nach der Einführung kann der das strukturelle Gen enthaltende Expressionsvektor in einen geeigneten Gastorganismus eingeführt werden, wobei der klonierte Gastorganismus für eine wirksame Expression von hSOD sorgt.
In einigen Fällen können spezielle Eigenschaften für den Vektor vorgesehen werden, z. B. eine Temperaturempfindlichkeit der Expression, Operatoren oder Aktivatoren für die Regulierung der Transkription und dergleichen. Von besonderem Interesse ist die Fähigkeit, die Transkription durch exogene Maßnahmen zu kontrollieren, z. B. Temperatur, Inducer, Korepressoren und dergleichen, wobei die Transkription durch eine exogene Verbindung, gewöhnlich eine organische Verbindung, induziert oder unterdrückt werden kann.
Wenn das hSOD intrazellulär hergestellt wird, können die Zellen, wenn die Zellkultur eine hohe Dichte erreicht hat, isoliert werden, zweckmäßigerweise durch Zentrifugieren. Nach der Lyse wird das hSOD durch verschiedene Techniken isoliert, z. B. durch Extraktion, Affinitätschromatographie, Elektrophorese;Dialyse oder Kcrr.binationen derselben. Wenn das Produkt sekretorisch abgeschieden wird, können ähnliche Techniken bei dem Nährmedium angewendet werden, das gewünschte Produkt liegt jedoch in einem erheblich höheren Anteil des gesamten Proteins in dem Nährmedium als in dem Zellysat vor. Das gebildete hSOD hat im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie die natürlich auftretende menschliche Superoxiddismutase und unterscheidet sich gewöhnlich um weniger als 5 Aminosäuren, insbesondere um weniger als 2 Aminosäuren. Die rekombinante hSOD (r-hSOD) zeigt im wesentlichen die gleichen biologischen Eigenschaften wie natürlich auftretende hSOD. Die biologischen Eigenschaften schließen immunologische Eigenschaften ein, wobei Antikörper, die an authentischer hSOD erzeugt wurden, über Kreuz mit r-hSOD reagieren. Bei üblichen, für hSOD verwendeten Bioasssays zeigt r-hSOD einen wesentlichen Anteil, gewöhnlich mindestens etwa 10%, vorzugsweise mindestens etwa 50%, insbesondere mindestens etwa 80%, der enzymatischen Aktivität des authentischen hSODs, jeweils bezogen auf Proteingewicht. Eine beispielhafte Assaytechnik wird von Marklund und Marklund, Eur. J. Biochem. (1974)47: 469-474, beschrieben.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung und sind nicht im Sinne einer Einschränkung zu verstehen.
In der dazugehörigen Zeichnung bedeuten:
Fig. 1: die DNS-Linkersequenz und ein Flußbild mit ihrer Verwendung; *.
Fig.2und3: Flußdiagramme der Herstellung von plot5/SOD.
Fig.4: die Sequenz sowohl des Kodierungsstranges von menschlicher SOD-cDNS (5'—» 3') und das sich ergebende Translationsprodukt.
Fig. 5: die Sequenz des isolierten menschlichen SOD-Gens, das in dem folgenden experimentellen Abschnitt beschrieben wird. Fig. 6: eine Restriktionskarte des isolierten menschlichen SOD-Gens, das in dem folgenden experimentellen Abschnitt
beschrieben wird
Experimenteller Teil
Molekulare Klonierung von hSOD cDNS.
Aus der Leber eines erwachsenen Menschen wurde eine Gesamt-RNS gewonnen, und zwar mittels der Guanidinthiocyanat/ Lithiumchlorid-Methode (Cathala et al., DNA [1983] 2:329-335). PoIyA-RNS wurde verwendet, um doppelsträngige cDNS zu synthetisieren (Maniatis et al., Molecular Cloning, 213-242, Cold Spring Harbor, 1982). Diese wurde über eine Sepharose-CL4B-Säule geschickt, um sie bezüglich cDNS größer als 350 BP anzureichern (Fiddes und Goodman, Nature [1979], 281:351-356). die cDNS wurde an der Pstl-Stelle von plot 4, eingeführt, dies ist ein pBR322-Derivat mit der folgenden, die Pstl-EcoRI-Stelle ersetzenden Sequenz:
Pstl Hinfl AIuI
1 GGTGAATCCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTC ACGTCCACTTAGGCATTAGTACCAGTATCGACAAAGGACACACTTTAACAATAGGCGAG Hphl
MndIIAlu.1
60 ACAATTCCACACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAATATTT TGTTAAGGTGTGTAATATGCTCGGCTACTAATTAACAGTTGTCGAGTAAAGTCTTATAAA
EcoRI 20 GCCAGAACCGTTATGATGCGG
CGGTCTTGGCAATACTACGCCTTAA
Für die cDNS-Einführung wurde dieOligo-dG:dC-Tailing-Methode (Maniatis et al., s.o.) verwendet. Ein E. coli-Stamm D1210 wurde mit diesem Gemisch transformiert. Die Transformanten wurden auf L-Agar selektioniert, das 10,u,g/ml Tetracyclin enthielt (Kushner, S.R. [1978] in: Genetic Engineering, Hrsg. Boyer, H.B. und Nicosia, S., [Elsevier/North Holland, Amsterdam] S. 17). Plasmid-DNS mit einer Leber -cDNS-Bibliothek wurde direkt aus ca. 62 000 rekombinanten Kolonien, plattiert bei einer Dichte von ca. 3000 Kolonien pro Petrischale mit 9cm Durchmesser, hergestellt (Maniatis et al.. Molecular Cloning, S. 86-94, Cold Spring Harbor 1982).
