DD236553A1 - Verfahren und bienzymelektrode zur bestimmung geloester stoffe in gemischen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Bienzymelektrode zur quantitativen Bestimmung geloester Stoffe in Gemischen. Die Bienzymelektrode besitzt eine Enzymschicht, die sowohl ein die zu bestimmende Substanz in ein elektroaktives Produkt umwandelndes Enzym (Indikatorenzym) als auch ein die interferierenden Substanzen in elektrochemisch nicht interferierende Substanzen umsetzendes Enzym (Eliminatorenzym) enthaelt. Interferierende Substanzen, die nicht effektiv durch das Eliminatorenzym umgesetzt werden, koennen durch eine vorgeschaltete chemische Reaktion in der Messloesung in nicht interferierende Substanzen und eine interferierende Substanz, die ein Substrat des Eliminatorenzyms ist, umgesetzt werden.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Bienzymelektrode zur Konzentrationsbestimmung gelöster Stoffe in Gemischen, die neben der Meßsubstanz eine oder mehrere die Bestimmung störende Substanzen enthält.
Das Verfahren und die Bienzymelektrode sind besonders für Analysatoren in klinischen und biologischen Labors und der Lebensmittelindustrie geeignet.
Die Anwendung enzymatischer Reaktionen in der Analytik mit Enzymelektroden basiert im allgemeinen auf der spezifischen Umsetzung der zu bestimmenden Substanz (enzymatische Substratwandlung) durch ein Enzym und einer elektrochemischen Anzeigereaktion, z. B. die anodische Oxidation von H2O2. Diese elektrochemische Reaktion besitzt eine relativ geringe Spezifität, d.h. auch andere Bestandteile der Meßprobe (die Störsubstanzen) können beim Potential der Oxidation von H2O2 oxidiert werden und so das Meßsignal verfälschen.
In Enzymelektroden werden Störsubstanzen bisher hauptsächlich durch Differenzmessung, eine zusätzliche Eliminatorelektrode (DD-Pat.G 01 N/2389663), durch die Verwendung selektiver Membranen (US-Patent 3, 979, 274; US-Patent 4, 073, 713) oder die Einführung einer zusätzlichen enzymatischen Sperrschicht (DD-Pat.211460) vermindert.
Die Differenzmessung und die Verwendung einer Eliminatorelektrode erfordern einen erhöhten apparativen Aufwand und sind dadurch erheblich teurer als einfache Messungen, wobei die Eliminatorelektrode nicht zum vollständigen Ausschluß der Interferenz führt.
Selektive Membranen sind ebenfalls sehr kostenaufwendig, dabei sehr dünn und wenig stabil.
Durch die Verwendung von mehreren übereinanderliegenden Enzymschichten werden die Messungen wesentlich verlangsamt, wodurch sie für den Einsatz in üblichen Analysatoren nicht geeignet sind.
Ziel der Erfindung ist es, die Nachteile der bekannten Lösungen zu umgehen und ein Verfahren und eine Bienzymelektrode zu entwickeln, die es erlauben enzymatische Konzentrationsbestimmungen gelöster Stoffe in solchen Gemischen wie Blut, Serum, Urin und Lebensmittelproben richtigerund genauerals mit der Monoenzymelektrode und schnellerals mit Multienzymschichten mit üblichen Analysatoren durchzuführen.
Die Aufgrbe der Erfindung besteht darin, Störsubstanzen der elektrochemischen Anzeigereaktion in üblichen Enzymelektroden-Analysaioren auszuschalten und auf diese Weise Richtigkeit und Schnelligkeit der Messung der betreffenden Stoffkonzentration zu erhöhen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß zur quantitativen Bestimmung gelöster Stoffe in Gemischen eine Bienzymelektrode, die eine Enzymschicht besitzt, die sowohl ein die zu bestimmende Substanz in ein elektroaktives Produkt umwandelndes Enzym (Indikatorenzym) als auch ein die interferierenden Substanzen in elektrochemisch nicht interferierende Substanzen umsetzendes Enzym (Eliminatorenzym) enthält, in einem üblichen Enzymelektroden-Analysator eingesetzt wird, wobei gegebenenfalls interferierende Substanzen, die nicht effektiv durch das Eliminatorenzym umgesetzt werden-können durch eine vorgeschaltete chemische Reaktion in der Meßlösung in nicht interferierende Substanzen und eine interferierende Substanz, die ein Substrat des Eliminatorenzyms ist, umgesetzt werden.
