DD234689A1 - Verfahren zur gewinnung von biotensiden - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Biotensiden. Das Ziel ist die Steigerung der Wachstumsrate von P. aeruginosa, verbunden mit erhoehter Exkretion von oberflaechenaktiven Substanzen. Die Aufgabe wird darin gesehen, durch verfahrenstechnische Massnahmen die Exkretion von Biotensiden durch P. aeruginosa-Staemme wesentlich zu foerdern. Die Aufgabe wird geloest durch den Zusatz von (NH4)2Fe(SO4)2 zum vorzugsweise synthetischen Kulturmedium.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von extrazellulären Lipiden, insbesondere von Rhamnolipiden, die als Bioemulgatoren Bedeutung erlangen können.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bereits bekannt, daß Stämme von Pseudomonas aeruginosa nach Wachstum auf bestimmten komplexen und synthetischen Medien Rhamnolipide in das Medium ausscheiden. Die Exkretion beginnt in der späten exponentiellen Wachstumsphase. Nach Literaturangaben sinkt die Oberflächenspannung auf einen Minimalwert von 40mN/m. Die Wachstumsdynamik der Mikroorganismen hängt von den Kultivierungsbedingungen ab. Durch eine — meist empirisch begründete — Wachstumsoptimierung wird mit komplexen Supplementen (Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt u.a.) oder mit definierten Verbindungen (anorganische Spurensalze, Vitaminen) die logarithmische Phase verkürzt und die Wachstumsrate erhöht. Die Auswahl einer geeigneten C- und N-Que!le, das C:N-Verhä!tnis sowie die Wachstumsdynamik beeinflussen in erheblichem Ausmaß Biosynthese und Exkretion von Metaboiiten. Als anorganische Spurensalze und/oder Vitamine wurden bisher vorwiegend die folgenden Verbindungen eingesetzt: Maisquellwasser/Hefeextrakt/Eisen/(ll)-sulfat, Eisen(lll)-chlorid/ Zinkillj-sulfat/ManganiiD-sulfat/KupferillJ-sulfat/CobaltilO-chlorid/Natriummolybdat/Kaliumjodid/Borssäure, Pepton. Der positive Einfluß dieser Verbindungen oder ihrer Kombinationen auf das Wachstum von P. aeruginosa ist deutlich, jedoch ist die Biosynthese von Rhamnolipid oder/und die Exkretion in das Kulturmedium — als die eigentlich erwünschte physiologische Leistung — in einigen Nährmedien teilweise oder vollständig gehemmt, in keinem Fall aber gesteigert. Die ausgeschiedenen oberflächenaktiven Verbindungen werden üblicherweise durch Extraktion mit Ether oder Ethylacetat separiert oder durch Ausfällen nach Ansäuren, wobei aber bei Anwenden der letzteren Methode ein tagelanges Stehen der Lösung in der Kälte in Kauf genommen werden muß.

Trotz vielfacher Versuche zur Verfahrensoptimierung gelingt es bisher nicht, die Exkretion von Biotensiden, insbesondere Rhamnclipiden, in tragbaren Ausbeuten bei begrenzter Kultivierungsdauer zu stimulieren.

Ziei der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, die Wachstumsrate von P. aeruginosa zu erhöhen und die Exkretion von oberflächenaktiven Substanzen zu steigern.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung hat die Aufgabe, durch verfahrenstechnische Maßnahmen die Exkretion von Biotensiden durch die eingesetzten

P. aeruginosa-Stämme wesentlich zu fördern.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß (NHa)₂Fe(SCUh einen wesentlichen wachstumsfördernden Einfluß auf P.

aeruginosa ausübt, wenn es einem vorzugsweise synthetischen Kulturmedien zugesetzt wird.

Die gestellte Aufgabe wird deshalb dadurch gelöst, daß Stämme von P. aeruginosa in einem flüssigen synthetischen Medium unter Verwendung von Glucose, Glycerol, Alkanen als Kohlenstoffquelle und Ammoniumsulfat u.a. als Stickstoffquelle gezüchtet werden. Erfindungsgemäß wird als wachstumsfördernder Zusatz Ammoniumeisen(ll)-sulfat in einer Konzentration von 0,1 bis lOOmg/l, vorzugsweise 1 bis 10mg/!, dem Kulturmedium zugesetzt.

Die Züchtung wird submers im diskontinuierlichen Verfahren bei 30⁰C vorgenommen. Der pH-Wert während der Kultivierung beträgt 6 — 7,5 Ammoniumeisen(ll)-sulfat wird dem Medium in einer Konzentration von 0,01 mg/100mi bis 10mg/100ml zugegeben.