Isolierung von r-hSOD-Klonen.
Der Stamm D1210 wurde mit der Leber-cDNS-Bibliothek retransformiert, wobei etwa 40000 Klone auf 9 Petrischalen mit 14cm Durchmessergezüchtet wurden. Nach Übertragung der Kolonien auf Nitrocellulosepapierund Chloramphenicolverstärkung der Plasmid- DNS wurden die Zellen lysiert und die Filter für die Hybridisierung vorbereitet (Ish-Horowicz and Burke, Nucleic Acids Research [1981] 9:2989:2998). Oligonucleotidproben wurden für das Screening durch Hybridisierung verwendet, wobei die Proben aus enzymatisch radiomarkierten, chemisch synthetisierten DNS-Molekülen, komplementär zu der die Aminosäurereste 19-24 kodierenden mRNS des Proteins, bestanden (Jabusch et al., s.o.; Barraetal., s.o.); das Gemisch hatte die folgenden Sequenzen:
3' TTA AAA CTT GTT TTT CT 5'
GGCCC
wobei sämtliche der angegebenen Möglichkeiten für die Kodierung der Peptidsequenz hergestellt wurden (32fache Degeneration).
Die Proben wurden mit 32P bis zu einer spezifischen Aktivität von 1-3 x 108cpm/>g markiert und vordem Einsatz mit Millipore (0,45μπι) filtriert. Die Filter wurden 6 Stunden lang bei 3O0C in 4x SSC, 2x Denhardts-Lösung, 4OmM Natriumphosphat, pH 7,5, 300μg/ml schallbehandelter (sonicated) DNS aus Lachsgonaden (Hoden) vorhybridisiert. Die Hybridisierung erfolgte 20 Stunden bei 300C in dergleichen Lösung mit einem Gehalt an 2 χ 106cprn/ml hSOD DNS-Probe (Reste 19-24). Die Filter wurden in4x SSC gewaschen, einmal 15 Minuten lang bei Raumtemperatur und zweimal 15 Minuten lang bei 30°C, trocken geblottet und mit einem Verstärkungsschirm 24 Stunden bei -7O0C autoradiographiert.
Bereiche auf den Masterplatten, die verdoppelten positiven Signalen entsprachen, wurden in L-Brühe und Plasmid-DNS, hergestellt durch die Miniscreen-Methode (Maniatis et al.. Molecular Cloning, 178,368-369, Cold Spring Harbor 1982) überführt. Diese DNS wurde mit Pstl geschnitten und der Southem-Blot-Analyse unterworfen (Southern, J. MqI. Biol. [1975], 98:503-517), wobei anfänglich mit den zuvor markierten Proben (Aminosäureresten 19-24) hybridisiert wurde, und anschließend mit zusätzlichen radiomarkierten Proben, abgeleitet von Arninosäureresten 109-114 mit den folgenden Sequenzen (alle mögliche Variationen, 72fache Degeneration), vorliegend als ein Gemisch:
3' CTA GTA ACA TAA TAA CC 5' G G GG G T T
Ein Plasmidpool (pSOD1) enthielt einen cDNS-Einsatz von 520BP, der mit beiden Proben hybridisierte. Nach Reinigung der Kolonie wurde Plasmid-DNS aus diesem Klon hergestellt und nach der Methode von Maxam und Gilbert (Proc. Natl. Acad. Sei. USA [1977] 74:560-564) mit den aus Fig. 4 ersichtlichen Ergebnissen sequenziert. Der hSODcDNS-Klon pSOD1 stellt die
Kodierungsregion für die Aminosäuren 10-153 von hSOD, ein einzelnes Translationsstopkodon und eine 3' nichttranslatierte Region dar. In der Konstruktion des Expressionsvektors ist die Basensequenz der die Aminosäuren 1-9 kodierenden Region daher abgeleitet von der publizierten Aminosäuresequenz des hSOD (Jabusch et al., s.o.; Barra et al., s.o.) und chemisch als ein Teil des variablen Linkersegmentes (siehe unten) synthetisiert
Konstruktion des Plasmids plot5- (vgl., Fig. 2 und 3).
Das Plasmid ploti, enthaltend einen hybriden trp-lac („tac")-Promoter (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA [1983] 80:21-25) wurde durch Gelisolierung des 180B.P. HgiA-Tagl-Fragmentesdes ptrpLI (Edman et al.. Nature [1981] 291:503-506) und des 58BP Hpall-EcoRI-Fragmentes aus pKB268 (Backman and Ptashne, Cell [1978] 13:65—71) sowie Ligation dieser Fragmente zu pBR322, abgebaut mit Pstl und EcoRI, konstruiert. Das erhaltene Plasmid wurde verwendet, um den Stamm D1210zu transformieren, und Klone wurden bezüglich derTetracyclinresistenzselektioniert. Das Plasmid plot3 wurde durch Gelisolierung des 155BP Fnu4Hi-EcoRI-Fragmentes von ploti, enthaltend den tac-Promoter, wobei die Fnu4HI-Stelle unter Verwendung des Klenow-Fragmentesder DNS-Polymerase I („pol I K" oder „pol. Kien.") endpassend gemacht wurde, und aus dem 18BPEcORl-Pstl-Polylinker-Fragment von πΑΝ7 der folgenden Sequenz:
EcoRI Hindlll
51 AATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGATCTCTAGA
3' GGGCCCCTAGGCAGCTGGACGTCTAGAGATCTTCGA
Il
Sail Pstl
konstruiert.
