DD236942A5 - Verfahren zur gewinnung eines gereinigten eukaryotischen wachstumshormons - Google Patents
Verfahren zur gewinnung eines gereinigten eukaryotischen wachstumshormons Download PDFInfo
- Publication number
- DD236942A5 DD236942A5 DD85279990A DD27999085A DD236942A5 DD 236942 A5 DD236942 A5 DD 236942A5 DD 85279990 A DD85279990 A DD 85279990A DD 27999085 A DD27999085 A DD 27999085A DD 236942 A5 DD236942 A5 DD 236942A5
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- analog
- hormone
- suspension
- growth hormone
- solution
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 83
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 title claims abstract description 25
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 title claims abstract description 15
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims abstract description 60
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims abstract description 60
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 claims description 59
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 46
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 46
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 36
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 36
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 33
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 25
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 21
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 21
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 20
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 20
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 18
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 16
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 239000002002 slurry Substances 0.000 claims description 15
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 claims description 15
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims description 13
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims description 13
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 12
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 11
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 9
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 9
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims description 9
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 7
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 5
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 101000824878 Gallus gallus Somatotropin Proteins 0.000 claims description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 4
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 4
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 claims description 3
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 claims description 3
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 claims description 3
- 238000009877 rendering Methods 0.000 claims description 3
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 claims description 3
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 claims description 3
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- JQECLVNLAZGHRQ-CIUDSAMLSA-N Met-Asp-Gln Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O JQECLVNLAZGHRQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 2
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 claims description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 claims description 2
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 claims description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims 4
- 101000868144 Sus scrofa Somatotropin Proteins 0.000 claims 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims 1
- -1 salt ammonium hydroxide Chemical class 0.000 claims 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 abstract description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 abstract description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 34
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 27
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 25
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 17
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 17
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 13
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 12
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 12
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 12
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 12
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 11
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 8
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 8
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 6
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N (2-chloroethyl)phosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)CCCl UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004690 coupled electron pair approximation Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000588924 Anthopleura elegantissima Delta-actitoxin-Ael1a Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- CDMADVZSLOHIFP-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane;decahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 CDMADVZSLOHIFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003111 growth hormone derivative Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000009304 pastoral farming Methods 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000012557 regeneration buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines gereinigten eukaryotischen Wachstumshormons oder eines Analogen desselben aus einer Bakterienzelle, in der das Wachstumshormon oder Analoge desselben durch Expression einer DNA-Sequenz mit Kodierung fuer das Hormon oder Analoge desselben hergestellt wurde. Im Rahmen des erfindungsgemaessen Verfahrens verwendbare geeignete hormonproduzierende Bakterienzellen sind genetisch modifizierte Staemme von Escherichia coli. Als Wachstumshormone koennen erfindungsgemaess Rinder-, Schweine- und Huehnerwachstumshormone sowie menschliche Wachstumshormone und jeweils deren Analoge gewonnen und reindargestellt werden.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines gereinigten eukaryotischen Wachstumshormons oder Analogen desselben aus einer Bakterienzelle.
Ein Ziel gentechnologischer Forschung bestand in der Entwicklung von Verfahren zur Gewinnung von in der Natur lediglich in höheren Organismen gebildeten Proteinen in Mikroorganismen. Dieses Ziel wurde bei bestimmten eukaryotischen Wachstumshormonen oder Analogen derselben erreicht. Bei der American Type Culture Collection in Rockville, MD. sind Stämme genetisch modifizierter Bakterien, beispielsweise Escherichia coli, die bei Züchtung und Induktion zur Bildung verschiedener Wchstumshor.mone oder Analoger derselben fähig sind, hinterlegt. Solche Hormone sind von möglicherweise großem Interesse auf landwirtschaftlichem Gebiet, beispielsweise zur Steigerung der Milch- und Fleischproduktion in der Viehwirtschaft, sowie auf medizinischem Gebiet, beispielsweise zur Behandlung von Zwergenwuchs bei Menschen. Die Gewinnung eines Wachstumshormons mittels eines Mikroorganismus umfaßt folgende allgemeine Stufen:
1. Fremd-DNA, die mit den genetischen Anweisungen für die Produktion des gewünschten Hormons kodiert ist, wird in einem geeigneten Mikroorganismus, z. B. Escherichia coli, eingebaut;
2. der Mikroorganismus wird unter geeigneten Bedingungen gezüchtet und liefert und lagert das Hormon in großen Mengen; und
3. das Hormon wird aus dem Mikroorganismus gewonnen und gereinigt.
-3- 799
Die Gewinnung und Reinigung des Hormons besteht im allgemeinen in einem Aufbrechen der Zelle, in einer Abtrennung des Wachstumshormons von den sonstigen Zellbestandteilen und in einer weiteren Reinigung des gewonnenen Hormons. Unerwünschte Zellbestandteile können mit Enzymen verdaut, mit Netzmitteln in Lösung gebracht und von dem Hormon durch Zentrifugieren abgetrennt werden. Schließlich läßt sich das Wachstumshormon mit den verschiedensten Reinigungstechniken für Proteine bis zu verschiedenen Reinigungsgraden reinigen. Solche üblichen Proteinreinigungsmaßnahmen sind beispielsweise Dialyse, Zonenzentrifugieren, Molekülausschlußchromatographie, isoelektrische Fällung, Ein- und Aussalzen, Lösungsmittelfraktionieren, Elektrophoresemaßnahmen, lonenaustauschchromatographie und/oder Affinitätschromatographie. Die geschilderten Techniken unterscheiden sich voneinander durch ihre wirtschaftliche Durchführbarkeit und den erreichbaren Reinigungsgrad.
In der DDR-Patentanmeldung AP-C 12 N/265320/4 ist ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Rinderwachstumshormon beschrieben. Bei diesem Verfahren erfolgt eine Gewinnung des Hormons durch mechanisches Aufbrechen einer durchgemischten Zellsuspension und eine Inkubation des Niederschlags mit Lysozym und dann mit Desoxyribonuklease. Die Reindarstellung des Hormons erfolgt dann durch Beschallung des in Lösung gebrachten Hormons, Klären der Lösung durch Zentrifugieren und Unterwerfen der das Hormon enthaltenden Lösung einer Gelchromatographie, lonenaustauschchromatographie, Dialyse und Lyophilisierung.
Das geschilderte Verfahren erfordert ziemlich große Mengen an Lysozym und folglich wiederholte und zeitaufwendige Waschvorgänge zur Gewinnung von gereinigtem Hormon. Selbst dann fällt das gereinigte Hormon lediglich in relativ geringer Ausbeute (etwa 10—15%, bezogen auf das Hormongewicht in den Zellen am Ende der Fermentierung) an. Ein weiterer Nachteil des beschriebenen Verfahrens ist seine Abhängigkeit von einer Desoxyribonukleaseverdauung. Desoxyribonuklease ist ein kostspieliges Enzym, das zur Verdauung von Zeil-DNA während des Hormongewinnungsverfahrens verwendet wurde. Es hat sich gezeigt, daß Desoxyribonukleasepräparate mit Proteasen, die das gewünschte Produkt während der Gewinnung abbauen, verunreinigt sind. Die Verwendung von Desoxyribonuklease, wie bei dem geschilderten Verfahren, kann folglich zu einer Verminderung der Ausbeute an dem gewonnenen Hormon führen, sofern nicht zusätzliche Vorkehrungen zur Inhibierung etwa vorhandener Protease getroffen werden. Selbst dann ist eine vollständige Proteaseinhibierung nicht möglich. Über die Ausbeuteverminderung hinaus führt die Verwendung von Desoxyribonuclease zusätzlich noch zu einem Produkt geringerer als der gewünschten Stabilität, was ebenfalls auf die Proteaseverunreinigung zurückzuführen ist.
Es wurde nun ein Verfahren zur Gewinnung eines gereinigten eukaryotischen Wachstumshormons oder Analogen desselben entwickelt, das einfacher durchzuführen, besser zu steuern und weniger kostspielig ist als vorherige Verfahren. Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu einer Gewinnung des gewünschten Produkts in höherer Ausbeute und in stabilerer Form als dies bisher erreichbar war. Das Verfahren erfordert lediglich 2,5—5% der bei dem vorherigen Verfahren verwendeten Lysozymmenge, was die Reinigung vereinfacht und die Gestehungskosten senkt. Darüber hinaus benötigt man bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens keine Desoxyribonuklease. Neben der weiteren Kostensenkung kann man durch Weglassen der Desoxyribonuklease die Produktausbeute mehr als verdoppeln und ein Produkt deutlich höherer Stabilität herstellen. Durch Vermindern der Anzahl der erforderlichen Waschvorgänge stellt das erfindungsgemäße Verfahren ein bequemeres und weniger zeitaufwendiges Verfahren zur Gewinnung und Reindarstellung von Wachstumshormonen oder deren Analogen dar, wobei lediglich 10-20% der Zeit des vorherigen Verfahrens aufgewendet werden müssen. Durch Anwendung der Ultrafiltration ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren sowohl eine beträchtliche Kosteneinsparung als auch die Gewinnung eines deutlich reineren Produkts.
Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur Gewinnung eines gereinigten eukaryotischen Wachstumshormons oder Analogen desselben aus einer Bakterienzelle, in der das eukaryotische Wachstumshormon oder Analoge desselben durch Expression einer DNA-Sequenz mit Kodierung für das betreffende Hormon oder Analoge desselben erzeugt wurde, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man
a) die Zellwand der Bakterienzelle oder von Fragmenten derselben zur Gewinnung eines Lysats aufbricht;
b) aus dem Lysat ein teilchenförmiges und unlösliches Material enthaltenden Niederschlag abtrennt;
c) eine Suspension des abgetrennten Niederschlags in einer geeigneten Pufferlösung zubereitet;
d) die Suspension zur Herbeiführung eines Kontakts zwischen Flüssigkeit und Feststoffen behandelt;
e) von der Suspension, in der ein Flüssigkeits-/Feststoff-Kontakt stattgefunden hat, ausgefallenes Material teilweise oder vollständig abtrennt;
f) den abgetrennten Niederschlag zur Bildung oiner Lösung in ausreichender Menge in einer wäßrigen Lösung in Lösung bringt und den pH-Wert auf einen geeigneten alkalischen Wert einstellt;
g) das löslich gemachte Hormon oder Analoge desselben von sonstigen Zellkomponenten durch Ultrafiltration unter geeigneten Bedingungen abtrennt, um ein Ultrafiltrat mit dem Hormon oder Analogen desselben und einen Rückstand zu erhalten, und
h) das löslich gemachte Hormon oder Analoge desselben zu seinerweiteren Reinigung und Konzentration einer Behandlung unterwirft, um dabei gereinigtes Hormon oder gereinigtes Analoges desselben reindarzustellen.
In Stufe (d) kann man zum Behandeln der Suspension des von dem Lysat abgetrennten Niederschlags vor der Flüssigkeits-/ Feststoff-Kontaktierung und anschließenden Abtrennung des Niederschlags Lysozym verwenden. Letztere beiden Stufen sowie die Ultrafiltration können wiederholt werden. Zur weiteren Reinigung und Konzentrierung des Hormons oder seines Analogen kann man sich in Stufe (h) der lonenaustauschchromatographie bedienen. Die meisten Verfahrensschritte können kontinuierlich und automatisch durchgeführt werden.
-4- 799 90
Geeignete hormonproduzierende Bakterienzellen, die im Rahmen des Verfahrens gemäß der Erfindung eingesetzt werden können, sind die Escherichia coli Stämme ATCC Nr. 39806, 39785, 39386, 39384, 39804 und 39792. Erfindungsgemäß können Rinder-, Schweine- und Hühnerwachstumshormone sowie menschliche Wachstumshormone und deren jeweilige Analoge gewonnen und reindargestellt werden.
Wie bereits erwähnt, wurde erfindungsgemäß ein neues Verfahren zur Gewinnung eines gereinigten eukaryotisch', beispielsweise tierischen oder menschlichen Wachstumshormons oder Analogen desselben, aus einer Bakterienzelle, in der das Wachstumshormon oder Analoge desselben durch Expression einer DNA-Sequenz mit Kodierung für das betreffende Hormon oder dessen Analoges produziert wurde, entwickelt.
Zur Verwendung bei diesem Verfahren geeignete, genetisch modifizierte Bakterienzellen sind bekannt. Ein beispielsweise zur Produktion eines Analogen von Rinderwachstumshormon (bGH) genetisch modifizierter Escherichia coli-Stamm wurde beispielsweise bei der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) unter der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. 39806 hinterlegt. Das bGH-Analoge besitzt an das N-Ende der Phenylalaninform von natürlichem bGH die Aminosäuresequenz Met-Asp-Gln addiert. Eine andere genetisch modifizierte E. coli-Zellinie, die bei ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. 39785 hinterlegt ist, produziert ein bGH-Analoges mit einem an das N-Ende der Phenylalaninform von natürlichem bGH addierten Methioninrest. Ein bei ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC Nr.39386 hinterlegter weiterer E. coli-Stamm produziert ein Analoges von menschlichem Wachstumshormon (hGH) mit der Aminosäuresequenz von natürlichem hGH, beginnend mit Met14 und ohne die Aminosäuren 1-13. Die E. coli-Zellinie mit der ATCC-Nr. 39384 produziert ein hGH-Analoges mit der Sequenz von natürlichem hGH bei vorgeschaltetem Methionin am N-Ende. In ähnlicher Weise produzieren die E. coli-Zellinien mi den ATCC-Nr. 39804 und 39792 ein Analoges von Schweinewachstumshormon (pGH) bzw. ein Analoges von Hühnerwachstumshormon (cGH), die jeweils einen an das N-Ende der Phenylalaninform des jeweiligen natürlichen Hormons addierten Methioninrest aufweisen. Sämtliche der genannten Hormonanalogen können durch Wachsenlassen und Induktion geeigneter Zellen unter geeigneten Bedingungen produziert und dann nach dem Verfahren gemäß der Erfindung gewonnen und reindargestellt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist einfacher durchzuführen, besser zu steuern und weniger kostspielig als vorherige Verfahren und führt zur Gewinnung des gewünschten Produkts in höherer Ausbeute und stabilerer Form. Die gewünschten Produkte können im Rahmen des Verfahrens gemäß der Erfindung in Ausbeuten von über 25 oder sogar über30Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Hormons oder dessen Analogen, in den Bakterien am Ende der Fermentierung gewonnen werden. Das Lysozym wird in geringeren Mengen benötigt als bei den vorherigen Verfahren. Ferner erfordert das erfindungsgemäße Verfahren nicht den Einsatz irgendeiner Desoxyribonuklease und kann kontinuierlich und unter Ausnutzung bequemer automatischer Maßnahmen durchgeführt werden.
Erfindungsgemäß werden nach dem Wachstum, der Induktion und der Ernte geeigneter Bakterienzellen die dekantierten Bakterienzellen, Bruchstücke derselben oder der Zellkuchen in einer geeigneten gepufferten Lösung bei neutralem pH-Wert, d. h. bei einem pH-Wert von etwa 7,4, suspendiert. Ein zu diesem Zweck geeignetes Suspendiermedium besteht aus einer wäßrigen Lösung von 5OmMTHs (pH-Wert: 7,4): 5OmM NaCI, 5OmM Tris (pH-Wert: 7,4): 5OmM EDTA, 5OmM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert: 7,4): 5OmM NaCI oder 5OmM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert: 7,4): 5OmM EDTA. Andererseits kann auch die Zellsuspension der Gärmaische nach Einstellen auf einen neutralen pH-Wert direkt weiterverarbeitet werden. Danach wird die Zellwand der suspendierten Bakterienzelle oder von Bruchstücken derselben zur Bildung eines Lysats aufgebrochen. Vorzugsweise erfolgt das Aufbrechen der Zellen auf mechanischem Wege bei Temperaturen unter etwa 35°C, d.h. bei Temperaturen zwischen etwa -1O0C und etwa +80C. Eine zu diesem Zweck geeignete handelsübliche Aufbrechvorrichtung besteht in einer Kugelmühle oder in einem Homogenisator, beispielsweise in der Vorrichtung Dynomill KD-5 der Firma Willy A. Bachofen, Basel. Das Aufbrechen erfolgt vorzugsweise durch kontinuierliches Hindurchleiten der Suspension durch die Aufbrechvorrichtung mit einer geeigneten Strömungsgeschwindigkeit, beispielsweise einer Geschwindigkeit von etwa 80 l/h.
Danach wird von dem Lysat, das auch wasserlösliche Proteine, DNA und RNA oder Fragmente derselben enthält, ein Niederschlag mit teilchenförmigen! und unlöslichem Material einschließlich des Hormons oder eines Analogen desselben und sonstiger wasserunlöslicher Proteine sowie Zellmembranen und Zellwandbruchstücken und -aggregaten abgetrennt. Zu dieser Abtrennung wird das Lysat vorzugsweise mit einer geeigneten Menge, beispielsweise etwa dem gleichen Volumen entionisierten Wassers verdünnt und anschließend in einer Festkorbzentrifuge mit kontinuierlichem Durchlauf (z.B. Cepa 101) bei Durchflußgeschwindigkeiten, die zur Herbeiführung der gewünschten Trennung ausreichen, beispielsweise etwa 60-80 l/h, zentrifugiert. Hierauf wird von dem abgetrennten Niederschlag in einer geeigneten Menge einer geeigneten Pufferlösung eines neutralen pH-Werts, z. B. eines pH-Werts von etwa 7,4, eine Suspension zubereitet. Vorzugsweise enthält die Lösung 50 mM Tris oder Natriumphosphat (pH-Wert: 7,4): 5OmM EDTA. Eine geeignete Menge Pufferlösung zur Zubereitung der Suspension beträgt etwa 0,5—2,5', vorzugsweise etwa 1,21, pro kg anfänglicher Bakterienzellen.
