DD235669A1 - Verfahren zur herstellung eines blv-kodierten huellproteins - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren der Herstellung eines BLV (Bovines Leukaemievirus) - kodierten Huellproteins oder von dessen Derivaten in einem transformierten Wirt, bevorzugt in E. coli. Das Ziel besteht darin, ein gentechnisches Verfahren zur Herstellung der genannten Proteine bereitzustellen, wobei das gewinnbare BLV-Huellprotein bzw. BLV-Huellprotein-Derivat fuer die Diagnostik, Prophylaxe und/oder Therapie der enzootischen Rinderleukose einsetzbar ist. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Wirt, bevorzugt E. coli, mit einem rekombinanten Plasmid, das aus einem Replikationsursprung, einer Expressionskontrolleinheit und einer fuer ein Huellprotein oder Teilen davon kodierten BLV-Nukleotidsequenz besteht, transformiert wird, dieser Wirt isoliert und gezuechtet wird, und anschliessend das BLV-kodierte Huellprotein oder dessen Derivate aus der Kultur gewonnen werden. Die Erfindung kann in der mikrobiologischen Industrie, in der Veterinaermedizin und in der Tierproduktion angewendet werden.

Description

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23. Verfahren nach Punkten 1,4 bis 6,11 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die kodierende BLV-Hüllprotein-Nukleotidsequenz mit einer Expressionskontrolleinheit so verbunden wird, daß eine Kodierung für ein fusioniertes Protein, bestehend aus einem Teil eines Plasmid-kodierten Proteins und einem Teil eines BLV-kodierten Proteins, resultiert und daß das rekombinante Plasmid nach Transformation in einen Wirt die Proteinsynthese (Expression) eines fusionierten BLV-

_.. ... Hüllproteins bewirkt. — — -

24. Verfahren nach den Punkten 1 und 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß als kodierende BLV-Nukleotidsequenz Teilabschnitte der BLV-Hüllprotein kodierenden Nukleotidsequenz eingesetzt werden.

25. Verfahren nach den Punkten 1,4 bis 6 und 11 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß Teilabschnitte der BLV-Hüllprotein kodierenden Nukleotidsequenz nach den Punkten 5,6 und 20 eingesetzt werden, die mit anderen Protein-kodierenden Sequenzen im gleichen Leserahmen der Translation verbunden sind.

26. Verfahren nach den Punkten 1,4 bis 6,11 bis 21 und 24 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß Teilabschnitte der BLV-Hüllprotein-kodierenden Nukleotidsequenz mit einer Expressionskontrolleinheit verbunden werden, wobei das rekombinante Plasmid nach Transformation in einen Wirt die Proteinsynthese (Expression) eines partiellen BLV-Hüllproteins bewirkt.

27. Verfahren nach Punkten 1,4 bis 6,11 bis 21 und 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß Teilabschnitte der BLV-Hüllprotein kodierenden Nukleotidsequenz mit einer Expressionskontrolleinheit so verbunden werden, daß eine Kodierung für ein fusioniertes Protein, bestehend aus einem Teil eines Plasmid-kodierten Proteins und einem Teil eines BLV-kodierten Proteins, resultiert und daß das rekombinante Plasmid nach Transformation in einen Wirt die Proteinsynthese (Expression) eines fusionierten partiellen BLV-Hüllproteins bewirkt.

28. Verfahren nach Punkten 1,4 bis 6,11 bis 21 und 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß verschiedene Teilabschnitte der BLV-Hüllprotein kodierenden Nukleotidsequenz nach Punkten 5,6 und 20 kombiniert bzw. mehrfach verwendet werden.

29. Verfahren nach Punkten 1,4 bis 6,11 bis 21 und 24 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß ein bestimmten Teilabschnitt der BLV-Hüllprotein kodierenden Sequenz nach Punkten 5,6 und 20 mehrfach verwendet wird.

30. Verfahren nach den Punkten 1,3 bis 6 und 11 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß als Expressionskontrolleinheit bzw. als Teil der Expressionskontrolleinheit starke Promotoren aus Bakterien eingesetzt werden.

31. Verfahren nach den Punkten 1 und 30, dadurch gekennzeichnet, daß als starke Promotoren die frühen Promotoren des Phagen 17, der P_L- oder P_R-Lambda-Phagenpromotor, dertrp-, Lac- oder LacUV5-Promotor aus E. coli oder der ß-Lactamase-Promotor aus pBR322 eingesetzt werden.

32. Verfahren nach den Punkten 1,30 und 31, dadurch gekennzeichnet, daß als starke Promotoren sogenannte Hybridpromotoren aus den in Punkt 31 genannten Promotoren eingesetzt werden.

33. Verfahren nach Punkten 1,3 bis 6 und 11 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß BLV-Hüllprotein-oder partielles BLV-Hüllprotein— kodierende Sequenzen verbunden werden mit Nukleotidsequenzen für Plasmid-kodierte Proteine oder für Plasmid-kodierte partielle Proteine.

34. Verfahren nach den Punkten 1 und 33, dadurch gekennzeichnet, daß zur Fusion kodierende Nukleotidsequenzen für Teile der /3-Galaktosidase, ß-Laktamase, Chloramphenikol-Acetyltransferase oder der Neomycin- bzw. Kanamycin-Phosphotransferase eingesetzt werden.

35. Verfahren nach den Punkten 1,33 und 34, dadurch gekennzeichnet, daß zur Fusion kodierende Nukleotidsequenzen für Teile mehrerer, im Punkt 34 genannter Plasmid-kodierter Proteine eingesetzt werden.

36. Verfahren nach den Punkten 1,3,30 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß zum Aufbau des rekombinanten Plasmids der Hindlll-Hindll-geöffnete Kanamycinresistenz-Expressionsvektor pKM967 (ZIMET-Nr. 11 060) verwendet wird, der ein pUC9-Derivat ist, bestehend aus dem Smal-EcoRI-geöffneten pUC9-Plasmid, der Kodierung für die Kanamycin-Phosphotransferase ab 19. Aminosäure einschließlich 3'-nichtkodierender Sequenzen bis zum Smal-Ortdes Ausgangsplasmids pSV2Neo sowie bestehend aus dem Smal-EcoRI-Rest-Multiklonierungsort des Plasmids pUC19.

37. Verfahren nach den Punkten 1,3,4 bis 6,9 bis 11,13,20 bis 30,33,34 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß der Hindlll-Hindllgeöffnete Vektor pKM967 mittels Homopolymerentechnik mit dem BamHI-Smal-0,48kB-BLV-Restriktionsfragment nach Punkt 13 verbunden wird, wodurch der BLV-Hüllprotein-Expressionsvektor pKDMIO (ZIMET-Nr. 11 059) entsteht.