Diese Fragmente wurden mit Gel-gereinigtem, mit EcoRI abgebautem pBR322 ligiert, unter Verwendung von pol IK endpassend gemacht, worauf sich der Abbau mit Pstl und die Gel reinigung anschloß. Dieses Ligationsgemisch wurde verwendet, um den Stamm D1210 zu transformieren, wobei die Selektion auf L-Agar-Platten, enthaltend 10^g/ml Tetracyclin, erfolgte. Das Plasmid plot5 wurde hergestellt, indem man zunächst ein Plasmid mit dem 7rAN7-Polylinker als eine EcoRI-Pvull-Substitution in pBR322 konstruierte. Hierfür wurde das Plasmid πΑΝ7 mit Hindlll abgebaut und durch Auffüllen mit pol I K endpassend gemacht, und ein synthetisches, selbstkomplementäres Pvull-Linkermolekül (d(5'-CCAGCTGG-3')) wurde mit dem oben modifizierten Plasmid 77AN7 ligiert. Nach dem Abbau mit EcoRI und Pvull wurde das erhaltene 44BP-Polyklinker-Fragment (mit 4basigen Überhängen) gelisoliert und zu pBR322 als eine EcoRI-Pvull-Substitution kioniert.
Das Plasmid plot3 wurde mit EcoRI abgebaut. Nach Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolausfällung wurden die vorstehenden 5'-Enden durch Behandlung mit S 1-Nuclease endpassend gemacht (Palmiter, Biochemistry [1974] 13:3606-3615; Hallewell and Emtage, Gene [1980] 9:27-47. Nach Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolausfällung wurde die DNS mit CIaI abgebaut und durch pol I K endpassend gemacht, und das 237BP-Fragment, das den tac-Promoter enthielt, durch präparative Polyacrylamidgelelektrophorese isoliert. Dieses endpassende tac-Promoter-Fragment wurde dann an der Pvull-Stelle des pBR322-Polylinker-Plasmids (vgl. Fig.3) eingeführt, und es wurden Klone erhalten, in denen der tac-Promoter die Transkription in Richtung auf das /3-Lactamase-Gen von pBR322 richtete
Konstruktion von plot5-Derivaten, die r-hSOD exprimieren.
Die synthetischen DNS-Moleküle F(26), C(16), B(31), D(11), E (13) und 4(24) gemäß Fig. 1 wurden durch die Phosphoramiditmethode synthetisiert. Der Einzelstrang 4(24) wurde unter Verwendung sämtlicher vier Basen an jedem Ort, wo X angegeben ist, hergestellt. Weiterhin wurde Siliciumdioxid aus der Synthese des 24meren herausgenommen, so daß einzelsträngige 21 mere, 22mere und 23mere zusätzlich zu den 24meren erhalten wurden. Nach der Entfernung von dem Siliciumdioxidträger wurden die vier Mischungen in geeigneten Anteilen kombiniert, um für äquimolare Mengen eines jeden der möglichen Einzelstränge zu sorgen. Diese Mischung wurde als ein einziges Produkt in den nachfolgenden Schritten behandelt. Die Moleküle F(26), C(16), B(31) und D(11) wurden in äquimolaren Mengen zusammengemischt, 10//,g wurden unter Verwendung von T4-Poiynucleotidkinase phosphoryliert. Nach Phenol-Ether-Extraktion wurden die zusätzlichen nicht-phosphorylierten « synthetischen DNS-Moleküle 4(24) und E(13) zugegeben, so daß alle Fragmente äquimolar waren. Die äquimolare Mischung enthielt 13/ig DNS in 133/xl eines 0,3x Kinase-Puffers.