Die Erfindung soli nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Beispiel 1

Es wird ein auf einen pH-Wert von 7,2 eingestelltes synthetisches Medium verwendet, das aus 7g K₂HPO₁I, 3g KH₂PO₄, 0,1 g MgSO₄ 7 H₂O und 1 g (NHa)₂SO₄ in 11 destillierten Wasser hergestellt wird. Als einzige Kohlenstoffquelle dient Glycerol (30 ml/!). Dieses Medium wird mit Ammoniumeisensulfat in den nachstehenden Mengen versetzt. 100 ml dieses Mediums werden in 500ml fassende Erlenmeyer-Kolben gegeben und mit einem Inoculum von P. aeruginosa 196 Aa beimpft, so daß die optische Dichte, gemessen bei 60önm, zwischen 0,03-0,05 beträgt. Das Inoculum wird durch Abschwemmen von 18h alten Schrägager-Kulturen mit synthetischem Medium gewonnen. Die Züchtung wird bei 30⁰C unter Schütteln durchgeführt. Die stalagmometrisch gemessene Oberflächenspannung des zellfreien Kulturfiltrates ist oberhalb der kritischen Micellbildungskonzentration ein Maß für die Biotensid-Konzentration. Die kritische Micellbildungskonzentration beträgt 126 mg/ I und ist, in Abhängigkeit vom Kuitivierungsverfahrsn, bei einer Oberflächenspannung zwischen 23-31 mN/m erreicht.

Tabelle 1	Züchtungs	optische	Oberflächenspan
Ammoniumeisen(ll)-	dauer	Dichte	nung
su If at	h		mN/m
mg/l	24	0,45	66,7
-	40	0,85	32,4
-	24	0,8	29,2
0,2	24	1,15	35,4
2	24	1,1	34,9
10	24	1,1	33,8
50

Beispiel 2

Beispiel 1 wird wiederholt, anstelle von P. aeruginosa 196 Aa wird mit P. aeruginosa M₂ beimpft.

Tabelle 2

Ammonium- Züchtungs- optische Oberflächen- Verdünnung

eisen(ll)- dauer Dichte spannung

sulfat

mg/l . . h mN/m 1:10

— 24 0,5 43,3

— 48 0,6 28,8 48,7 2 24 0,75

2 48 1,1 25,1 36,6

Eine Exkretion von Biotensiden erfolgt auch durch ruhende Zellen in gepufferten und belüfteten Medien mit einem Kohlenstoffsubstrat.

Beispiel 3

Beispiel 1 wird ohne Zusatz von Ammoniumeisen(ll)-sulfat wiederholt. Nach 27 h Kultivierungsdauer hat die Bakteriensuspension eine optische Dichte von 0,72 erreicht, die Oberflächenspannung des zellfreien Kulturfiltrates beträgt 6OnIWm. Die Zeilen werden unter sterilen Bedingungen geerntet und in 100ml eines sterilen Mediums folgender Zusammensetzung suspendiert 1 /15 mol/l Phospatpuffer pH = 5,0,2% Glycerol. Der Ansatz wird bei 30°C geschüttelt. Nach den angegebenen Zeiten wird ein Aliquot entnommen und nach Zentrifugation im zellfreien Überstand die Oberflächenspannung gemessen.

Tabelle 3

Zeit 19 43 67 91 115 139 163 288

Oberflächenspan nung 26,3 27,7 27,7 26,3 28,5 -28,5 29,2 32,2 32,2

Nach 19h ist das 10fache der kritischen Miceilbildungskonzentration von Rhamnolipid {1,3g/l) im Ansatz nachweisbar. Der in Beispiel 2 verwendete Stamm Pseudomonas aeruginosa M₂ trägt die Hinterlegungsnummer ZIMET 11013.

Claims (7)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Gewinnung von Biotensiden, insbesondere von Rhamnolipiden durch Kultivieren von Pseudomonas aeruginosa in flüssigen synthetischen Medien, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kulturmedium (NH^FeiS wird.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm P. aeruginosa 196 Aa gezüchtet wird.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm P. aeruginosa M₂ gezüchtet wird.
4. 4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß submers diskontinuierlich bei einer Temperatur nahe 30^cC kultiviert wird.
5. 5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß Ammoniumeisen(ll)~sulfat in Mengen von 0,1 bis 100mg/l zugesetzt wird.
6. 6. Verfahren nach Punkt 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Ammoniumeisenfllj-sulfatkonzentration 1 bis 10mg/l beträgt.
7. 7. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß Zeilen von P. aeruginosa in einem Medium mit oder ohne Zusatz von Ammoniumeisen(ll)-sulfat bis zur nachweisbaren Exkretion von Rhammolipid angezüchtet werden nach Abtrennung vom Züchtungsmedium als ruhende Zeilen in einem gepufferten und belüfteten Medium mit einem Kohlenstoffsubstrat, z. B. Glycerol, inkubiert werden.