38. Verfahren nach den Punkten 1,3,5, 6,11,20,21 und 37, dadurch gekennzeichnet, daß ein bakterieller Wert mit dem rekombinanten Plasmid pKDM 10 transformiert, isoliert und gezüchtet wird.

39. Verfahren nach den Punkten 1,3,5, 6,11, 20, 21,37 und 38, dadurch gekennzeichnet, daß aus der bakteriellen Kultur ein fusioniertes partielles BLV-Hüllprotein gp51 gewonnen wird.

40. Verfahren nach den Punkten 1 und 37 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß Derivate des pKDMIO-rekombinanten Plasmids eingesetzt werden.

41. Verfahren nach den Punkten 1, 3 bis 6,8,9 bis 11,20 bis 30,33 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß das 1,4kB-Bcll-Kpnl-Restriktionsfragment aus pKDM10 mit dem 4,0 kB-Bcll-Kpnl-Restriktionsfragment aus penv26 verbunden wird, wobei das Kanamycin-empfindliche rekombinante Plasmid penv1026 (ZIMET-Nr. 11 063) entsteht, welches sich aus dem pUC19-Plasmid bis zum Hindlll-Ort, dem 1,2 kB Hindlll-Bcll-Fragment als Teil des 2,6kB Hindlll-Pvull-BLV-Restriktionsfragments, dem i^kB-Bcll-Kpnl-Restriktionsfragment als Teil despKDMIO-Plasmids und aus dem am Kpnl-Ort wieder beginnenden pUC19-Plasmid zusammensetzt.

42. Verfahren nach den Punkten 1,3,4 bis 8,11,13,15, 20 bis 30,33 bis 38 und 41, dadurch gekennzeichnet, daß die dem N-Terminus des BLV-Hüllproteins vorausgehende und Nicht-Hüllprotein-kodierende Sequenz des rekombinanten Plasmids penv1026durch BalSI-Exonuklease-Behandlung,ausgehend von einem Restriktionsort vor dem N-Terminus, entfernt wird.

43. Verfahren nach den Punkten 1 und 42, dadurch gekennzeichnet, daß die dem N-Terminus des BLV-Hüllproteins vorausgehende Nukleotidsequenz durch Baßi-Exonuklease-Behandlung, bevorzugt ausgehend vom Xhol-Ortdes rekombinanten Plasmids penvi 026 entfernt wird.

44. Verfahren nach den Punkten 1 und 43, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Plasmid penv1026 am Xhol-Ort geöffnet, mit Bal31-Exonuklease behandelt, mit Ligase wieder geschlossen, in einen bakteriellen Wirt transformiert und auf Kanamycinresistenz selektiert wird, wobei BLV-Expressionsplasmide der Serie pKDM25-n oder der Serie pKDM-20-n entstehen.

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45. Verfahren nach den Punkten 1,3,5,6,11,20,21 und 44, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Plasmid penv1026 am Xhol-Ort geöffnet, mit Bal31-Exonuklease behandelt, mit Ligase wieder geschlossen, in einen bakteriellen Wirt transformiert und auf Kanamycinresistenz selektiert wird, wobei das BLV-Expressionsplasmid pKDM25—101 (ZIMET-Nr. 11 058) in dem der Abstand des Hindlll-Bgllll-Abschnittes von 0,96 kB auf 0,22 kB verringert wurde.

46. Verfahren nach den Punkten 1,3, 5, 6,11, 20, 21, 44 und 45, dadurch gekennzeichnet, daß Derivate des rekombinanten Plasmids pKDM25-101 eingesetzt werden.

47. Verfahren nach den Punkten 1,3,5,6,11,20,21,23,44 bis 46, dadurch gekennzeichnet, daß aus der mit pKDM25-n, bevorzugt mit pKDM25-101, transformierten, bakteriellen Kultur ein fusioniertes BLV-Hüllprotein gp51 gewonnen wird.

48. Verfahren nach den Punkten 1,3,4 bis 6,7,8,11,13,14,15,20,21 bis 27,30 bis 35,37,41,42,43, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Plasmid penvi 026 am Xhol-Ort geöffnet, mit Bal31-Exonuklease behandelt, mitSacl-Restriktionsendonuklease nachgespalten, anschließend nach präparativer Gelelektrophorese sein 1,8 kB-Restriktionsfragment, das die Kodierung für das gp51-Hüllprotein und für die Phosphotransferase trägt, isoliert und mit dem Sing-I Sacl-geöffneten pUC19-Plasmid durch Ligase-Behandlung verbunden wird, wodurch nach Transformation eines bakteriellen Wirtes und Selektion auf Kanamycin-Resistenzdie BLV-Expressionsplasmide der Serie pKDM18-n entstehen.

49. ι Verfahren nach den Punkten 1,3,5 bis 8,11,13 bis 15,20 bis 27,30 bis 35,37,41 bis 43 und 48, dadurch gekennzeichnet, daß

das rekombinante Plasmid penv1026am Xhol-Ort geöffnet, mit Bal31-Exonuklease behandelt, mitSacl-Restriktionsendonuklease nachgespalten, anschließend nach präparativer Gelelektrophorese sein 1,8kB-Restriktionsfragment, das die Kodierung für das gp51 -Hüllprotein und für die Phosphotransferase trägt, isoliert und mit dem Sacl-geöffneten pUC19-Plasmid durch Ligase-Behandlung verbunden wird, wodurch nach Transformation eines bakteriellen Wirtes und Selektion auf Kanamycin-Resistenz das rekombinante Plasmid pKDM18-16 (ZIMET-Nr. 11 069) entsteht, in dem die BLV-gp51-Kodierung 0,1 kB nach den N-Terminus bzw. 0,16kB vordem Bglll-Ortdergpöi-. Nukleotidsequenz beginnt.

50. Verfahren nach den Punkten 1,3,5,6,11,20,21,48 und 49, dadurch gekennzeichnet, daß Derivate des rekombinanten Plasmids pKDM18-16 eingesetzt werden.