Nach dem Abkühlen durch Kühlen bei gleichmäßiger Geschwindigkeit von 70°C auf 200C innerhalb von 60 Minuten wurden die Einzelstränge zusammenligiert, und zwar mit T4-Ligase in 200/xl Ligationsmischung bei 14°C innerhalb von 4 Stunden; anschließend wurde mit Phenol-Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und die 5'-Enden von 4(24) und E(13) unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert (Maniatis et al., s.o.). Es wurde die präparative Polyacrylamidgelelektrophorese verwendet, um das vollständig ligierte 53BP-Material mit 5'- und 3'-Überhängen zu isolieren. Das oben genannt gereinigte Fragmentgemisch wurde dann an das 460BPTagl-Pstl-Segment der hSOD cDNS ligiert, wie in Fig. 1 gezeigt. Dieses Segment war seinerseits konstruiert worden, indem man da 454BPTagl-Alul hSOD-Fragment isolierte, es mit pol I Kendpasoend machte und es in plot5 zwischen seinen EcoRI und Sall-Stellen einführte (vgl. Fig. 3), welches in ähnlicher Weise endpassend gemacht worden war. Nach der Herstellung der Plasmid-DNS aus dieser Rekombinante wurde das 460BP Tagl-Pstl hSOD-Fragment durch präparative Polyacrylamidgelelektrophorese isoliert. Nach der Extraktion und Ausfällung wurde das 515BP-Fragment, das sich bei dem Vereinen des synthetischen Fragmentes mit dem 460BP Tagl-Pstl-hSOD-Fragmentes ergab, mit pol I K(525-528BP) aufgefüllt und anschließend mit Sail abgebaut; das erhaltene 519-522BP hSOD-Fragment wurde mit Polyacrylamidgelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde anschließend in plot5 eingeführt, welches mit mit Pvull und Sail abgebaut und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Die erhaltenen Plasmide wurden verwendet, um den Stamm D1210 zu transformieren. Nach der Transformation des Stammes D1210 erhaltene Rekombinanten wurden auf L-Agar mit einem Gehalt von 100 /xg/ml Ampicillin selektioniert, wobei ein Satz von Klonen (Bezeichnung plot5/SOD) mit variabler SOD-Expression erhalten wurde
r-hSOD-Expression und plotö/SOD-Plasmid-Selektion.
Für die Analyse der gesamten E. coli-Proteine durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese wurden Übernachtkulturen 30fach in 1 ml L-Brühe verdünnt und unter Schütteln bei 37°C 90 Minuten lang bis zu einem O.D.650 von etwa 0,2 gezüchtet. IPTG (Isopropylthiogalactosid) wurde bis zu einer Endkonzentration von 2 mM zugegeben, und die Kulturen wurden weitere 3 Stunden
inkubiert. Nach dem Zentrifugieren wurde das Zellpellet erneut in 50/xl eines Puffers für die Gelbeschickung suspendiert (Laemmli, Nature [1970] 227:680—685) und durch 3fache Wiederholung des folgenden Verfahrens lysiert: 1 Minute einfrieren, 2 Minuten kochen, 10 Sekunden wirbeln (Vortexing).
Nach der Auflösung durch Elektrophorese (Laemmli, s.o.) wurden die Porteinbanden mit Coomasie-Blau angefärbt und die Menge der von jedem Klon produzierten SOD abgeschätzt; diese Ergebnisse wurden anschließend bestätigt unter Verwendung von Western-Blots mit Antikörpern gegenüber authentischer menschlicher SOD. Über dreihundert Klone wurden analysiert, sie zeigten Ausmaße derSOD-Expression, die zwischen wenig oder null bis zu geschätzten Mengen von 5-10% des gesamten löslichen Zellproteins schwankten. Ergebnisse für sechs der über dreihundert Klone sind in Tabelle 1 wiedergegeben, zusammen mit der besonderen Sequenz für das DNS-Molekül 4(24), bestimmt nach der Methode von Maxam and Gilbert, S.O. Tabelle 1: Sequenz und Menge der SOD-Produktion in E. coli
| Sequenze: | ATG GCX | ACX | ungefähres Gewicht | |
| Klon | 5'-XXXX | A | G | Prozent des Gesamtproteins |
| pSODX8 | AACA | T | G | 5% |
| pSOD11 | GTAT | A | A | 10% |
| pSODx16 | ACAT | A | A | 5% |
| pSOD5 | AATC | T | T | 10% |
| pSOD16 | ATTT | A | G | 10% |
| pSOD18 | AACT | 7,5% | ||
Für Enzym assay werden, wie vorstehend beschrieben, 100ml-Kulturen induziert. Lösliche Zellextrakte wurden hergestellt, indem Zellpellets 10 χ 20 Sekunden mit einem gleichen Volumen von Glasperlen (Braun AG; Durchmesser 0,45-0,5mm) und einem gleichen Volumen von Assaypuffer (5OmM Triscacodylat, pH 8.2, ImM Diethylentriaminpentaessigsäure) in einem 1,5ml Mikrozentrifugenrohr bei 40C durch Verwirbelung (Vortexing) behandelt wurden. Zellbruchstücke wurden pelletiert, indem man das Röhrchen eine Minute in einer Mikrozentrifuge (Beckmann) rotieren ließ. Die überstehende Flüssigkeit wurde gegen den Assaypuffer, enthaltend 1 mM jeweils Zinksulfat und Kupfersulfat, 4 Stunden lang 4°C dialysiert.