Unerwünschtes Zellmaterial, z. B. Zellwandbruchstücke, können durch Inkubieren der Suspension mit einem zum Verdauen von in der Suspension enthaltenen Polysacchariden geeigneten Enzym, z. B. Lysozym (Sigma L-6876, St. Louis, MO), unter geeigneten Bedingungen und für eine geeignete Zeit lang verdaut werden. Die im Rahmen des Verfahrens gemäß der Erfindung bevorzugte Lysozymkonzentration beträgt etwa 50-100/xg/ml Lösung. Diese Menge bedeutet eine signifikante Verminderung gegenüber den bei den vorherigen Verfahren verwendeten 2 mg/ml. Die Lysozyminkubation dauert zweckmäßigerweise etwa 1—20 h. Vorzugsweise beträgt die Temperatur während dieser Inkubationsperiode etwa 370C. Danach kann der Suspension eine geeignete Menge eines geeigneten Netzmittels, z. B. Triton X-100 (Rohm & Haas Co., Philadelphia, PA), in einer Endkonzentration von etwa 1 % (V/V) einverleibt werden, um Substanzen, wie ZeIlipide, in Lösung zu bringen. Schließlich wird die Suspension eine geeignete Zeit lang, beispielsweise etwa 30 min lang, weiter inkubiert.
Die in der Suspension enthaltenen Flüssigkeits- und Feststoffanteile werden nun einer Behandlung unterworfen, um einen engen Flüssigkeits-/Feststoff-Kontakt herbeizuführen. Dies geschieht beispielsweise durch Beschallung unter geeigneten Bedingungen, z. B. mit einer 370-W-Dauerstrombeschallungsvorrichtung (Heat Systems Ultrasonics, Plainview, NY), die auf 65% der Maximalleistung eingestellt ist und mit einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 18-25 l/h arbeitet; Danach wird von der der Flüssigkeits-/Feststoff-Kontaktierung unterworfenen Suspension ausgefallenes Material abgetrennt. Dies geschieht vorzugsweise durch Zentrifugieren der einer Flüssigkeits-/Feststoff-Kontaktierung unterworfenen Suspension in einer Korbdauerstromzentrifuge (z.B. Cepa 101) bei einer geeigneten Strömungsgeschwindigkeit, beispielsweise etwa 30l/h. Gemäß ' ' »..-x.-.i c i,„„„ Mn Aktrannil„„ ;„ ri;=ear<;tiifoiinH in Hen fnlnpnrlen Stufen durch Mikrofiltration mit einer
-5- 799 90
geeigneten Membran, beispielsweise einer Millipore Durapore 0,45 Mikron Membran anstelle des Zentrifugierens erfolgen. Nach der Abtrennung wird das von der einer Flüssigkeits-/Feststoff-Kontaktierung unterworfenen, beispielsweise beschallten Suspension abgetrennte ausgefallene Material gewaschen, zweckmäßigerweise mit 5OmM Tris oder Phosphat (pH-Wert: 7,4): 10OmM NaCI, und in einer geeigneten Menge eines geeigneten Mediums, z. B. einer gepufferten oder ungepufferten wäßrigen Lösung, resuspendiert. Die erhaltene Suspension wird danach unter geeigneten Bedingungen, z. B. durch Beschallen, in Flüssigkeits-ZFeststoff-Kontakt gebracht, worauf der gebildete Niederschlag teilweise oder vollständig von der einer Flüssigkeits-/Feststoff-Kontaktierung unterworfenen, beispielsweise beschallten Suspension, beispielsweise durch Zentrifugieren oder Ultrafiltration, abgetrennt wird. Das Resuspendieren, der Flüssigkeits-/Feststoff-Kontakt, beispielsweise die Beschallung, und das Abtrennen werden vorzugsweise mindestens ein weiteres Mal wiederholt. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung werden diese Schritte viermal wie folgt durchgeführt: Der gebildete Niederschlag wird das erste Mal in 2OmM Tris (pH-Wert: 7,4) oder 5OmM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert: 7,4) resuspendiert, worauf die Suspension, wie geschildert, einem Flüssigkeits-/Feststoff-Kontakt unterworfen, z. B. beschallt, wird. Danach wird die Suspension, wie beschrieben, zentrifugiert. Der gebildete Niederschlag wird in 5OmM Tris (pH-Wert: 7,4):100mM NaCI oder 2OmM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert: 7,4):10mM EDTA:100mM NaCI resuspendiert. Die erhaltene Suspension wird, wie geschildert, einer FlussigkeitS'/Feststoff-Kontaktierung, ζ. B. Beschallung, unterworfen und dann zentrifugiert, worauf der abgetrennte Niederschlag in entionisiertem Wasser resuspendiert wird. Die wäßrige Suspension wird erneut, wie geschildert, einer Flüssigkeits-/Feststoff-Kontaktierung, z. B. Beschallung, unterworfen und dann zentrifugiert. Der wiederum abgetrennte Niederschlag wird nochmal in entionisiertem Wasser suspendiert. Diese zweite wäßrige Suspension wird nach der Flüssigkeits-/ Feststoff-Kontaktierung, beispielsweise Beschallung, zentrifugiert, wobei ein Niederschlag anfällt, in dem das gewünschte Hormon oder Analoge desselben angereichert ist.
Nun wird der abgetrennte Niederschlag beispielsweise durch Resuspendieren bei geeigneter Temperatur, beispielsweise 4—4O0C, in einer ausreichenden Menge Wasser, vorzugsweise in etwa 25 Volumina Wasser, und Einstellen des pH-Werts auf einen geeigneten alkalischen Wert, beispielsweise etwa 9,0-12,0, in Lösung gebracht, wobei eine Lösung mit dem Hormon oder dessen Analogem erhalten wird. Zur besseren Auflösung kann man das Lösungsmedium mit hoher Scherkraft (z. B. mittels eines Polytronmischers der Firma Kinematica) bewegen. Der pH-Wert der zunächst angefallenen Suspension kann durch Zusatz von NaOH, beispielsweise 1-10N NaOH, in geeigneterweise auf einen Wert von etwa 9,0-12,0, vorzugsweise von etwa 11,8-12,0, eingestellt werden. Vorzugsweise wird die NaOH unter kräftigem Rühren auf einmal in die Lösung eingetragen. Danach wird die Lösung etwa 1 h lang inkubiert und gerührt, worauf der pH-Wert auf etwa 10,5 erniedrigt werden kann. Hierauf wird die Lösung mit einer geeigneten Menge einer geeignet konzentrierten wäßrigen Natriumboratlösung, beispielsweise einer etwa 1 M Natriumboratlösung eines pH-Werts von beispielsweise 11,5-12,0, versetzt, um eine Endboratkonzentration von vorzugsweise etwa 1OmM zu erreichen. Hierauf wird die Proteinlösung entweder durch Verdünnen mit 2-10 Volumina 1OmM Natriumboratpuffer (pH-Wert: 10,2) oder mit konzentrierter HCI oder 1 NHCI auf einen pH-Wert von 10,5 gebracht. Nach weiterem 1- bis 12stündigem Inkubieren unter Rühren kann die erhaltene Lösung gegebenenfalls durch Beschallen unter geeigneten Bedingungen, z. B. mittels eines handelsüblichen beheizten Dauerbeschallungsgeräts, bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 10 l/h, Zentrifugieren der beschallten Lösung unter geeigneten Bedingungen, beispielsweise mittels einer Korbdauerstromzentrifuge (beispielsweise Cepa 101) einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 30 l/h, Abtrennen der überstehenden Flüssigkeit und Vakuumfiltrieren der Flüssigkeit, beispielsweise durch ein Whatman Nr. 2-Papier auf einem Buchner-Vakuumfilter, geklärt werden, wobei man eine klare Lösung mit dem in Lösung gebrachten Hormon oder Analogen desselben erhält. Andererseits kann auch ausschließlich zentrifugiert werden. Das in Lösung gebrachte Hormon oder Analoge desselben wird dann von den sonstigen Zellkomponenten, wie Proteinen, Lipiden und sonstigen Teilchen, abgetrennt. Aggregate werden durch Ultrafiltration unter geeigneten Bedingungen aufgeschlossen. Vorzugsweise wird der angefallene Rückstand erneut mindestens einmal einer Ultrafiltration unterworfen. Während dieser Maßnahme sollte das Rückstandsvolumen um etwa 95%, beispielsweise von etwa 101 auf etwa 0,51, reduziert werden. Das Filtratwird aufgefangen. Zum Ultrafiltrieren eignet sich eine Pellicon-Kassette oder PUF-100-Spirale der Firma Millipore Corp., Bedford, MA, mit einem 100K Molekulargewicht-Schnitt. Vorzugsweise wird der Rückstand mit einem geeigneten Puffer bei einem geeigneten alkalischen pH-Wert, beispielsweise einem pH-Wert von etwa 9-12, weiterverdünnt und dann einer erneuten Ultrafiltration unterworfen. Vorzugsweise wird ein 1OmM Boratpuffer (pH-Wert: 10,5-12,0) verwendet. Die neuerliche Verdünnung und die weitere Konzentration durch Ultrafiltration werden vorzugsweise mindestens einmal wiederholt. Andererseits kann man bei praktisch konstantem Rückstandvolumen ein- oder mehrmals ultrafiltrieren. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung wird die Ultrafiltration so lange wiederholt, bis die Absorption des Rückstands bei 280 nm weniger als etwa 0,1 optische Dichteeinheit beträgt. Aus dem Ultrafiltrat erhält man üblicherweise das Hormon in einer Reinheit und mit einer biologischen Aktivität, die den bei Durchführung einer bisher üblichen Gelchromatographie gewonnenen entsprechenden Werten überlegen sind.