51. Verfahren nach den Punkten 1,3,5,6,11,20,21,23,48 bis 50, dadurch gekennzeichnet, daß aus der mit pKDM18-n, bevorzugt mit pKDM18-16, transformierten bakteriellen Kultur ein fusioniertes BLV-Hüllprotein gp51 gewonnen wird.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines BLV-kodierten Hüllproteins oder von dessen Derivaten in einem transformierten Wirt, bevorzugt E. coli. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die mikrobiologische Industrie, die Veterinärmedizin und die Tierproduktion. Die Anwendung der Erfindung betrifft die Diagnostik, Prophylaxe und Therapie der enzootischen Rinderleukose. _i _: —

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die enzootische Rinderleukose ist die ökonomisch bedeutendste Tumorerkrankung der Rinder. Sie wid durch das Bovine Leukämie-Virus horizontal übertragen. Der Erreger ist ein umhülltes RNA-Tumorvirus, das in Zellkultur (fötale Lammnierenzellen) propagiert werden kann.

In allen europäischen Ländern wurden umfangreiche diagnostische Maßnahmen eingeleitet, um auf dem Boden einer sicheren und einfachen serologischen Diagnostik unter Einsatz des viralen Hauptoberflächenproteins(gp51) der Virushülle als Antigen Sanierungsprogramme der verseuchten Tierbestände durch Merzung oder Separierung der infizierten Tiere durchzuführen. Eine Vakzine steht international nicht zur Verfügung. Der Preis für eine Virusvakzine auf Zellkulturbasis ist so hoch, daß dieser Weg ökonomisch nicht in Fragekommt. Hinzukommt, daß eine BLV-Vakzine wegen der Gefährlichkeit des Virus sicher inaktiviert werden muß.

Das Oberflächenantigen gp51 wird vom env-Gen (Hüllprotein-Gen) des viralen Genoms kodiert und entsteht in natürlicher Umgebung durch proteolytische Spaltung und Glykosylierung einer Vorstufe des Hüllproteins (gp51-gp30). Es sind Verfahren zur immunologischen Diagnostik von Viruserkrankungen landwirtschaftlicher Nutztiere bekannt, die auf der Verwendung von Viruspräparaten, die aus infizierten bzw. virusinfizierten Zellkulturen gewonnen werden, beruhen. Mangel der bekannten Verfahren ist ihr hoher Arbeitsaufwand, wodurch die Notwendigkeit des Erhaltene billiger Präparate von Virus-Oberflächenantigen entstand, die frei von Verunreinigungen durch andere tierische Eiweiße sind.

Der Einsatz der Gentechnik erlaubt die Lösung der gekennzeichneten Probleme der Diagnostik, der Prophylaxe und Therapie durch die biotechnologische Herstellung von BLV-Hüllprotein oder BLV-Hüllprotein Derivaten. Die molekulare Klonierung von BLV-Nukleotidsequenzen wurde erstmalig von LIEBSCHER et al. (WPC12N 153853 [1980] anhand von cDNA-und nicht integrierter linearer BLV-DNA beschrieben. KASHMIRI et al. (J. Virol. 49,583 [1984] gelang die Klonierung von zirkulärer, nichtintegrierter BLV-DNA. Der resultierende BLV-DNA-Klon enthielt die komplette und unveränderte BLV-Sequenz. NYAKATURA et al. (WP C12N 2704634) klonierten erstmalig integrierte BLV-Provirussequenzen einschließlich angrenzende zelluläre Regulationssequenzen aus Normalgewebe. Der resultierende BLV-Rekombinanten-Klon HU1 (ZIMET-Nr. 11085) enthält auch die BLV-Nukleotidsequenzen für das env-Hüllprotein. Aus diesem Grund ist er als Ausgangsmaterial für die Gewinnung der Hüllprotein-kodierten-Sequenz besonders geeignet. Aber auch ein chemisch-synthetisiertes BLV-env-Gen wäre verwendbar.

Das Problem der Diagnostik, Prophylaxe und Therapie der enzootischen Rinderleukose kann mit Hilfe gentechnischer Methoden auf prinzipiell neuem Weg gelöst werden. Durch Kopplung der kodierten BLV-env-Sequenz an eine Expressionskontrolleinheit sowie ihrer Einfügung in replikationsfähige DNA-Vektoren, z. B. Plasmide, ist es möglich, BLV-Hüllprotein in Mikroorganismen biosynthetisch herzustellen. Biosynthetisches BLV-Hüllprotein oder Hüllproteinderivate sind al antigene Substanz vielfältig für die Diagnostik, Prophylaxe und Therapie der enzootischen Rinderleukose und verwandter Viruserkrankungen einsetzbar. Ein Präparat eines mikrobiell hergestellten BLV-Hüllproteins kann als diagnostische Probe oder als ungefährliche BLV-Vakzine verwendet werden.

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International liegt bisher kein Beispiel der Expression von BLV-Hüllprotein in rekombinanten Mikroorganismen oder mit Rekombinanten-DNA-transfizierten tierischen Zeilen vor. Es gibt lediglich Beispiele für die Expression von Hüllproteinen anderer RNA-Tumorviren in Mikroorganismen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein gentechnisches Verfahren zur Herstellung von BLV-kodierten Hüllprotein oder dessen Derivaten in einem Wirt bereitzustellen, wobei das gewinnbare BLV-Hüllprotein für die Diagnostik, Prophylaxe und/oderTherapieder enzootischen Rinderleukose einsetzbar ist.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur biosynthetischen Herstellung von BLV-ködierten Hüllprotein oder dessen Derivaten in einem transformierten Wirt zu entwickeln. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man

a) einen solchen Wirt mit einem rekombinanten Plasmid, das mindestens aus einem Replikationsursprung, einer Expressionskontrolleinheit und einer für ein Hüllprotein oder Teilen davon kodierten BLV-Nukleotidsequenz besteht, transformiert. ·

b) diesen Wirt isoliert und unter Bildung einer großen Population des Wirts züchtet und

c) das BLV-kodierte Hüllprotein oder dessen Derivate aus der Kultur gewinnt.

Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet bevorzugt Mikroorganismen als Wirt, insbesondere E.coli.

Die für das BLV-Protein kodierenden Sequenzen stammen aus natürlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Nukleotidsequenzen. Eine bevorzugt eingesetzte Sequenz ist eine Nukleotidsequenzausdem BLV-Rekombinantenklon HU-1 (ZIMET-Nr. 11085) (WPC12N 2704634), die für ein BLV-Hüllprotein oder ein BLV-Hüllproteinderivat kodiert. Bevorzugterweise wird diese BLV-Nukleotidsequenz aus Plasmid-BLV-Rekombinanten-Klonen, die die Restriktionsfragmente des BLV-Rekombinanten-KlonsHUI enthalten, gewonnen.