Die SOD-Assays wurden mit der Pyrogallolmethode durchgeführt (Marklund and Marklund, s.o.). In den Reaktionsmischungen wurden 0,2mM Pyrogallol in Assaypuffer verwendet, und die Reaktionsgeschwindigkeiten wurden über eine 5-Minuten-Periode unter Verwendung eines Hewlett-Packard 8450-Spektrophotometers bei 420 nm bestimmt. Es wurden vier verschiedene Assayproben hergestellt: lösliche E. coli-Extrakte; authentische hSOD; und jeweils eine der vorherigen Proben, vorinkubiert mit Kaninchenantikörpern gegenüber authentischer hSOD. Jede Probe wurde in einer Küvette eine Minute bei 25°C vor der Zugabe des Pyrogallol und der Prüfung bei 25CC inkubiert. Die Antikörperproben wurden 10 Minuten bei Raumtemperatur in Assaypuffer mit 5μΙ Antikörper präinkubiert. Diese Bedingungen erwiesen sich als ausreichend, um 100 ng reiner hSOD zu inaktivieren
Die folgende Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse für einen der untersuchten Klone (pSOD x 8):
Tabelle 2: Enzymatische Aktivität von menschlichem Cu-Zn SOD, hergestellt in E. CoIi (Stamm D1210 [pSODX8]) Enzymherstellung SOD-Einheiten/mg Protein
reines menschliches Cu-Zn SOD 15,384
pSODX8 Proteinextrakt 3,017
pSODX8 Proteinextrakt
vorinkubiert mit antimenschlichem 685
SOD-Antikörperaus Kaninchen plot5-Proteinextrakt 470
plot 5-Proteinextrakt
vorinkubiert mit antimenschlichem 485
SOD-Antikörperaus Kaninchen
Diese Daten zeigen, daß annähernd 15% des gesamten löslichen Zellproteins hSOD waren (unter der Voraussetzung, daß die reine menschliche Cu-Zn SOD, die als Vergleich verwendet wurde, vollständig aktiv war). Zusammengenommen mit den elektrophoretischen Daten (siehe oben), die anzeigen, daß 5-10% des gesamten löslichen Zellproteins als hSOD wanderten, hat es den Anschein, daß eine erhebliche Fraktion, vermutlich ein überwiegender Anteil des produzierten hSOD, aktiv ist. Die korrekte Sequenz des klonierten Gens wurde nach der Methode von Maxam und Gilbert, s.o., bestimmt. Zusätzlich wurden die ersten 12 Aminosäuren an dem N-Ende durch automatisierten Edman-Abbau bestimmt. Die ermittelte Sequenz der Aminosäuren war die folgende:
ALA-THR-LYS-ALA-VAL-(CYS)-VAL-LEU-LYS-GLY-ASp-GLY-
Der erste ermittelte ALA-Rest war in einer molaren Konzentration etwa gleich derjenigen des Eingabepeptids vorhanden; dies zeigt die Abwesenheit eines blockierten Aminoendes an. Dr-: CYS-Rest wurde durch die verwendete Methode Cer Aminosäureanalyse nicht gefunden, auf seine Anwesenheit wurde jedoch aufgrund der Nucleotidsequenz geschlossen. Somit wurde das (N-Formyl-)-methionin aus dem bakteriellen Expressionsprodukt entfernt, und das Material wies die korrekten Aminosäuresequenzen auf, d.h. identisch mit denjenigen, diefürzytoplasmische hSOD-Reste 1-10 beschrieben wurden, wobei jedoch der N-terminale ALA-Rest nicht azetyliert war. Weiterhin wanderte das in E. coli produzierte Polypeptid langsamer als das natürliche Protein in der 1 % Agarosegelelektrophorese (pH 8.6), die Unterschiede in der Ladung mißt (Corning Universal Electrophoresefilm, angefärbt gemäß Clausen, Immunochemical Technique, S. 530-531), auch dies zeigt das Fehlen des Acetylierung. Zusätzlich zeigen Analysen der Trypsinpeptide sowohl bei dem bakteriellen hSOD-Polypeptid und dem gereinigten, authentischen (acetylierten) natürlichen Protein, daß alle Trypsinpeptide identisch sind, mit der Ausnahme des N-terminalen Peptids, das unterschiedlich wandert, d. h. mit einer Ladung, die für ein Peptid ohne N-Acetylgruppe zu erwarten ist.
Expression in Hefe.
Für den Transfer des r-hSOD-Gens auf einen Hefevektor wurden die plot5/SOD-Plasmidklone bezüglich eines Ncol-Restriktionsortes an dem 5'-Ende der Kodierungsregion überprüft. Für diese Plasmide, bei denen die variablen Nucleotide in
5'-Stellung zu dem ATG-Initiationskodon CC sind, schafft die Sequenz CCATGG eine Ncol-Stelle. Die Klone wurden geprüft, und sin Klon wurde ausgewählt und phSOD bezeichnet.
Das Plasmid phSOD wurde mit Ncol und Sail abgebaut; es wurde ein 55OBP-Fragment erhalten, das ein nichttranslatiertes Nucleotid am 5'-Ende und die gesamte Kodierungsregion für hSOD einschloß. pPGAP (ein Hefeexpressionsvektor, der den GAP-Promotor trägt, hergestellt wie unten beschrieben) wurde mit Ncol und Sail abgebaut, gefolgt von einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase und dem Sall-Ncol-Fragment, substituiert für das Ncol-Sall-Fragment in pPGAP zur Bildung von pPGAPSOD.
Der BamHI-Abbau von pPGAPSOD führte zu einem 2kb-Fragment, das gel-isoliert wurde und an der BamHI-Stelle von pC1 /1 und pC1/1 GAL4/370 eingeführt wurde, wobei die Plasmide pC1 /1GAPSOD bzw. pC1 /1GALGAPSOD erhalten wurden.