Das in dem Ultrafiltrat enthaltene gereinigte Hormon oder Analoge desselben wird dann zu seiner Reindarstellung einer lonenaustauschchromatographie, beispielsweise mit einem aminhaltigen lonenaustauscherharz, z. B. Die^hylaminoethyl, unterworfen. Vor der lonenaustauschchromatographie kann gegebenenfalls eine Konzentration mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer 10 K Molekulargewicht-Membran zur Entfernung von Wasser vorgeschaltet werden. Während der lonenaustauschchromatographie werden restliche DNA, gegebenenfalls noch vorhandenes Lysozym und Multimere von dem Hormon oder Analogen desselben abgetrennt. In dieser Stufe wird zunächst der pH-Wert des Ultrafiltrats durch Versetzen mit Salzsäure auf einen geeigneten Wert, beispielsweise 9,0, eingestellt, worauf das Ganze auf eine geeignete lonenaustauschersäule, beispielsweise eine DEAE-Sepharose CL-6B (Schnellaufsäule) KS-370-Abschnittsäule (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) aufgegeben wird. Danach wird das System mit einem geeigneten Puffer, z.B. 1OmM Boratpuffer, gewaschen und die Probe mit geeigneter Geschwindigkeit mittels eines geeigneten Eluiermittels, beispielsweise eines 1OmM Boratpuffers (pH-Wert: 9,0) mit 10OmM NaCI eluiert. Die das Hormon oder Analoge desselben enthaltenden Fraktionen können durch Ultrafiltration mittels einer Pellicon-Kassette oder PUF-100-Spirale mit einem 10K Molekulargewicht-Schnitt konzentriert und dann gegen eine Lösung einer geeigneten Konzentration an einem geeigneten Salz, beispielsweise 3 mM Ammoniumhydroxid oder Ammoniumbicarbonat, erneut unter Verwendung einer Pellicon-Kassette mit einem 10K Molekulargewicht-Schnitt dialysiert werden. Das dialysierte Material kann dann durch Lyophilisieren oder durch Sprühtrocknen unter geeigneten Bedingungen getrocknet werden. Das Sprühtrocknen stellt die wirtschaftlichere Maßnahme dar und kann in üblicher bekannter Weise mittels einer kleineren Sprühtrocknunaseinheit (Niro Atomvzer) bei einer Einlaßtsrnnffratur von ptwa
-6- 799 90
2000C und einer Auslaßtemperatur von etwa 500C sowie einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 2,5 l/h bewerkstelligt werden. Durch die geschilderten Behandlungsmaßnahmen erhaltene tierische Wachstumshormone oder deren Analoge fallen in Form feiner weißer Pulver Gereinigte tierische Wachstumshormone oder deren Analoge können nach dem Verfahren gemäß derErfindung in einer Ausbeute von größer a Is oder gleich etwa 30%, bezogen auf das Gewicht des in den Bakterien am Ende der Fermentierung enthaltenen Hormons oder Analogen desselben, gewonnen werden. Das hierbei erhaltene Hormon oder Analoge desselben erscheint als ein Fleck beim Entwickeln auf einem 15% Polyacrylamid-SDS-Gel gegen niedrigmolekulare Marker (Pharmacia) als Referenz.
Die nach der erfindungsgemäßen Ultrafiltration und lonenaustauschchromatographie erhaltenen Peptide sind reiner und stabiler als im Falle, daß anstelle der Ultrafiltration eine Gelchromatographie oder daß die Konzentration der Peptide durch Ultrafiltration mit einer 10K Molekulargewichtschnitt-Membran anstelle der lonenaustauschchromatographie durchgeführt wird.
Bezüglich der biologischen Aktivität der gewonnenen Hormone und Analogen derselben zeigen die Ergebnisse von Radioimmunotests, daß Antikörper zu dem natürlichen Hormon in etwa die gleiche Affinität zu dem durch einen geeigneten Mikroorganismus produzierten und erfindungsgemäß aufgearbeiteten Hormon oder Analogen desselben besitzen. In ähnlicher Weise belegen Radiorezeptorbindungstests, daß die Bindungsaktivität geeigneter Membrane für erfindungsgemäß gewonnene und gereinigte Hormone oder Analoge derselben der Bindungsaktivität für authentische Proben der natürlichen Hormone entsprechen. Schließlich lassen sich keine Antikörper gegen die Hormone oder Analoge derselben nach entweder Primärinjektionen oder Zusatzinjektionen der Peptide in geeignete Tiere nachweisen. Schließlich hat es sich auch noch gezeigt, daß das Rinderwachstumshormonanaloge bei Verabreichung an laktierende Kühe die Laktation steigert. Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.
1. Vorratskulturen.
Vorratskulturen des E. coli Stammes ATCC Nr. 39806, der beim Wachsen und bei der Induktion das bGH-Analoge Met-Asp-GlnbGH produziert, werden auf einem Caseinmedium (vgl. 2. Impfgut) wachsen gelassen, dann zweifach mit Gefriermedium verdünnt und bei -8O0C gelagert. Das Gefriermedium enthält pro 500ml:
K2HPO4 6,3 g
KH2PO4 1,8 g
Na-Citrat 0,45 g
MgSO4 -7 H2O 0,09 g
(NH4)2SO4 0,9 g
Glycerin 44,0 g.
2. Impfgut
Das Impfgut wird in 20g/l Caseinhydrolysat, 10 g/l Hefeextrakt und 2g/l NaCI fortgepflanzt. Zu diesem Zweck wird ein steriles Medium in einem Schüttelkolben mit Vorratskultur beimpft und dann 15h lang auf einem Rüttler bei 30°C und einer Rüttelbewegung von etwa 200 Umdrehungen/min inkubiert. Eventuell weitere Folgeschritte bei der Impfgutfortpflanzung werden in gerührten und belüfteten Gärbottichen durchgeführt. Das sterile Medium wird mit 2-10% Impfgutkultur beimpft und 15h bei 300C und einem pH-Wert von 7 ± 0,5 inkubiert. Während der Inkubation wird gerührt und belüftet, um einen Gehaltan gelöstem Sauerstoff bei etwa 20% Luftsättigung zu gewährleisten.
| Produktion | 20-g/l |
| s Produktionsmedium enthält: | 10a/| |
| Caseinhydrolysat | 2,5 g/l |
| Hefeextrakt | 1 g/l |
| K2HPO4 | Bg/I |
| MgSO4-7 H2O | 0,1 mg/l |
| NaCI | 1mg/l |
| Biotin | 3 ml/l. |
| Thiamin | |
| Spurenelementlösung | |
Das Medium enthält ferner 100 mg/l Ampicillin. Der Ampicillinzusatz stellt für die Produktion lediglich eine Gegebenenfallsmaßnahme dar. Er wurde jedoch immer in dem zum Wachsenlassen des Impfguts verwendeten Medium gefunden.
-7- 799
Konzentrierte Lösungen von Biotin, Thiamin und Ampicillin werden getrennt filtrationssterilisiert und dem sterilen Produktionsmedium vorder Beimpfung zugesetzt. Zunächst wird auch eine sterile Glucoselösung zugegeben, um 10 g/l Glucose zu liefern. In der Induktionsstufe werden weitere 10g/l Glucose zugeführt
Die Spurenelementlösung enthält:
FeCI3 16 g/l
ZnCI2-4H2O 2 g/l
CoCI2-6H2O 2 g/l
Na2MoO4-2 H2O 2 g/l
CaCI2-2H2O 1 g/l
CuCI2 1 g/l
H3BO3 0,5 g/l
konz.HCI 100 ml/l.
Das Medium wird mit 0,5-10% Impfstoffkultur beimpft und bei 30°C inkubiert. Hierbei wird so stark bewegt und belüftet, daß ein Gehaltan gelöstem Sauerstoff oberhalb 20% Luftsättigung erhalten bleibt. Der pH-Wert wird mit Hilfe von NH3 auf 7,0 bis 7,5 ± 0,2 gehalten. Wenn die Zellkonzentration etwa 3,5g/l erreicht (OD660 = 10), wird mit der Induktion begonnen, indem die Temperatur auf 42°C erhöht wird. Nun wird die Temperatur 1-5 h lang auf 42°C gehalten, worauf die Zellen aus der Zellsuspension geerntet werden können.