Insbesondere wird als Restriktionsfragment das 2,6 kB-Hindlll-Pvull-Fragment eingesetzt, welches die für ein BLV-Hüllprotein kodierende Nukleotidsequenz vollständig enthält. Der N-Terminus befindet sich 0,7 kB vom Hindlll-Ort entfernt, der C-Terminus des gp51-Anteils des Hüllproteins 1,6kB vom Hindlll-Ort entfernt und der C-Terminus des gp30-Anteils des Hüllproteins 2,25 kB vom Hindlll-Ort des Restriktionsfragmentes entfernt.

Diese Daten ergeben sich aus den Sequenzdaten, die zur Nukleotidsequenz des BLV-Rekombinantenklons HU1 (ZIMET-Nr. 11085) vorliegen (WP C12N 2704634) und aus dem Vergleich eigener Restriktionsdaten mit publizierten Restriktionsdaten zu einem BLV-env-Gen aus Tumorgewebe (RICE et al.: Virology 138,82 [1984], mit Restriktionsdaten von KASHMIRI et al. (J. Virol.

49, 583 [1984] und mit den Restriktionsdaten zum BLV-HU 1-Klon (ZIMET-Nr. 11085) (WP C12N 2704634), s. Abb. 1.

Das Hindlll-Pvull-2,6kB-BLV-Restriktionsfragmentwird mit dem Hindlll-Smal-geöffneten plac-Expressionsvektor pUC19 verbunden, wobei dasRekombinantenplasmid penv26 (ZIMET-Nr. 11062) entsteht.

Ein anderes Restriktionsfragment, das 2,0kB-BamHI-Restriktionsfragment aus dem Rekombinantenklon HU1, enthält einen Teil des Hüllproteins-Gens, wobei die Kodierung an dem einen BamHI-Ort406 Nukleotide nach dem N-Terminus des env-Gens beginnt und über den C-Terminus hinaus weitere B LV-Nukleotid-Sequenzen 3'-terminal enthält. Dieses 2,0 kB-BamHI-Restriktionsfragment wird mit dem BamHI-geöffneten plac-Expressionsvektor pUC13 durch T4-Ligasebehandlung verbunden, wobei das Rekombinantenplasmid penv53 entsteht (ZIMET-Nr. 11061).

Natürlich ist es auch möglich, Restriktionsfragmente zu verwenden, die nur Teile des BLV-Hüllprotein-Gens bzw. der BLV-Hüllprotein-kodierenden-Sequenz ohne zusätzliche andere BLV-Nukleotidsequenzen enthalten. Ein solches Fragment ist das Bglll-Smal-0,63kB-Restriktionsfragment, wobei der Bglll-Ort 0,26kB vom N-Terminus des Hüilproteins entfernt liegt und der Smal-Ortsich 12 Nukleotide vor dem C-Terminus des gp51-Anteils des BLV-Hüll proteins ,befindet. Ein weiteres Fragment dieser Art ist das BamHI-Smal-0,48kB-Restriktionsfragment, wobei der BamHI-Restriktionsort 0,4kB vom N-Terminus des Hüllproteins entfernt liegt und der Smäl-Ort sich 12 Nukleotide vor dem C-Terminus desgp51-BLV-Hüllprotein-Anteils befindet.

Wenn Fragmente zum Einsatz kommen, die Nicht-Hüllprotein-kodierende-Sequenzen zusätzlich zur BLV-Hüllproteinkodierenden-Sequenz enthalten, ist es möglich, durch Bal31-Exonuklease-Behandlung die Nicht-Hüllprotein-kodierenden-Sequenzen, ausgehend von Restriktionsorten außerhalb des Hüllprotein-Gens (env), zu entfernen. Zur Entfernung der Nicht-Hüllprotein-kodierenden-Sequenz vor dem N-Terminus des Hüllprotein-Gens eignet sich der Hindlll-Ort oder bevorzugtder Xhol-Ort, der sich 0,26kB vor dem N-Terminus befindet und z.B. im Plasmid penv26 vorkommt.

Zur Entfernung der Nicht-Hüllprotein-kodierenden-Sequenz nach dem C-Terminus des Hüllprotein-Gens bzw. nach dem C-Terminus des gp30-Anteils eignet sich der pvull-Ort, der sich 0,33 kB nach dem C-Terminus befindet, bzw. nach Klonierung auch ein unmittelbar benachbarter Restriktionsprt, z. B. aus dem Multiklonierungsort des plac-Expressionsvektors pUC19 wie im Fall

desPlasmidspenv26. . ... ~~ " " "'"

Weitere Restriktionsfragmente, die sich für die Herstellung von BLV-Hüllprotein bzw. BLV-Hüllprotein-Derivaten eignen, sind das Bglll-1,2kB-Restriktionsfragment aus penv26 und das Smal-Bglll-0,6kB-Restriktionsfragment aus penv26, wobei im ersten Fall ein Bglll-Ort 0,26 kB vom N-Terminus des BLV-Hüllproteins entfernt liegt und der andere Bglll-Ort sich 50-60 Nukleotide vor dem C-Terminus des gp30-Hüllproteins befindet. Im zweiten Fall befindet sich derSmal-Ort 12 Nukleotide vordem C-Terminus des gp51-Hüllproteinanteilsbzw. 12 Nukleotide vor dem N-Terminus des gp30-Hüllproteinanteils und der Bglll-Ort 50-60 Nukleotide vor dem C-Terminus des gp30-Hüllproteins.

Ebenso wie die genannten kodierenden BLV-Hüllprotein-Nukleotidsequenzen können Nukleotidsequenzen verwendet werden, die zu den genannten Sequenzen durch Mutation, einschließlich einfacher und mehrfacher Basensubstitution, Deletion, Insertion oder Inversion verwandt sind. .

Die genannten Nukleotidsequenzen werden mindestens mit einem Replikationsursprung und einer Expressionskontrolleinheit zu einem Rekombinantenplasmid verbunden, um zu erreichen, daß BLV-Hüllprotein bzw. BLV-Hüllprotein-Derivate in einem

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transformierten Wirt hergestellt bzw. synthetisiert werden. Dabei werden in einer bevorzugten Ausführungsform die kodierenden BLV-Hüllprotein-Nukleotidsequenzen mit einer Expressionskontrolleinheit so verbunden, daß eine Kodierung für ein fusioniertes Protein, welches aus einem Teil eines Plasmid-kodierten-Proteins und einem Teil eines BLV-kodierten-Proteins besteht, resultiert und daß nach Transformation das rekombinante Plasmid die Proteinsynthese (Expression) eines fusionierten BLV-Hüllproteins in einem Wirt bewirkt. Zur Fusionierung werden bevorzugt Teilabschnitte der BLV-Hüllprotein-kodierenden-Nukleotidsequenz eingesetzt. Dabei wird so verfahren, daß diese Sequenzen mit anderen Protein-kodierenden-Sequenzen im gleichen Leserahmen der Translation verbunden sind.