Das Plasmid pC1 /1 ist ein Derivat des pJDB219 (Beggs, Nature [1978] 275:104), in dem die Region, die dem bakteriellen Plasmid pMB9 in pJDB219 entspricht, durch pBR322 in pC1 /1 ersetzt ist. Für die Herstellung eines Expressionsvektors mit sekretorischen und Verarbeitungssignalen, vgl. U.S.-Anmeldung Nr. 522,909. Das Plasmid pC1 /1GAL4/370, ein regulierbarer Hefeexpressionsvektor, der die GAL1/GAL10-Regulierungsregion enthält (kontrolliert durch das GAL4-Genexpressionsprodukt) wird wie im folgenden beschrieben erhalten.
Die Plasmide pC1 /1GAPSOD und pC1 /1GALGAPSOD werden in den Hefestamm 2150-2-3 (erhältlich von Lee Hartwell, University of Washington) transformiert, wie dies vor kurzem beschrieben wurde (Hinnen et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA [1978] 75:1929-1933), wobei die Ergebnisse der Expression in der folgenden Tabelle 3 wiedergegeben sind.
Tabelle 3: Expression von menschlichem SOD im Hefestamm 2150
Plasmid Kohlenstoffquelle . SOD2
μ/mg Protein
pC1/1 g,L1 0
pCl/1 GAPSOD 148
pC1/1 GALGAPSOD g,L 0,4
gal 68
1 Alle Kulturen gezüchtet in Minus-Leucin-Medium mit 2% Milchsäure, 3% Glycerin mit oder ohne 2% Galactose zur spaten logarithmischen oder frühen stationären Phase
2 bestimmt durch RIA. —:
Die hSOD-Spiegel wurden unter Verwendung eines Standard-Radioimmunoassays mit iodiertem authentischen hSOD als Standard gemessen. Die konstitutive Synthese aus dem GAP-Promoterführt zu sehr hohen Niveaus der hSOD-Produktion in der Größenordnung von 10-30% des gesamten Zellproteins. Die Induktion mit Galactose arbeitet fast ebenso gut und ergibt etwa 7% des Zellproteins als hSOD.
Wenn hSOD bei diesen hohen Niveaus gebildet wird, ist es gewöhnlich erforderlich. Zink- und Kupferionen dem Produktprotein als prosthetische Gruppe zuzusetzen, um die volle enzymatische, i.e. katalytische Wirksamkeit wieder herzustellen, z. B. durch Dialyse gegen 1 mM-Lösungen von sowohl Zink- als auch Kupfersulfat. Alternativ können Zink- und/oder Kupferionen in zehn Züchtungsmedien gegeben werden; dieses Verfahren schafft auch ein Mittel für die Selektierung für Stämme, die hohe Spiegel an hSOD bilden und/oder den Verlust von Plasmidvektoren, die hSOD in sonst nicht-selektiven Medien exprimieren, vermeiden.
Konstruktion von pPGAP.
pGAP1,ein Plasmid, das durch Insertion eines Hindlll-Fragmentes enthaltend das GAPDH-Gen GAP49 (Holland and Holland, J. Biol. Chem. [1979] 254: 5466-5474), eingesetzt an der Hindlll-Stelle des pBR322, hergestellt worden war, wurde mit Hinfl abgebaut, es wurde ein 500 BP-Fragment isoliert. Das Fragment wurde mit Bal31 zurückgeschnitten, um etwa 50 oder 90 BP zu entfernen, daran schloß sich eine Ligation mit Hindlll-Linkern und ein Abbau mit Hindll! an. pBR322 wurde mit Hindll! abgebaut, gefolgt von einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase, dann wurde das etwa 450 oder 410 BP-Fragment eingeführt; um pGAP128zu schaffen.
pGAP128 wurde mit Hindill abgebaut, das Fragment endpassend mit dem Klenow-Fragment und dNTPs gemacht und das erhaltene 450 BP-Fragment durch Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde in plotö, abgebaut mit Smal, eingeführt, welches mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war, wobei man das Plasmid plot5pGAP128 erhielt, das etwa -400 bis +27BP des GAPDH-Promoters und die Kodierungsregion enthielt.