Beispiel 2 Ernten der Zellen
5001 gemäß Beispiel 1 erhaltener Zellsuspension mit 6,15 DCW/1 und 490 mg bGH/l werden auf Raumtemperatur gekühlt und in einen Lagertank überführt. Danach wird die Zellsuspension auf einer röhrenförmigen Korbzentrifuge (CEPA 101) mit 14000 Umdrehungen/min (16000 x g) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 250l/h zentrifugiert. Die CEPA 101-Zentrifuge besitzt eine Rohrlänge von 73,7 cm, einen Radius des Auslaßweh rs von 3,25 cm und einen Radius der Korbwand von 7,35 cm. Sie ist mit Beschleunigungsflossen ausgestattet und besitzt eine Kühlung am Außenmantel. Die klare überstehende Flüssigkeit besitzt eine Dichte von 1,0g/ml und enthält bGH nicht in nachweisbarer Menge. Sie wird verworfen. Der 11,4kg (75%ige Feuchtigkeit) wiegende Kuchen enthält das gesammelte bGH und wird weiterverarbeitet. Der Kuchen ist typischerweise etwa 2cm dick und besitzt eine Dichte von 1,1 g/ml. Eine Alternativmaßnahme besteht darin, die Zellen sich über Nacht absetzen zu lassen und die klare überstehende Flüssigkeit abzusaugen.
Testverfahren:
Quantitative Gelabtastung auf der Zellsuspension, der überstehenden Flüssigkeit und dem Kuchen.
Stufenausbeute*: 100%
Gesamtausbeute: 100%
Entnahmevolumen: 2,3% ursprünglichen Zeilsuspensionsvolumens
Errechneter Gehalt: 21,5g bGH/kg Kuchen
Anreicherungsfaktor: 44 (bGH-Konzentration in der Entnahmemenge/bGH Konzentration in der zugeführten Menge).
* Die Ausbeuten werden durch Bestimmung der OD-Einheiten ermittelt. Letztere Einheiten sind definiert als Absorption der Lösung bei 280 nm (1 cm Küvette) mal das Volumen der Lösung in ml. Wenn beispielsweise der OD-Wert 9,1 beträgt und die Lösung ein Volumen von 32600ml aufweist, ist der Wert der OD-Einheiten 297000 OD. Wenn die Absorptionsablesung bei einem pH-Wert von 9 erfolgt, kann der OD-Wert durch Multiplizieren mit dem Umrechnungsfaktor 0,00157 in Gramm bGH, also 14,3g bGH/l, umgerechnet werden.
Beispiel 3 Aufbrechen der Zellen
11,4kg der feuchten Zellen aus der Zellenernte (Beispiel 2) werden in insgesamt 45,61 50mMTris:50mM NaCI-Puffer (pH-Wert:
7,4) suspendiert. Als Hilfsmittel zum Dispergieren des Kuchens bedient man sich eines handelsüblichen Mischers hoher Scherkraft. Die suspendierten Zellen werden einer handelsüblichen Kugelmühlenaufbrechvorrichtung (Dynomill KD-5 Firma Willy A. Bachofen, Basel) mit einer Geschwindigkeit von 80 l/h zugeführt. Die Kugelmühle wird durch Kühlen bei einer Temperatur von -100C bis +8°C betrieben. Danach werden die aufgebrochenen Zellen mit einem gleichen Volumen entionisierten Wassers verdünnt, worauf 'lit Hilfe der röhrenförmigen Korbzentrifuge CEPA 101 zentrifugiert wird. Dei Zufuhrgeschwindigkeit zur Zentrifuge beträgt 30-60 l/h.-Sämtliche Zentrifugierbedingungen mit Ausnahme der Zugabegeschwindigkeit entsprechen den Zentrifugierbedingungen bei der Ernte der Zellen. Die etwa 10%desinderzugeführt£n Suspension enthaltenen bGH enthaltende überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Der 5,28 kg wiegende Kuchen (75% feuchte) enthält das angesammelte bGH und wird weiterverarbeitet.
Puffer beim Aufbrechen (5OmM Tris:50mM NaCI; pH-Wert: 7,4):
6,06g Tris und 2,97g NaCI in 750ml entionisierten Wassers werden mit konzentrierter HCI auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt, dann mit 11 entionisierte Wassers verdünnt und erforderlichenfalls erneut auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt.
Testverfahren:
Quantitative Gelabtastung auf der Zellsuspension, der überstehenden Flüssigkeit und dem Kuchen.
-8- 799 90
Stufenausbeute: 90%
Gesamtausbeute: 90%
Entnahmevolumen: 1,05% des ursprünglichen Zellsuspensionsvolumens
Errechneter Gehalt: 37,1 g bGH/kg Kuchen
Anreicherungsfaktor: 1,7.
Beispiel 4 Lysozymbehandlung
Die aus der Stufe des Aufbrechens der Zellen (Beispiel 3) stammenden 5,28 kg feuchter Kuchen werden in insgesamt 13,715OmM Tris:50mM EDTΑ-Puffer (pH-Wert: 7,4) suspendiert. Als Hilfsmittel beim Dispergieren des Kuchens bedient man sich eines handelsüblichen Mischers hoher Scherkraft. Nun wird Lysozym (Sigma Grade II) zugegeben (0,05g/l Aufschlämmung; die Aufschlämmung wird 1 h lang bei 370C durchgemischt). Ferner wird Triton X-100 (der Firma Rohm & Haas Co., Philadelphia, PA) zugesetzt (100ml einer 10%igen [v/v] Pufferlösung eines pH-Werts von 7,4/1, wobei eine Endkonzentration von 1% Triton X-100 erreicht wird), worauf das Gemisch weitere 30 min lang inkubiert wird. Nun wird die Aufschlämmung mit Hilfe eines handelsüblichen beheizten 370-Watt-Beschallungsgeräts, das auf 65%ige Leistung eingestellt und mit einer Strömungszelle ausgestattet ist, beschallt. Die Strömungsgeschwindigkeit durch das Beschallungsgerät beträgt 18 l/h. Schließlich wird die beschallte Aufschlämmung auf der Zentrifuge CEPA 101 mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 l/h zentrifugiert. Sämtliche Zentrifugierbedingungen mit Ausnahme der Zufuhrgeschwindigkeit entsprechen den Zentrifugierbedingungen bei der Ernte der Zellen. Die etwa 3% des in der zugeführten Menge enthaltenen bGH enthaltende überstehende Flüssigkeit wird verworfen.
Der 3,07 kg (75%ige Feuchte) wiegende Kuchen enthält die angesammelte bGH und wird weiterverarbeitet.
Lysozympuffer (5OmM Tris:50mM EDTA; pH-Wert: 7,4):
6,06g Tris und 14,6g EDTA in 750 ml entionisierten Wassers werden mit konzentrierter HCI oder 50%iger NaOH auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt, auf 11 mit entionisiertem Wasser verdünnt und erforderlichenfalls erneut auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt.
Testverfahren:
Quantitative Gelabtastung auf der Zellsuspension, der überstehenden Flüssigkeit und dem Kuchen.
Stufenausbeute: 97%
Gesamtausbeute: 87,3%
Entnahmevolumen: 0,61 % des ursprünglichen Zellsuspensionsvolumens
Errechneter Gehalt: 61,9g bGH/kg Kuchen
Anreicherungsfaktor: 1,7.
Beispiel 5 Erste Wäsche
3,07 kg feuchter Kuchen aus der Lysozymstufe (Beispiel 4) werden in insgesamt 6,81 20 mM Tris-Puffer bei einem pH-Wert von 7,4 suspendiert. Als Dispergierhilfe bedient man sich eines handelsüblichen Mischers hoher Scherkraft. Die Aufschlämmung wird bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 181/h mit Hilfe eines handelsüblichen, auf 65% Leistung eingestellten, beheizten 370-Watt-Beschallungsgeräts beschallt. Nach der Beschallung wird die Aufschlämmung auf der Zentrifuge CEPA 101 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 l/h zentrifugiert. Sämtliche Zentrifugierbedingungen mit Ausnahme der Zufuhrgeschwindigkeit entsprechen den Zentrifugierbedingungen bei der Ernte der Zellen. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Die erhaltenen 2,46kg (75% Feuchte) Kuchen enthalten das angesammelte bGH und werden weiterverarbeitet.
Bei der ersten Wäsche verwendeter Puffer (2OmM Tris, pH-Wert: 7,4):
2,42g Tris in 750 ml entionisierten Wassers werden mit konzentrierter HCI auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt, mit entionisiertem Wasser auf 11 verdünnt und erforderlichenfalls erneut auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt.
Testverfahren:
Quantitative Gelabtastung auf der Zellsuspension, der überstehenden Flüssigkeit und dem Kuchen.
Stufenausbeute: 100%
Gesamtausbeute: 87,3%
Entnahmevolumen: 0,49% des ursprünglichen Zellsuspensionsvolumens
Errechneter Gehalt: 77,3g bGH/kg feuchtem Kuchen
Anreicherungsfaktor: 1,2.