Teilabschnitte der BLV-Hüllprotein-kodierenden-Nukleotidsequenz können natürlich auch direkt mit einer Expressionskontrolleinheit verbunden werden, so daß das rekombinante Plasmid nach Transformation in einen Wirt die Proteinsynthese (Expression) eines partiellen BLV-Hüllproteins bewirkt.

Außerdem ist esimöglich.verschiedeneTeilabschnitte der BLV-Hüllprotein-kodierenden Nukleotidsequenzzu kombinieren bzw. mehrfach zu verwenden oder einen bestimmten Teilabschnitt mehrfach zu benutzen.

Als Expressionskontrolleinheit bzw. als Teil der Expressionskontrolleinheit werden bevorzugt starke Promotoren eingesetzt, insbesondere die frühen Promotoren des Phagen T7, der P_L- oder PR-Lambda-Pagenpromotor, der trp-, Iac- oder lacUV5-Promotor aus E. coli aber auch der /3-Laktamase-Promotor aus pBR322. Als starke Promotoren sind ebenso Hybridpromotoren aus den genannten starken Promotoren verwendbar.

Zur Fusionierung der BLV-Hüllprotein-oder partielles BLV-Hüllprotein-kodierenden-Nukleotidsequenz werden Nukleotidsequenzen für Plasmid-kodierte-Proteine oder für Plasmid-kodierte partielle Proteine verwendet. Das sind Nukleotidsequenzen für Teile der 0-Galaktosidase, /3-Laktamase, Chloramphenikol-Acetyltransferase oder der Neomycin- bzw. Kanamycin-Phosphotransferase.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Kanamycin-Phosphotransferase zur Fusion verwendet. Hierzu wird ein speziell konstruierter Kanamycin-Resistenz-Expressionsvektor pKM967 (ZIMET-Nr. 11060) verwendet. Dieser Vektor besteht aus dem Smal-EcoRI-geöffneten pUC9-Plasmid (VIEIRA, J., und MESSING, J. Gene 19,259 1982), der Kodierung für Kanamycin-Phosphotransferase ab 19. Aminosäure einschließlich nichtkodierender 3'-terminaler Sequenzen zum Smal-Ort des Ausgangsplasmids pSV2Neo (SOUTHERN, P. J., and P. BERG, J. Mol. A ppi. Genet. 1,327 [1982]), sowie aus dem Smal-EcoRI-Rest-Multiklonierungsort des Plasmids pUC19 (YANISCH-PERRON, C. et al., Gene 33,103-119 [1985]). Dieser Vektor exprimiert die Kanamycin-Phosphotransferase unter dem plac-Promotor und vermittelt die Kanamycin-Resistenz. Anschließend wird der Hindlll-Hindll-geöffnete Expressionsvektor pKM967 mittels Homopolymerentechnik mit dem BamHI-Smal-0,48kB-BLV-Restriktionsfragment verbunden, wodurch der BLV-Hüllprotein-Expressionsvektor pKDMIO (ZIMET-Nr. 11059) entsteht. Dieser Vektor wird benutzt, um einen bakteriellen Wirt, E.coli, zu transformieren. Aus der bakteriellen Kultur ist es möglich, ein fusioniertes, partielles BLV-Hüllprotein aus dem gp51-Anteil zu isolieren. In einer Weiterführung dieser Variante werden Derivate des pKDMIO-Expressionsvektors verwendet. So wird das 1,4kB-Bcll-Kpnl-Restriktionsfragment aus pKDMIO mit dem 4,0kB-Bcll-Kpnl-Restriktionsfragmentaus penv26 verbunden, wobei das rekombinante Plasmid penv1026 (ZIMET-Nr. 11063) entsteht. Dieses setzt sich aus Sequenzen des pUC19-Plasmids bis zürn Hindlll-Ort, dem 1,2kB-Hindlll-Bcll Fragment als Teil des 2,6kB-Hindlll-Pvull-BLV-Restriktionsfragmentes, dem 1,4kB-Bcl!-Kpnl-RestriktionsfragmentalsTeildespKDMIO-Plasmidsundausdemam Kpnl-Ort wieder beginnenden pUC19-Plasmid zusammen. Das Plasmid penvi 026 exprimiert die Phosphotransferase nicht und vermittelt damit keine Kanamycinresistenz. Ursache hierfür sind die dem N-Terminus des BLV-Hüllproteins vorausgehenden Nicht-Hüllprotein-kodierenden-Sequenzen, die durch Bal31-Exonukleasebehandlung entfernt werden müssen, um zu einem Expressionsvektor zu gelangen. Ausgangspunkt hierfür ist ein Restriktionsort vor dem N-Terminus. Bevorzugt wird von dem Xhol-Ortdes rekombinanten Plasmids penvi 026 ausgegangen. Xhol-geöffnetes Plasmid penv26wird mit Bal31-Exonuklease behandelt, danach mit Ligase wieder geschlossen (ligiert), in einen bakteriellen Wirt transformiert und auf Kanamycinresistenz selektiert. Es entstehen daraus verschiedene Serien von Expressionsplasmiden,z. B. pKDM25-n oder pKDM20-n, die sich durch unterschiedliche Deletionen im Bereich zwischen Hindlll-Ort und BLV-Hüllprotein-kodierender-Sequenz des Ausgangsplasmides penv1026 auszeichnen. Ein Vertreter ist das Plasmid

pKDM25-101 (ZIMET-Nr. 11058), indem der Abstand des Hindlll-Bglll-Abschnittes von 0,96kB auf 0,22 kB verringert wurde. Dieses Plasmid und Derivate dieses Plasmids werden benutzt zur Transformation von bakteriellen Wirten, aus denen ein fusioniertes BLV-Hüllprotein-gp51-Derivat gewonnen wird.

In einer Variante hierzu wird das Xhol-geöffnete penv1026-Plasmid erneut mit Bal31-Exonuklease behandelt, danach aber mit Sacl-Restriktionsendonuklease nachgespalten, anschließend nach präparativer Gelelektrophorese ein etwa 1,8OkB-Restriktionsfragment, das die Kodierung für das gp51-Hüllprotein und für die Phosphotransferase trägt, isoliert und mit dem Smal-Sacl-geöffneten pUC19-Plasmid ligiert. Nach Transformation eines bakteriellen Wirtes und Selektion auf Kanamycin-Resistenz entstehen BLV-Expressionsplasmide der Serie pKDM18-n. Ein ausgewählter Vertreter ist das rekombinante Plasmid pKDM18-16 (ZIMET-Nr. 11069), in dem die BLV-gp5T-Kodierung 0,1 kB nach dem N-Terminus bzw. 0,16kB vordem Bglll-Ortder gp51-Nukleotidsequenz beginnt. Die Übergangsnukleotidsequenz ist in Bsp.7 angegeben. Dieses Plasmid oder Derivate davon werden benutzt zur Transformation bakterieller Wirte, bevorzugt E. coli, wobei nach Kultivierung ein fusioniertes BLV-Hüllprotein gp51 gewonnen wird.