In der einschichtigen Bienzymmembran werden als Indikatorenzym, entsprechend der'zu bestimmenden Substanz, spezifische Oxidoreduktasen, beispielsweise Glukoseoxidase (GOD) oder Uratoxidase oder Cholesteroloxidase (COD) oder Laktatoxidase (LOD) oder Pyruvatoxidase oder Glutamatoxidase oder Sarcosinoxidase oder Alkoholoxidase und das Eliminatorenzym Laccase oder NADH-monooxygenase oder Laktatmonooxygenase oder Ascorbatoxidase verwendet.
-2- 755 09
. O2 + Störsubstanz Eliminatorenzym t nicht störende Pro_
(elektroaktiv) dukte + HpO
zu bestimmende Substanz + O0 Indikatorenzym^ E 0
c- .22 + Pro-
(elektr.o- dukt aktiv)
Für interferierende Substanzen z. B. Ascorbinsäure oder Glutathion, die nicht effektiv durch das Eliminatorenzym z. B. Laccase umgesetzt werden, wird durch eine vorgeschaltete chemische Oxidation z. B. mit Kaliumferricyanid eine Umwandlung in nicht interferierende Produkte durchgeführt, wobei das elektrochemisch interferierende Kaliumferrocyanid entsteht. Das Ferrocyanid wird in der Enzymschicht durch das Eliminatorenzym Laccase in das nicht interferierende Ferricyanid zurückgebildet. Damit erfolgt eine effektive Ausschaltung der elektrochemischen Interferenz z. B. bei der H2O2-Anzeige.
Die Erfindung hat den Vorteil, daß die Messung gelöster Stoffe in Gemischen schneller und richtiger als nach den bekannten Methoden erfolgt.
1. Beispiel
Ein etwa 3 mm2 großes Stück der Bienzymmembran, bestehend aus in Gelantine eingeschlosser Glukoseoxidase (46 U/cm2) und Laccase (120 U/cm2), wird zwischen zwei Dialysemembranen unmittelbar vor die auf +60OmV polarisierte modifizierte Sauerstoffelektrode gespannt.
Diese Bienzymelektrode wird in eine temperierte Meßzelle eingesetzt und mit einem Polarographen verbunden. In der Meßzelle befinden sich 2ml einer Phosphatpufferlösung (nach Sörensen) pH = 5,0 mit 5,0mmol/l Kaliumferricyanid. Nach Zugabe von 50μ\ einer Lösung, die sowohl Glukose als auch Ascorbinsäure enthält, laufen folgende Reaktionen ab:
— Die in der Meßlösung vorhandene Ascorbinsäure wird durch Kaliumferricyanid unter Bildung von Kaliumferrocyanid oxidiert.
— Die immobilisierte Lacca'se katalysiert die vollständige Oxidation des in der Membran diffundierten Ferrocyanids.
— Glukose diffundiert in die Enzymschicht und wird durch die Glukoseoxidase in Glukonolakton und H2O2 umgewandelt.
— H2O2 wird an der Elektrode anodisch oxidiert. Der Oxidationsstrom dient als glukosekonzentrationsabhängiges Meßsignal. Mit einer solchen Meßanordnung wird Glukose im Konzentrationsbereich von 1,0 bis 50mmol/l, ohne Störung durch Ascorbinsäure (mindestens bis 15mmol/l), richtig gemessen.