Beispiel 6 Salzwäsche
Die 2,46kg feuchter Kuchen aus der ersten Waschstufe (Beispiel 5) werden in insgesamt 6,81 50mMTris:100mM NaCI-Puffer eines pH-Werts von 7,4 suspendiert. Als Dispergierhilfe für den Kuchen bedient man sich eines handelsüblichen Mischers hoher Scherkraft. Die Aufschlämmung wird danach bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 181/h mit Hilfe eines auf 65% Leistungsvermögen eingestellten, beheizten 370-Watt-Beschallungsgeräts beschallt. Nach der Beschallung wird die
-9- 799 90
Aufschlämmung auf der Zentrifuge CEPA101 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 l/h zentrifugiert. Sämtliche Zentrifugierbedingungen mit Ausnahme der Zufuhrgeschwindigkeit entsprechen den Zentrifugierbedignungen bei der Ernte der Zellen. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Letztlich werden 2,15kg (75% Feuchte) Kuchen mit dem angesammelten bGH erhalten. Dieser Kuchen wird weiterverarbeitet.
Puffer bei der Salzwäsche (5OmM Tris:10OmM NaCI; pH-Wert: 7,4):
6,06g Tris und 5,85g Natriumchlorid in 750 ml entionisierten Wassers werden mit konzentrierter HCI auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt, mit entionisiertem Wasser auf 11 verdünnt und erforderlichenfalls erneut auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt.
Testverfahren:
Quantitative Gelabtastung auf der Zellsuspension, der überstehenden Flüssigkeit und dem Kuchen.
Stufenausbeute: 100%
Gesamtausbeute: 87,3%
Entnahmevolumen: 0,43% des ursprünglichen Zellsuspensionsvolumens
Errechneter Gehalt: 88,4g bGH/kg Kuchen
Anreicherungsfaktor: 1,14.
Die in der Salzwaschstufe (Beispiel 6) erhaltenen 2,15kg feuchter Kuchen werden in insgesamt 13,71 entionisierten, keimfreien Wassers suspendiert. Als Dispergierhilfe für den Kuchen bedient man sich eines handelsüblichen Mischers hoher Scherkraft.
Danach wird die Aufschlämmung bei einer Srömungsgeschwindigkeit von 18 l/h durch das aus 65% Leistung eingestellte, beheizte 370-Watt-Beschallungsgerät beschallt. Der pH-Wert der Aufschlämmung sollte vom Ausgangs-pH-Wert des Wassers von etwa 6,2 auf etwa 7,8—8,0 ansteigen. Nach der Beschallung wird die Aufschlämmung aus der Zentrifuge CEPA101 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 l/h zentrifugiert. Sämtliche Zentrifugierbedingungen, mit Ausnahme der Zugabemenge, entsprechen den Zentrifugierbedingungen bei der Ernte der Zellen. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Die erhaltenen 1,90kg (75% Feuchte) Kuchen enthalten das angesammelte bGH und werden weiterverarbeitet.
Testverfahren:
Quantitative Gelabtastung auf der Zellsuspension, der überstehenden Flüssigkeit und dem Kuchen.
Stufenausbeute: 99%
Gesamtausbeute: 86,4%
Entnahmevolumen: 0,38% des ursprünglichen Zellsuspensionsvolumens
Errechneter Gehalt: 99,0g bGH/kg Kuchen
Anreicherungsfaktor: 1,12.
Die 1,90 kg feuchter Kuchen aus der ersten, unter Verwendung von Wasser durchgeführten Waschstufe (Beispiel 7) werden in insgesamt 13,7 kg entionisierten, keimfreien Wassers suspendiert. Als Dispergierhilfe für den Kuchen bedient man sich eines handelsüblichen Mischers hoher Scherkraft. Der pH-Wert der Aufschlämmung sollte etwa 8,4 betragen. Die Aufschlämmung wird nun bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 18 l/h durch das auf 65% Leistung eingestellte, beheizte 370-Watt-Beschallungsgerät beschallt. Nach der Beschallung wird die Aufschlämmung auf der Zentrifuge CEPA101 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 l/h zentrifugiert. Sämtliche Zentrifugierbedingungen mit Ausnahme der Zugabemenge entsprechen den Zentrifugierbedingungen bei der Ernte der Zellen. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Die 1,31 kg (75% Feuchte) Kuchen enthalten das angesammelte bGH und werden weiterverarbeitet. Testverfahren:
Quantitative Gelabtastung auf der Zellsuspension, der überstehenden Flüssigkeit und dem Kuchen. Stufenausbeute: 99% Gesamtausbeute: 85,6%
Entnahmevolumen: 0,26% des ursprünglichen Zellsuspensionsvolumens Errechneter Gehalt: 160g bGH/g Kuchen Anreicherungsfaktor: 1,62.
Beispiel 9 Auflösungsstufe
Die 1,31 kg feuchter Kuchen aus der zweiten, unter Verwendung von Wasser durchgeführten Waschstufe (Beispiel 8) werden in insgesamt 32,61 entionisierten, keimfreien Wassers suspendiert. Als Dispergierhilfe für den Kuchen bedient man sich eines handelsüblichen Mischers hoher Scherkraft. Durch Zugabe von 10 N NaOH wird der pH-Wert langsam auf 11,8 eingestellt. Die in der Suspension angesammelte bGH geht langsam innerhalb von 1 h in Lösung. Nach 1 stündiger Inkubationszeit wird bei einem pH-Wert von 11,8 langsam soviel 1 M Natriumkarborat zur der Lösung zugegeben, daß die Endkonzentration der Lösung an Natriumborat 1OmM beträgt. Vor der Beschallung durch das auf 65% Leistung eingestellte, beheizte 370-Watt-Beschallungsgerät wird die Lösung 30min lang stehengelassen. Die Zugabemenge zu dem Beschallungsgerät beträgt 181/h. Wenn die Lösung sehr trüb ist, wird sie bei 30l/h mittels der Zentrifuge CEPA101 zentrifugiert, ansonsten wird die Lösung in 5 Liter-Anteilen in einem einzigen Buchner-Filter durch drei, einen Durchmesser von 24cm aufweisende Whatman Nr. 2-Filterpapiere filtriert. Um ein Schäumen während des Filtrierens zu verhindern, erfolgt die Filtration unter einem geeigneten Vakuum. Es sind nur spuren an unlöslichem Material festzustellen. Die 32,61 Filtrat enthalten das bGH in Lösung.
-10- 799 90
Die Absorption der geklärten Lösung beträgt 9,100. D. bei 280nm (1 cm Küvette). Würde die gesamte Absorption von bGH herrühren, was allerdings nicht der Fall ist, entspräche dies 14,3g bGH/l. Der wahre bGH-Gehalt beträgt jedoch weniger als die Hälfte dieses Werts. UV-Licht absorbierende Verunreinigungen sind für diesen Unterschied verantwortlich. Eine Adsorption von 1,0 bei 280 nm (1 cm Küvette) liefert eine Lösung von 1,57 g/l reines bGH bei einem pH-Wert von 9 (die Absorption von bGH ändert
sich mit dem pH-Wert).
Puffer zum Auflösen (1 M Natriumborat bei einem pH-Wert von 11,8):
Nach dem Auflösen von 61,8g Borsäure in 750 ml entionisierten Wassers wird der pH-Wert der Lösung mit50%iger NaOH auf 11,8 eingestellt. Danach wird mit entionisiertem Wasser auf einem Endvolumen von 11 eingestellt.
Testverfahren:
Quantitative Gelabtastung auf der Zellsuspension, der überstehenden Flüssigkeit und dem Kuchen.
Stufenausbeute: 100% Gesamtausbeute: 85,6%
Entnahmevolumen: 6,8% des ursprünglichen Zellsuspensionsvolumens
Errechneter Gehalt: 6,2g bGH/l Anreicherungsfaktor: 0,039.
Beispiel 10 100-K-Ultrafiltration
Die 32,61 der in Beispiel 9 erhaltenen geklärten Proteinlösung (297000 OD) werden in getrennte Anteile (6 χ 5,41) mit jeweils einer Absorption von 50000-60000 OD geteilt. Jeder Anteil wird getrennt durch ein handelsübliches Ultrafilterkassettensystem (Pellicon der Firma Millipore, Bedford, MA) mit drei 100000 Molekulargewicht-Schnittkassetten (Type PTHK) von jeweils 4645cm2 Fläche filtriert. Der erste Anteil wird auf 11 Rückstandvolumen konzentriert. Das Ultrafiltrat wird gesammelt, mittels UV-Licht getestet und weiterverarbeitet. Der Rückstand wird mit frischem 1OmM Natriumboratpuffer bei einem pH-Wert von 11,8 aufsein ursprüngliches Volumen verdünnt und gründlich durchgemischt. Danach wird die Charge erneut auf 11 Rückstandvolumen konzentriert. Das Ultrafiltrat wird gesammelt und mit dem ersten Ultrafiltrat vereinigt. Wenn der Gesamtbetrag derOD-Absorption in den Ultrafiltraten laufend 20% der OD-Absorption der Anfangscharge auf das.Ultrafilter entspricht, wird ein Rückstand-Volumen bei der nächsten Konzentration von 0,51 anstelle von 11 gewählt. Der Zyklus von Konzentration und Verdünnung mit 1OmM Natriumboratpuffer wird so lange fortgesetzt, bis das Ultrafiltrat aus einem Rückstandvolumen von 0,51 eine Absorption von 280 nm (1cm Küvette) von unter 0,1 aufweist. Dies erfordert normalerweise zwischen 9 und 12 Zyklen aus Ultrafiltration und Verdünnung. Der Endrückstand wird verworfen. Die Strömungsgeschwindigkeiten bei der Ultrafiltration ergeben sich aus der folgenden Tabelle I.