Gegenstand der Erfindung sind neben den Verfahren zur Herstellung eines BLV-kodierten-Hüllproteins oder dessen Derivaten in einem transformierten Wirt auch die o. g. Vektoren bzw. Expressionsvektoren bzw. Rekombinantenplasmide, insbesondere:

penv26 (ZIMET-Nr. 11062) penv53 (ZIMET-Nr. 11061) pKDMIO (ZIMET-Nr. 11059) penv1026 (ZIMET-Nr. 11063) pKDM 25-101 (ZIMET-Nr. 11058) pKDM 18-16 (ZIMET-Nr. 11069) pKDM 967 (ZIMET-Nr. 11060)

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls BLV-Hüllprotein oder Teile davon oder Derivate davon, die mit den dargelegten Verfahren unter der Benutzung der beschriebenen rekombinanten Plasmide hergestellt werden.

Beispiel 1 - . ·

Konstruktion des Kanamycinresistenz-Expressionsvektors pKM967

Die DNA des Plasmides pSV2neo (SOUTHERN, P. J., und P. BERG: J. MoI. Appl. Genet. 1,327 [1982]) wurde mit BgIII- und Smal-Endonuklease gespalten. Auf dem 1,05kB-Fragrrient befindet sich das vollständige Strukturgen für die Aminoglycosid-Phosphotransferase II, welches dem Kanamycin-Resistenzgen νοηΤηδ (BECK et al. Gene 19,327 [1982]) entspricht. Das 1,05 kB-Fragment wurde in den BamHI-Smal-geöffneten Vektor pUC19 kloniert, wobei der Vektor pKM 193 entstand. Dieser Vektor wurde anschließend mit Hindlll-Endonuklease gespalten, mit Bal31-Exonuklease behandelt und danach mit EcoRI-Endonuklease nachgespalten und schließlich in den Smal-EcoRI-geöffneten Vektor pUC9 kloniert. Unter mehreren Klonen, die Kanamycinresistenz aufwiesen, befand sich der Klon pKM967. Die von diesem Klon vermittelte Resistenz betrug 120/u,g/ml, etwas geringer als im Fall des Ausgangsklons. Diese Kanamycinresistenz steht unter Kontrolle des plac-Promotors des pUC19-Plasmids. Die Bal31-Exonukleasebehandlung resultierte in einer Verkürzung des Strukturgens um 17 Aminosäuren der Phosphotransferase im Fall des ausgewählten Klons pKM967. Die Sequenz im Übergangsbereich wurde bestimmt:

CGGATCCC AGGCTA

Bam Hl -„„,„,,,

52.Bp.d.Phosphotransferase

Beispiel 2 Konstruktion des Expressionsvektors ρKDM10

Die DNA des Plasmids pKM967 wurde mit Hindill- und Hindll-Endonuklease gespalten und mittels Homopolymeren-Technik (DDR-Patentschrift 143794) mit dGTP verlängert. Das 0,48kB-BLV-Restriktionsfragment aus dem Pläsmid penv53 (s. Beispiel 4) wurde mit dCTP verlängert. Nach Hybridisation der Enden und Klonierung wurden mehr als 200 Klone isoliert. In einem Verhältnis von etwa 1:18 waren diese Klone resistent gegenüber Kanamycin. Dies entspricht der Erwartung, da mit dieser Klonierungstechnikfür das 0,48kB-BLV-Restriktionsfragment (BamHl-Smal) zwei Orientierungsmöglichkeiten und jeweils drei verschiedene Leserahmen resultieren. Ein Klon, pKDMIO, wurde ausgewählt. Dieser Klon exprimiert ein Fusionsprotein, welches N-terminal wenige Aminosäuren der/3-Galaktosidase des pUC-Vektors, danach Teilsequenzen des gp51-Anteils des Hüllproteins von BLV sowie C-terminal die Sequenzen der Phosphotransferase enthält. >

Beispiel 3 Konstruktion des Vektors penv26

Das 2,6kB Hindlll-Pvull-Restriktionsfragment des BLV-Rekombinanten-Klons HU1 (ZIMET-Nr. 11085) WP C12N 2704634) wurde durch präparative Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und in den Hindlll-Smal-geöffneten plac-Expressionsvektor pUC19 verbunden. Dieser Klon enthält die gesamte Nukleotidsequenz für das Hüllprotein sowie 5'- und 3'-BLV-Sequenzen, die das env-Gen umschließen. Durch Restriktionsanalyse mit den Enzymen BgIII, BamHI, Smal, Xhol wurde die Identität des BLV-Segments bewiesen.

Beispiel 4 Konstruktion des Vektors penv53

Das 2,OkB BamHI-Restriktionsfragment des BLV-Rekombinanten-Klons HU1 (ZIMET-Nr. 11085) (WPC12N 2704634) wurde durch präparative Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und in den BamHI-geöffneten plac-Gelektrophorese gereinigt und in den BamHl-geöffneten plac-Expressionsvektor pUC13 durch Ligasebehandlung eingefügt, wobei das Rekombinantenplasmid penv53 entstand. Die Identität wurde durch Restriktionsanalyse mit den Enzymen BgIII, Pvul und BamHI bewiesen.

Beispiel 5 Konstruktion des Vektors penvi 026

Die DNA des Plasmids pKDMIO wurde mit den Enzymen Bell und Kpnl gespalten, das 1,4kB Bcll-Kpnl-Restriktionsfragment mittels präparativer Agarose-Gelelektrophore gereinigt und durch T4-Ligase-Behandlung mit dem 4,0kB-Bcll-Kpnl-Restriktionsf rag ment aus penv26 verbunden, wobei das rekombinante Plasmid penvi 026 entsteht. Die Identität des Plasmids wurde durch Restriktionsanalyse mit den Enzymen Xhol, Smal, BgIII und BamHI festgestellt.