2. Beispiel
Die im 1. Beispiel beschriebene Bienzymelektrode wird im Glukosemeßgerät GKM 02 (ZWG der AdW der DDR) eingesetzt. Die Polarisationsspannung der Platin-Indikatorelektrode beträgt +60OmV. Die präparierte Bienzymelektrode taucht in 2 ml einer gerührten Meßvorlage (5mmol/l Kaliumferricyanid in Phosphatpuffer nach Sörensen, pH 5,0). Glukosestandardlösungen zwischen 0,75 und 40mmol/l werden mit der Pufferlösung im Verhältnis 1:10 vorverdünnt. Durch Zugabe von jeweils 500μΙ einer solchen Standardlösung zur Meßvorlage wird das Meßgerät geeicht und/oder mit dem angeschlossenen y-t-Schreiber eine Glukoseeichkurve aufgezeichnet. Als konzentrationsabhängiges Meßsignal dient in beiden Fällen die erste Ableitung des H202-Oxidationsstromes, die digital angezeigt oder mit dem Schreiber aufgenommen wird.
Die Urinprobe wird mit der Meßvorlage im Verhältnis 1:10 vorverdünnt. Reduzierte Bestandteile, die bei +60OmV anodisch oxidiert werden, werden durch Ferricyanid umgesetzt. Dabei wird Ferrocyanid gebildet.
~ In die gefüllte Meßzelle werden 500^l der mit Ferricyanidpuffer (Meßvorlage) versetzten Urinprobe gegeben. Ferrocyanid wird durch Laccase oxidiert. Die im Urin enthaltene Glukose gelangt an die Glukoseoxidase und wird umgewandelt. Das dabei . produzierte H2O2 kann jetzt ohne elektrochemische Interferenzen oxidiert werden. Am Meßgerät ist die Glukosekonzentration der Probe direkt ablesbar.
Claims (4)
- -1- 755 09Erfindungsanspruch:1. Bienzymelektrodezur Bestimmung· gelöster Stoffein Gemischen, bestehend aus einer zu bestimmenden Substanz und einer bzw. mehrerer diese Bestimmung störende Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß eine einschichtige BienzymmembraVi, die sowohl ein die zu bestimmende Substanz in ein elektroaktives Produkt umwandelndes Enzym (Indikatorenzym) als aücti ein interferierende Substanzen in elektrochemisch nicht interferierende Substanzen umsetzendes Enzym (Eliminatorenzym) enthält.
- 2. Bienzymelektrode nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Indikatorenzym Glukoseoxidase oder Uratoxidase oder Cholesteroloxidase oder Laktatoxidase oder Pyruvatoxidase oder Glutamatoxidase oder Sarcosinoxidase oder Alkoholoxidase und als Eliminatorenzym Laccase oder NADH-monooxygenase oder Laktatmonooxygenase oder Ascorbatoxidase gemeinsam in einer Schicht eingesetzt werden.
- 3. Verfahren zur Bestimmung gelöster Stoffe in Gemischen, dadurch gekennzeichnet, daß interferierende Substanzen durch eine vorgeschaltete chemische Reaktion in der Meßlösung in nicht interferierende Substanzen und eine interferierende Substanz, die Substrat des Eliminatorenzyms Laccase ist, umgesetzt wird.
- 4. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß die interferierende Substanz durch Kaliumferricyanid umgesetzt wird.
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| DD27550985A DD236553A1 (de) | 1985-04-24 | 1985-04-24 | Verfahren und bienzymelektrode zur bestimmung geloester stoffe in gemischen |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3824258C2 (de) * | 1987-07-23 | 1999-04-29 | Bst Bio Sensor Tech Gmbh | Modifizierte Enzymmembran für Enzymelektroden mit hoher Selektivität und Verfahren zu ihrer Anwendung |
-
1985
- 1985-04-24 DD DD27550985A patent/DD236553A1/de not_active IP Right Cessation
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