Sämtliche Ultrafiltrate werden danach miteinander vereinigt und mit 6 N HCl auf einen pH-Wert von 9,0 eingestellt. Die anderen 5,4-l-Anteile werden in ähnlicher Weise mit Hilfe des Pellicon-Systems behandelt. Sämtliche bezüglich ihres pH-Werts eingestellten Ultrafiltrate werden dann miteinander vereinigt. Ein typischer Versuch liefert insgesamt 380I Ultrafiltrat mit einer Absorption von 0,26OD/ml entsprechend einem Gesamt-OD-Wertvon 100000 (bei einem pH-Wert von 12) und dauert 24-4Oh bis zur Vervollständigung.
Strömungsgeschwindigkeiten bei der 100 K Molekulargewicht-Ultrafiltration* Bedingungen
Zufuhrgeschwindigkeit Strömungs
pro Einheit Membranfläche geschwindigkeit bei 3 Kassetten (1,39 m2)
Ultrafiltrationsgeschwindigkeit bei am stärksten konzentriertem Rückstand Ultrafiltrationsgeschwindigkeit bei am stärksten verdünnten Rückstand Rezirkulationsgeschwindigkeitbei am stärksten konzentrierten Rückstand Rezirkulationsgeschwindigkeit bei am stärksten verdünnten Rückstand
| 1,72 ml/h cm2 | 24 l/h |
| 2,58 ml/h cm2 | 36 l/h |
| 77,5 ml/h cm2 | 181/min |
| 38,75 ml/h cm2 | 9/1 min |
* Bei einem Einlaßdruck von 343 kPa (Manometerdruck) und einem Rückdruck von 34,3kPa (Manometerdruck).
Testverfahren:
Quantitative Gelabtastung auf Eingabe und Absorption bei 280 nm (1 cm Küvette) auf Entnahme; qualitative Gelchromatographie
Stufenausbeute: 75,5% Gesamtausbeute: 64,6%
Entnahmevolumen: 76% des ursprünglichen Zellsuspensionsvolumens
Errechneter Gehalt: 0,4g bGH/l Anreicherungsfaktor: 0,065.
Zur Bestimmung des Ausmaßes und der Qualität der Trennung werden die zugegebene Charge, der Rückstand und das Ultrafiltrat mit Hilfe von Sepharose CL-6.B (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJl-Gelchromatographie überwacht.
-11- 799 90
Die Bedingungen für die Gelsäule sind:
Durchmesser: 2,6cm;
Länge: 100cm
Gesamtvolumen: 500ml
Porenvolumen: 150ml
Strömungsgeschwindigkeit: 40-60ml/h
Beladung: 50 OD in 5ml
Eluiermittel: 1OmM Natriumborat bei einem pH-Wert von 12
normale Laufzeit: 5 h
Nachweis: 280nm UV.
Puffer für die Gelchromatographie (1OmM Natriumborat bei einem pH-Wert von 12):
Vgl. hierzu Beispiel 9.
Beispiel 11 lonenaustauschchromatographie
Die vereinigten Ultrafiltrate (380I mit einer Absorption von 100000 OD) aus der 100K Ultrafiltration des Beispiels 10 werden mit einer linearen Strömungsgeschwindigkeit von 93cm/h (100 l/h) auf eine Sepharose CL-6B DEAE-Ionenaustauschsäule (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) aufgegeben. Die einen Durchmesser von 37cm und eine Höhe von 15cm aufweisende Säule wird mit zwei Bettvolumina (32I) 1OmM Natriumboratpuffer bei einem pH-Wert von 9,0 gewaschen. Das Eluatausden Aufgabe-und Waschstufen wird verworfen. Eine Stufenänderung im Eluiermittel auf 1OmM Natriumborat: 100 m M Natriumchlorid bei einem pH-Wert von 9 verdrängt das bGH aus der Säule. Die Eluierströmungsgeschwindigkeit beträgt 93cm/h.
Das Fortschreiten der Eluierung wird durch Verfolgen der Absorption des Eluats bei 280 nm überwacht. Der bGH-Peak wird in 4—5 Bettvolumina (84I mit einer Gesamtabsorption von 43000 OD) gesammelt und weiterverarbeitet. Die durchschnittliche Konzentration der bGH-Fraktion beträgt 0,8g bGH/l.
Die Säule wird durch Waschen des Betts mit einer Geschwindigkeit von 93 cm/h entsprechend der folgenden Anweisung regeneriert: Ein Bettvolumen 1 M Natriumacetat, das mit HCI auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt ist, wird auf die Säule appliziert, danach folgend 1,5 Bettvolumina 0,5 N NaOH. Nach der Behandlung mit der NaOH wird die Säule 2 h lang stehengelassen und dann mit 1,5 Bettvolumina 1 M Natriumacetat, das mit HCI auf 3,0 eingestellt ist, gewaschen. Schließlich wird das Bett mit 10 mM Natriumborat (pH-Wert: 9) ins Gleichgewicht gesetzt, indem mindestens drei Bettvolumina Puffer durch das lonenaustauschbett hindurchlaufen gelassen werden. Die Leitfähigkeit und der pH-Wert des Eluats sollten gegen die eintretende Lösung geprüft werden.
Testverfahren:
Absorption bei 280 nm (1 cm Küvette).
Stufenausbeute: 43%
Gesamtausbeute: 27,7%
Entnahmevolumen: 16,8% des ursprünglichen Zeilsuspensionsvolumens
Errechneter Gehalt: 0,8g bGH/1
Anreicherungsfaktor: 2.
Puffer zum Waschen der Säule (1OmM Natriumborat eines pH-Werts von 9):
0,62g Borsäure in 750 ml entionisierten Wassers werden mit konzentrierter HCI auf einen pH-Wert von 10 eingestellt, mit entionisiertem Wasser auf 11 verdünnt und erforderlichenfalls erneut auf einen pH-Wert von 9,0 eingestellt.
Eluierpuffer(10mM Natriumborat, 10OmM Natriumchlorid, pH-Wert: 9):
3,81g Natriumboratdecahydrat und 5,85 g Natriumchlorid in 750 ml entionisierten Wassers werden mit konzentrierter HCI auf einen pH-Wert von 9,0 eingestellt, mit entionisiertem Wasser auf 11 verdünnt und erforderlichenfalls erneut auf einen pH-Wert von 9,0 eingestellt.
Regenerationspuffer (1 M Natriumacetat, pH-Wert: 3,0):
136,09g Natriumacetat 3H2O in 750 ml entionisierten Wassers werden mit konzentrierter HCI auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt, mit entionisiertem Wasser auf 11 verdünnt und erforderlichenfalls erneut auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt.
Beispiel 12 Konzentration und Dialyse
Die bGH-Fraktion aus der lonenaustauschstufe (841,43000 OD) des Beispiels 11 wird mit1 N NaOH auf einen pH-Wert von 10,5 eingestellt. Die eingestellte Lösung wird durch Ultrafiltration durch ein Millipore Pellicon-Ultrafilter, das mit drei 10000 Molekulargewicht-Schnittkassetten (Type PTGC) einer Fläche von jeweils 4645 cm2 ausgestattet war, konzentriert, bis die errechnete Absorption bei2S0nm (1cm Küvette) des Rückstands 10 beträgt. Das Ultrafiltrat sollte kein bGH enthalten und wird verworfen. Der Rückstand ist üblicherweise um einen Faktor von grob 20 (4,21 Rückstand) konzentriert. Die Strömungsgeschwindigkeiten sind in der folgenden Tabelle Il angegeben.
Nach der Konzentration des bGH wird die Lösung durch Dialyse gegen NH4OH unter Verwendung des Pellicon-Systems mit der 1 OK Molekulargewicht-Schnittkassette (Diafiltration) entsalzt. Der Rückstand wird kontinuierlich mit 3 mM NH4OH-Lösung (25 Volumina/Volumen Rückstand oder in diesem Falle 1031 3mM NH4OH) versetzt, wobei die Zugabemenge gerade ausreicht, um den Volumenverlust durch Diafiltration auszugleichen. Das Diafiltrat wird verworfen. Es enthält Salze und 10% des eingeführten bGH, wie eine Absorptionsmessung zeigt. Der das entsalzte bGH enthaltende Rückstand wird aus dem Pellicon-System abgezogen. Das Ultrafilter wird nun mit einer geringen Menge 3 mM NH4OH gewaschen, worauf die Waschflüssigkeit mit dem Rückstand vereinigt wird. Das Rückstandvolumen vor Zugabe der Waschflüssigkeit beträgt 4,21 (39000OD) bei einer Konzentration von 14,6bGH/l. Die Strömungsgeschwindigkeiten ergeben sich aus Tabelle III.