-/- /44 4/

Beispiele Konstruktion des Expressionsvektors pKDM25-101

Das Plasmid penv1026 vermittelt keine Expression des Fusionsproteins aus Teilen des BLV-Hüllproteins und der Phosphotransferase. Ursache hierfür sind die dem N-Terminus des BLV-Hüllproteins vorangestellten Nukleotidsequenzen vor dem env-Oen. Aus diesem Grund wird das Plasmid penvi 026 durch Xhol-Endonuklease geöffnet bzw, Linearisiert, danach mit Bal31 behandelt, wobei diese Exonuklease-Behandlung so durchgeführt wurde, daß etwa 300-400 Nukleotide von jedem Ende des Vektors abgebaut wurden. Nach T4-Ligase-Behandlung bzw. Rezyklisierung sowie Transformation wurden kanamycinresistente Klone selektiert. Ein Vertreter dieser Klone ist das Plasmid pKDM25-101, in dem der Abstand des Hindlll-Bglll-Abschnittesvon 0,96kB im Ausgangsvektor penv1026 auf 0,22 kB verringert wurde. Das Plasmid vermittelt die Expression eines Fusionsproteins, das N-terminal aus wenigen Aminosäuren der /3-Galaktosidase, gefolgt von nahezu dem vollständigen gp51-Anteil des BLV-Hüllproteins, sowie C-terminal aus der Phosphotransferase besteht.

Beispiel 7 Konstruktion des Expressionsvektors pKDM18-16

In einer Variante z. B. 6 wurde derXhol-geöffnete penvi026-Vektor erneut mit Bal31-Exonuklease behandelt, danach aber mit . dem Enzym Sacl-nachgespalten, anschließend ein etwa 1,8kB-Restriktionsfragment, das die Kodierung für das gp51-Hü|lprotein und für die Phosphotransferase trägt, isoliert und mit dem Smal-Sacl-geöffneten pUC19-Plasmid durch T4-Ligasebehandlung ligiert. Nach Transformation von E.coli JM101 wurden kanamycinresistente Klone isoliert und durch Restriktionsanalyse charakterisiert. Ein ausgewählter Vertreter ist das Plasmid pKDM18-16, in dem die BLV-gp51-Kodierung etwa 0,1 kB nach dem N-Terminus bzw. 0,16 kB vor dem Bglll-Ort der gp51-Nukleotidsequenz beginnt. Von diesem Klon wurde die DNA isoliert und die Übergangssequenz vom Multiklonierungsort des pUC19-Plasmids in die BLV-gp51-kodierende Region bestimmt:

GAG GAT CCC CAG CCC ATC CAG ACT TGG BamHI I.Aminosäure des reifen gp51-Hüllproteins

Beispiele Nachweis des BLV-env-Genproduktes durch Flüssigphasen-Konkurrenz-RIA (Radioimmunassay)

Die Isolierung und Jodierung von BLV-gp51 sowie die Durchführung des zum Expressionsnachweis verwendeten Konkurrenz-RIA erfolgte nach den von PORTETELLE et al. (Virology 105,223 [1980]) beschriebenen Methoden.

Bakterienlysate von E.coli-env-Rekombinanten (pKDM10, pKDM1816, pKDM25-101) und von Kontrollen (penv1026, penv26, JM101) wurden wie folgt gewonnen:

Bakterien bzw. transformierte Bakterien wurden im Vollmedium mit40/xg/ml Ampizillin bis zu einer Zelldichte von 1 χ 10⁸ Bakterien/ml gezüchtet, dann mit IPTG (Isopropylthiogalaktosid) stimuliert und bei einer Zelldichte von 2 χ 10 Bakterien/ml geerntet. Die Bakterien wurden konzentriert, gewaschen und durch Lysozym-EDTA-Behandlung unter Zugabe von Triton X100 lysiert. Nach Ultrazentrifugation wurden die Lysate in einer Konzentration von 10¹⁰ „Bakterien"/0,5ml Puffer aufgenommen.

Die Bakterienlysate wurden in RIA-Puffer (0,25% HSA, 0,02% Triton X-100, 0,02% Natriumazid, 15OmM NaCI, 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,4) verdünnt und in einem Konzentrationsbereich, der 10⁸—10⁹ Bakterienzellen pro Testansatz entspricht, im

RIA eingesetzt. · .

Jedem Testansatz wurden weiterhin 1,0-0,5ng 125-Jod-markiertes gp51 (ca. 20000cpm) und Anti-gp51-Serüm von Kaninchen in einer Verdünnung, bei der 30-50% des ^l25Jod-gp51 präzipitiert werden, zugesetzt. Die Proben wurden ca. 48Std. bei 4°C inkubiert. Zur Präzipitation der Immunkomplexe wurde den Proben anschließend 50-100μ,Ι Antispecies-Antiserum zugesetzt und für weiterei 0-20 Std. bei 4°C inkubiert. Die Immunpräzipitate wurden mit ca. 5 ml PBS-0,2% Triton X-100 gewaschen, durch Zentrifugation bei 3500g für 30' sedimentiert und im gamma-Strahlungsmeßgerät gemessen.

Vergleich mit einem BLV-gp51-Konzentrationsstandard.

In Lysaten derenv-Rekombinanten pKDMIO, pKDM1816, pKDM25-101 betrug die durchschnittliche Menge des mikrowellen env-Genproduktes 0,015-0,02 ng/μΙ Lysat. Durch IPTG-Zusatz verdoppelte sich diese Menge aufwerte zwischen 0,024-0,040 ng/ μ,Ι. Die Kontroll-Lysate (JM 101, penv 1026, penv26) ergaben Werte zwischen 0,002-0,007 ng/μΙ.

Claims (22)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Herstellung eines BLV-kodierten Hüllproteins oder dessen Derivaten in einem transformierten Wirt, dadurch gekennzeichnet, daß man

   a) einen solchen Wirt mit einem rekombinanten Plasmid, das mindestens aus einem Replikationsursprung, einer Expressionskontrolleinheit und einer für ein Hüllprotein oder Teilen davon kodierenden BLV-Nukleotidsequenz besteht, transformiert,

   b) diesen Wirt isoliert und unter Bildung einer großen Population des Wirts züchtet und