Der Hefeexpressionsvektor pPGAP, der einen Polyrestriktionsstellenlinker zwischen der GAPDH-Terminator und einer kurzen Promoterregion aufweist, wurde wie folgt hergestellt. Das Plasmid plot5pGAP128 wurde mitBamHI undTagl abgebaut, wobei man ein annähernd 390BP BamHI-Tagl-Fragment mit den -400 bis -26 BP des GAPDH-Promoters erhielt. Das BamHI-Tagl-Fragment wurde mit einem synthetischen Fragment, enthaltend -25 bis -1 BP des GAPDH-Promoters und verschiedene Restriktionsstellen einschließlich Ncol, sowie mit der folgenden Sequenz ligiert: CGA2TA3(CA)3TA3CA3CACCATG3A2T2CGt2AG2
T2AT3(GT)3AT3GT3GTGGTAC3T2A2GCA2TC2AGCt
Dabei erhielt man ein BamHI-Sall-Fragment, das mit BamHI und Sail abgebaut wurde und zum Ersatz des BamHI-Sall-Fragmentes von mit BamH! SJI abgebautem pBR322, behandelt mit alkalischer Phosphatase, verwendet würde. Nach der Ligation wurde das Plasmid pGAPNRS erhalten, das mit BamHI und Sail abgebaut wurde, wobei man ein 400BP BamHI-Sall-Fragment erhielt, das gelisoliert wurde. Dieses Fragment wurde mit einem 900 BP Sall-BamHI-Fragment ligiert, welches die GAPDH-Terminatorregion und ein kurzes Segment einer 3'-kodierenden Region enthielt, und das erhaltene 1,4KB BamHI-BamHI-Fragment wurde mit BamHI abgebaut. Das Sall-BamHI-GAPDH-Terminatorfragment wurde erhalten durch Abbau von pGAP2 mit Sail und BamHI, ein Plasmid, hergestellt durch Insertion eines etwa 3,3 KB-BamHI-Fragmentes enthaltend das GAPDH-Gen GAP49 (Holland und Holland, s. o.), an die BamHI-Stelle von pBR322. Die Plasmide pGAP2 und pGAP1 wurden wie folgt erhalten: Eine Hefegenbibliothek wurde hergestellt, indem Fragmente, erhalten nach teilweisem Abbau von Gesamthefe-DNS mit der RestriktionsendonukleaseSau3A in Lambda-Phagen Charon 28 (Blattner et al., Science *1977] 196:161-169) eingeführt wurden. Die Phagenbibliothek wurde mit DNS, komplementärzu der Hefe-GAPDH-mRNS, geprüft, und das Hefe-GAPDH-Gen von einem dieser Klone wurde subkloniert, und zwar entweder als ein etwa 3,3 KB BamHI-Fragment an dem BamHI-Ort des pBR322 (pGAP-2), oder als ein etwa 2,1 KBHindlll-Fragment an dem Hindlll-Ort von pBR322 (pGAP-1).
pBR322 wurde mit EcoRI und Sail abgebaut, die Termini wurden mit stumpfen Enden versehen und mit BamHI-Linkern ligiert, gefolgt von einem Abbau mitBamHI. Das BamHI-BamHI-3,8KB-Fragment wurde gelisoliert, durch Selbstligation rezirkularisiert,
kloniert und pBRA RI-SaI bezeichnet. Das 1,4KB-BamHI-BamHI-Fragment wurde in den BamHI-abgebauten, mit alkalischer Phosphatase behandelten pBRA R1-Sal-Vektor eingeführt, wobei man das Plasmid pPGAP mit etwa 5,3 KB erhielt, das in einer dem ampr entgegengesetzten Richtung orientiert war.
Konstruktion von GAL-enthaltenden, regulierten Plasmiden.
Das Plasmid pLGSD5 wird wie von Guarente et al., (1982), s.o., beschrieben hergestellt. Das Plasmid wird wie folgt bearbeitet:
Nach der Restriktion mitXhol wurden die Überhänge mit dem Klenow-Fragment der DNS-Polymerase I („Klenow-Fragment") aufgefüllt, mit EcoRI-Linkern (GGAATTCC) ligiert und anschließend vollständig mit EcoRI und Sau3A abgebaut, wobei man ein 370BP-Fragment erhielt, das durch Gelelektrophorese isoliert wurde. Es enthielt die Intergensequenz zwischen den GAU- und GAL10-Genen der Hefe und liefert die GAL4-Regulationssequenz der GAL1-und GAL10-Gene.
Dieses Fragment wurde in pBR322 eingeführt, das vollständig mit EcoRI und BamHI abgebaut worden war, gefolgt von einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase zur Verhinderung der Oligomerisierung. Man erhielt das Plasmid pBRGAL4.
Das Plasmid pBRGAL4 wurde vollständig mit Sau3A abgebaut, die Überhänge wurden mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt, und die erhaltenen stumpfendigen Fragmente mit Sall-Linkern (CGTCGACG) ligiert. Daran schloß sich ein Abbau mit Sail und Xhol an. Das erhaltene 370 BP-Fragment wurde durch Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment weist die Original-370 BP-Hefe-GAL4-Regulatorsequenz mit Xhol- und Sall-Termini auf.
Das Fragment wurde anschließend in das Plasmid plot5 kloniert. plot5 wurde hergestellt, indem man das 40 BP-Polylinkerfragment der folgenden Sequenz
EcoRI BamHI BgIII Xbal Hindlll
BgII
5' AATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGATCTCTAGAAGCTTCAG 3' GGGCCCCTAGGCAGCTGGACGTCTAGAGATCTTCGAAGTC
111 I
Smal Sail Pstl PvuII
in pBR322 als eine EcoRI-Pvull-Substitution einführte, gefolgt von einer Insertion des trp-lac-Promotors (Russell and Bennett, Gene [1982] 20:231-245) an den Pvull-Ort unter auf die Polylinker-Sequenz orientierter Transkription, plotö wurde vollständig mit Sail abgebaut, gefolgt von einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase. Das 370 BP-Fragment wurde in plot5 eingeführt, wobei man das Plasmid plot5GAL4/370 erhielt. Dieses Plasmid wurde dann vollständig mit BamHI und Sail abgebaut, um das individuelle Fragment, verlängert durch 6BP des Polylinkerfragments, zu reproduzieren. Dieses Fragment wurde dann mit pC1/1 ligiert, das vollständig mit BamHI und Sail, gefolgt von einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase zur Verhinderung der Rezirkularisierung, abgebaut worden war. Das erhaltene Plasmid wurde pC1/1GAL4/370 bezeichnet. Das BamHI-Sall-Fragment ist in dem pBR322-Abschnitt des Vektors pC1/1 angeordnet.