   c) das BLV-kodierte Hüllprotein oder dessen Derivate aus der Kultur gewinnt.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Wirt Mikroorganismen benutzt werden.
3. 3. Verfahren ifach den Punkten 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Wirt Bakterien, vorzugsweise E. coli, benutzt werden.
4. 4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für das BLV-Hüllprotein kodierende BLV-Nukleotidsequenz aus natürlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Nukleotidsequenzen stammt.
5. 5. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für ein BLV-Hüllprotein kodierende Nukleotidsequenz eine BLV-Nukleotidsequenz aus dem Lambda-BLV-Rekombinantenklon HU-1 (ZIMET-Nr. 11085) ist.
6. 6. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für ein BLV-Hüllprotein kodierende Nukleotidsequenz eine BLV-Nukleotidsequenz aus Plasmid-BLV-Rekombinanten-Klonen, die Restriktionsfragmente des Lambda-BLV-Rekombinantenklons HU-1 (ZIMET-Nr. 11 085), enthalten ist. χ
7. 7. Verfahren nach den Punkten 1,5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die für ein BLV-Hüllprotein kodierende .Nukleotidsequenz, die sich vollständig auf einem Hindlll-Pvull-2,6kB-Restriktionsfragment befindet, verwendet wird, wobei derN-TerminusO,7kBvom Hindlll-Ort, der C-Terminus des gp51 -Hüllproteins 1,6 kB vom Hindlll-Ort und der C-Terminus des gp30-Hüllproteins 2,25kB vom Hindlll-Ort des Fragmentes entfernt liegen.
8. 8. Verfahren nach den Punkten 1,5,6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Hindlll-Pvull-2,6kB-BLV-Restriktionsfragment mit dem durch Hindill- und Smal-geöffneten pLac-Expressionsvektor pUC19 durch T4-Ligase-Behandlung verbunden wird, wobei das Rekombinantenplasmid penv26 (ZIMET-Nr. 11062) entsteht.
9. 9. Verfahren nach den Punkten 1,5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die für ein BLV-Hüllprotein kodierende Nukleotidsequenz, die sich zum Teil auf einem 2,0kB-BamHI-Restriktionsfragment befindet, verwendet wird, wobei ein BamHI-Restriktionsort 406 Nukleotide vom N-Terminus des Hüllproteins entfernt liegt und das Restriktionsfragment die BLV-Hüllprotein kodierende Nukleotidsequenz von dieser Position bis zum C-Terminus des Hüllproteins und darüber hinaus weitere BLV-Nukleotidsequenzen umfaßt. . ·. .
10. 10. Verfahren nach Punkten 1, 5, 6 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß das BamHI-2,0kB-BLV-Restriktionsfragment mit dem durch BamHI-geöffneten pLac-Expressionsvektor pUC13 durch T4-Ligase-Behandlung verbunden wird, wobei das Rekombinantenplasmid penv53 entsteht (ZIMET-Nr. 11061).
11. 11.. Verfahren nach Punkten 1,5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß Restriktionsfragmente verwendet werden, die einem Teil der BLV-Hüllprotein kodierenden Sequenz entsprechen und keine anderen BLV-Nukleotidsequenzen enthalten.
12. 12. Verfahren nach Punkten 1,5,6und 11, dadurch gekennzeichnet, daß ein Bglll-Smal-0,63kB-Restriktionsfragmentverwendet wird, wobei der Bglll-Restriktionsort 0,26kB vom N-Terminus des Hüllproteins entfernt liegt und der Smal-Ort sich 12 Nukleotide vordem C-Terminus desgp51-BLV-Hüllproteins befindet.
13. 13. Verfahren nach Punkten 1,5, 6 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß ein BamHI-Smal-0,48kB-Restriktibnsfragment verwendet wird, wobei der BamHI-Restriktionsort 0,4kB vom N-Terminus des Hüllproteins entfernt liegt und der Smal-Ort sich 12 Nukleotide vordem C-Terminus desgp51-BLV-HüIlproteins befindet.
14. 14. Verfahren nach Punkten 1,5 bis 8 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß die dem N-Terminus des BLV-Hüllproteins vorausgehende und Nicht-Hüllprotein kodierende Sequenz durch Bal31-Exonuklease-Behandlung, ausgehend von einem Restriktionsort vor dem N-Terminus, entfernt wird.
15. 15. Verfahren nach den Punkten 1 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß die dem N-Terminus des BLV-Hüllproteins vorausgehende Nukleotidsequenz durch Bal31-Exonuklease-Behandlung, ausgehend vom Hindlll-Ort oder bevorzugt ausgehend vom 0,26 kB vordem N-Terminus liegenden Xhol-Ort, entfernt wird.
16. 16. Verfahren nach Punkten 1, 5 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die dem C-Terminus desgp30-BLV-Hüllproteins nachfolgende und Nicht-Hüllprotein kodierende Sequenz durch Ba13T-Exonuklease-Behandlung, ausgehend von einem Restriktionsort nach dem C-Terminus, entfernt wird.
17. 17. Verfahren nach den Punkten 1 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß die dem C-Terminus des BLV-Hüllproteins nachfolgende Nukleotidsequenz durch Bal31-Exonuklease-Behandlung, ausgehend vom Pvull-Ort, der 0,33 kB nach dem C-Terminus desgp30-Hüllproteins liegt, oder von einem dem Pvull-Ort eng benachbarten Restriktionsort aus dem Multiklonierungsort des pLac-Expressionsvektors pUC19, entfernt wird.
18. 18. Verfahren nach den Punkten 1,5 bis 8 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß ein BgIIi-1,2 kB-Restriktionsfragment verwendet wird, wobei der eine Bglll-Ort 0,26 kB vom N-Terminus des BLV-Hüllproteins entfernt liegt und der andere Bglll-Ort sich 50-60 Nukleotide vor dem C-Terminus des gp30-HüllproteinS befindet.
19. 19. Verfahren nach Punkten 1,5 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß ein Smal-Bglll-0,6 kB-Restriktionsfragment verwendet wird, wobei der Smal-Ort sich 12 Nukleotide vor dem C-Terminus des gp51-Hüllproteins und damit 12 Nukleotide vordem N-Terminus des gp30-Hüllproteins befindet und der Bglll-Ort 50-60 Nukleotide vor dem C-Terminus des gp30-Hüllproteins liegt. ,
20. 20. Verfahren nach Punkten 1,4 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß als kodierende BLV-Hüllprotein-Nukleotidsequenzen eingesetzt werden, die zur Nukleotidsequenz nach Punkten 5 und 6 oder Teilen davon durch Mutation, einschließlich einfacher und mehrfacher Basensubstitution, Deletion, Insertion oder Inversion verwandt sind.
21. 21. Verfahrennach Punkten 1,4 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die kodierenden BLV-Nukleotidsequenzen mindestens mit einem Replikationsursprung und einer Expressionskontrolleinheit zu einem rekombinanten Plasmid verbunden werden.
22. 22. Verfahren nach Punkten 1,4 bis 6,11 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die kodierende BLV-Hüllprotein-Nukleotidsequenz mit einer Expressionskontrolleinheit verbunden wird, wobei das rekombinante Plasmid nach Transformation in einen Wirt die BLV-Hüllproteinsynthese (Expression) bewirkt.