Das in Hefe hergestellte phSOD-Polypeptid erwies sich als identisch mit dem natürlichen menschlichen Protein. Die Migration von in Hefe hergestellter hSOD war identisch mit dem Protein sowohl bei der Polyacrylamidgelelektrophorese (mit oder ohne Natriumdodecylsulfat) als auch in der Agarosegelelektrophorese (s.o.). Wenn man weiterhin hochgereinigtes Hefepolypeptid zwölf Zyklen eines Edman-Abbaus unterwirft, ist die Sequenz die gleiche wie die für das menschliche Protein (Reste 1-10), hergestellt in E. coli wie oben beschrieben, berichtete. Das Meßniveau ist jedoch lediglich 5 bis 10% des erwarteten Niveausauf molarer Basis, bezogen auf Proteininput. Dieses verminderte Meßniveau zeigt, daß die N-terminale Aminosäure blockiert ist, d.h. wahrscheinlich acetyliert.
Das Ergebnis wurde durch Vergleichsanalysen von Trypsinpeptiden, abgeleitet von Hefe-produziertem hSOD und authentischem acetyliertem menschlichen Material, bestätigt, die zeigen, daß alle erwarteten Trypsinproteine in den zwei Proben einschließlich derjenigen der N-terminalen Verbindung identisch sind. Dies zeigt die Anwesenheit von acetyliertem N-terminalem ALA in dem Hefeexpressionsprodukt
Isolierung des menschlichen SOD-Gens
Zur Isolierung des menschlichen SOD-Gens wird eine Bakteriophagen-Lambda-Bibliothek, die das menschliche Genom wiedergibt (R. Lawn et al. [1978] Cell 15: 1157-1174) mit einer radiomarkierten DNS-Probe, hergestellt aus dem menschlichen SOD cDNS, geprüft. Es wurden eine Million Phagenplaquen geprüft, und 13 positiv hybridisierende Plaquen wurden gereinigt. Die Restriktionsendonuclease-Analyse der Phagen-DNS zeigt, daß mindestens 5 verschiedene Gene auftreten. Dies legt nahe, daß es andere SOD-Verwandte Gene und Genprodukte gibt. Ein Kandidat für ein solches Gen ist die kürzlich entdeckte extrazelluläre Cu/Zn SOD (S. Marklund, [1982] Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79: 7634-7638). Zur Unterscheidung des authentischen zytoplasmischen Cu/Zn-SOD-Gens von den verwandten Genen verwendeten wir synthetische DNS-Proben ö'-AATGCTTCCCCACACC-S' und 5'-CTCAGTTAAAATGTCTGTTtG-S', dip den Aminosäureresten 19-26 bzw. den Nucleotiden " P3—213 3' von dem Terminatorkodon in der 3'-untranslationierten Region entsprechen. Lediglich eine der 13 genomischen DNS hybridisierte mit diesen Proben; dies zeigt an, daß es das authentische menschliche zytoplasmische SOD-Gen ist. Dies wurde durch DNS-Sequenzanalyse der N-terminalen Region bestätigt, wie sich aus Figur 5 ergibt, in der die Aminosäuresequenz, bestimmt durch Proteinsequenzierung, bestätigt wird. Dies zeigt auch, daß kein Präprotein für SOD existiert, da 9 Nucleotide 5' von dem Initiator-Methionin-Kodon ein in-frame-Terminationskodon existiert. Wie sich aus Figur 5 ergibt, enthält das menschliche Cu/Zn-SOD-Gen intervenierende Sequenzen. Die Karte des SOD-Gens gemäß Figur 6 zeigt, daß es mehr als eine intervenierende Sequenz gibt.
Claims (5)
- (1) einen Promoter,1. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz wie der menschlichen Superoxiddismutase, gekennzeichnet dadurch, daß das Polypeptid in E. coli oder S. cerevisiae hergestellt wird.
- (2) eine ribosomale Bindungsstelle,2. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß der Mikroorganismus eine für ihn funktioneile DNS enthält, die in „Stromabwärts"-Richtung der Transkription folgende Strukturen aufbaut:
- 3. Verfahren nach Punktk2. gekennzeichnet dadurch, daß der Abstand zwischen derribosomalen Bindungsstelle und dem Initiationskodon durch Schaffung verschiedener DNS-Brücken zwischen der Bindungsstelle und dem Initiationskodon, die sich in Länge und Zusammensetzung unterscheiden, optimiert wird, und man für die optimale Expression selektiert.(3) ein Initiationskodon,(4) ein strukturelles Gen einer menschlichen Superoxiddismutase in einem Leserahmen mit dem Initiationskodon und einem Stopkodon an dem 3'-Ende, und(5) einem Transkriptionsterminator.
- 4. Verfahren nach Punkt 2. gekennzeichnet dadurch, daß man die DNS mit einem Replikationssystem für die extrachromosomale Replikation und Stabilisierung verbindet.Hierzu
- 5 Seiten Zeichnungen
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- 1984-10-03 DD DD26795184A patent/DD234280A5/de not_active IP Right Cessation
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