-12- 799 90
Strömungsgeschwindigkeiten bei der 10K Molekulargewicht-Ultrafiltration* Bedingungen
Zufuhrgeschwindigkeit Strömungspro Einheit Membranfläche geschwindigkeit bei 3 Kassetten (1,39 m2)
Ultrafiltrationsgeschwindigkeit bei am stärksten konzentrierten Rückstand Ultrafiltrationsgeschwindigkeit bei am stärksten verdünnten Rückstand Rezirkulationsgeschwindigkeit bei am stärksten konzentrierten Rückstand Rezirkulationsgeschwindigkeit bei am stärksten verdünnten Rückstand
| 1,94 ml/h cm2 | 27 l/h |
| 2,58 ml/h cm2 | 36 l/h |
| 9,69 ml/h cm2 | 2,25 l/min |
| 6,46 ml/h cm2 | 1,5 l/min |
* Bei einem Einlaßdruck von 137 kPa (Manometerdruck) und einem Rückdruck von 68,7kPa (Manometerdruck).
Strömungsgeschwindigkeiten für die Diafiltration* gegen 3mM NH4OH Bedingungen
| Zufuhrgeschwindigkeit | Strömungs- |
| pro Einheit Membranfläche | geschwindig |
| keitbei | |
| 3 Kassetten | |
| (1,39 m2) | |
| 2,58 ml/h cm2 | 36 l/h |
| 9,69 ml/h | 2,25 l/min |
Ultrafiltrationsgeschwindigkeit Rezirkulationsgeschwindigkeit
* Bei einem Einlaßdruck von 103 kPa (Manometerdruck) und einem Rückdruck von 34,3 kPa (Manometerdruck)
Testverfahren:
Absorption bei 280 nm (1 cm Küvette).
Stufenausbeute: 90% Gesamtausbeute: 25% Entnahmevolumen: 0,84% des ursprünglichen Zellsuspensionsvolumens Errechneter Gehalt: 14,6bGH/l Anreicherungsfaktor: 18,3.
Beispiel 13 Gefriertrocknung
Der Rückstand und die Waschflüssigkeit aus der Dialysestufe (4,21,39000OD bei einer Konzentration von 14,6g bGH/l) werden in einem großen Glasgefäß „schalegefroren". Nun wird das Glasgefäß 24—48 h lang an einen Laboratoriumsgefriertrockner angeschlossen, bis der Gefäßinhalt zur Trockene lyophilisiert ist. Die Außenfläche des Glasgefäßes ist während des gesamten Trocknungszyklus der Außentemperatur ausgesetzt. Es findet kein nachweisbarer bGH-Verlust statt. Das bGH (61,3 g) fällt als
flaumiges, weißes Pulver an.
Testverfahren:
Absorption des eingegebenen Materials und Freigabetests am trockenen bGH.
Stufenausbeute: 100% Gesamtausbeute: 25% Entnahmevolumen: 0,012% des ursprünglichen Zellsuspensionsvolumens Errechneter Gehalt: 100% Maischevolumen Anreicherungsfaktor:
Claims (45)
- -1- 799Patentansprüche:1. Verfahren zur Gewinnung eines gereinigten eukaryotischen Wachstumshormons oder Analogen desselben aus einer Bakterienzelle, in der das eukaryotische Wachstumshormon oder Analoge desselben durch Expression einer DNA-Sequenz mit Kodierung für das betreffende Hormon oder Analoge desselben erzeugt wurde, dadurch gekennzeichnet, daß mana) die Zellwand der Bakterienzelle oder von Fragmenten derselben zur Gewinnung eines Lysats aufbricht;b) aus dem Lysat ein teilchenförmiges und unlösliches Material enthaltenden Niederschlag abtrennt;c) eine Suspension des abgetrennten Niederschlags in einer geeigneten Pufferlösung zubereitet;d) die Suspension zur Herbeiführung eines Kontakts zwischen Flüssigkeit und Feststoffen behandelt;e) von der Suspension, in derein FlüssigkeitsVFeststoff-Kontakt stattgefunden hat, ausgefallenes Material teilweise oder vollständig abtrennt;f) den abgetrennten Niederschlag zur Bildung einer Lösung in ausreichender Menge in einer wäßrigen Lösung in Lösung bringt und den pH-Wert auf einen geeigneten alkalischen Wert einstellt;g) das löslich gemachte Hormon oder Analoge desselben von sonstigen Zellkomponenten durch Ultrafiltration unter geeigneten Bedingungen abtrennt, um ein Ultrafiltrat mit dem Hormon oder Analogen desselben und einen Rückstand zu erhalten, undh) das löslich gemachte Hormon oder Analoge desselben zu seinerweiteren Reinigung und Konzentration einer Behandlung unterwirft, um dabei gereinigtes Hormon oder gereinigtes Analoges desselben reindarzustellen.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hormon oder Analoges desselben ein tierisches Wachstumshormon oder Analoges desselben herstellt.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hormon oder Analoges desselben Rinderwachstumshormon oder ein Analoges desselben herstellt.
- 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Analoge die an das N-Ende der Phenylalaninform von natürlichem Rinderwachstumshormon addierte Aminosäuresequenz Met-Asp-Gln aufweist und daß man als Bakterienzelle Escherichia coli Stamm ATCC Nr.39806 verwendet.
- 5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Analoge einen an das N-Ende der Phenylalaninform von natürlichem Rinderwachstumshormon addierten Methioninrest aufweist und daß man als Bakterienzelle Escherichia coli Stamm ATCC Nr.39785 verwendet.
- 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hormon oder Analoges desselben menschliches Wachstumshormon oder ein Analoges desselben herstellt.
- 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Analoge die Aminosäuresequenz von natürlichem menschlichem Wachstumshormon beginnend bei Met14 aufweist und daß man als Bakterienzelle Escherichia coli Stamm ATCC Nr.39386 verwendet.
- 8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Analoge die Aminosäuresequenz von natürlichem menschlichem Wachstumshormon mit vorrangierendem Methionin am N-Ende aufweist und daß man als Bakterienzelle Escherichia coli Stamm ATCC Nr.39384 verwendet.
- 9. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hormon Schweinewachstumshormon oder ein Analoges desselben herstellt.
- 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Analoge einen an das N-Ende der Phenylalaninform von natürlichem Schweinewachstumshormon addierten Methioninrest aufweist und daß man als Bakterienzelle Escherichia coli Stamm ATCC Nr.39804 verwendet.
- 11. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hormon oder Analoges desselben Hühnerwachstumshormon oder ein Analoges desselben herstellt.
- 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Analoge einen an das N-Ende der Phenylalaninform von natürlichem Hühnerwachstumshormon addierten Methioninrest aufweist und daß man als Bakterienzelle Escherichia coli Stamm ATCC Nr.39792 verwendet.
- 13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man vor Stufe (a) die Bakterienzelle oder Bruchstücke derselben in der Gärmaische in Suspension hält oder in einer geeigneten gepufferten Lösung bei einem neutralen pH-Wert suspendiert.
- 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als neutralen pH-Wert etwa 7,4 wählt.
- 15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe (a) die Zellen mechanisch aufbricht.
- 16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Lysat vor der Abtrennung des teilchenförmigen Materials mit einer geeigneten Menge entionisierten Wassers verdünnt.
- 17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung in Stufe (b) oder in Stufe (e) durch Zentrifugieren bewirkt.
- 18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung in Stufe (b) oderin Stufe (e) durch Ultrafiltration bewirkt.
- 19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe (d) zusätzlich die Suspension eine geeignete Zeit lang mit einem zum Verdauen von in der Suspension enthaltenen Polysacchariden fähigen Enzym in Kontakt bringt.
- 20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym Lysozym verwendet.
- 21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung in Stufe (d) zur Herbeiführung eines FlüssigkeitsVFeststoff-Kontakts als Beschallung durchführt.
- 22. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man vor Herbeiführungeines Flüssigkeits-/Feststoff-Kontakts der Suspension in Stufe (d) die Suspension mit einer geeigneten Menge eines geeigneten Netzmittels versetzt und ferner die Suspension eine geeignete Zeit lang inkubiert.
- 23. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das aus der Suspension, in der ein Flüssigkeits-/Feststoff-Kontakt stattgefunden hat, in Stufe (e) teilweise oder vollständig abgetrennte ausgefällte Material in einer geeigneten Menge eines geeigneten Mediums resuspendiert, die erhaltene Suspension unter geeigneten Bedingungen einer FlussigkeitS'/Feststoff-Kontaktierung unterwirft und das dabei angefallene ausgefällte Material von der einer Flüssigkeits-/ Feststoff-Kontaktierung unterworfenen Suspension vor dem Inlösungbringen in Stufe (f) abtrennt.-2- 799
- 24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man als geeignetes Medium eine gepufferte oder nichtgepufferte wäßrige Lösung verwendet.
- 25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man den angefallenen Niederschlag mindestens ein weiteres Mal resuspendiert, einer Flüssigkeits-/Feststoff-Kontaktierung unterwirft und abtrennt.
- 26. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man beim Inlösungbringen in Stufe (f) einen alkalischen pH-Wert von etwa 9,0-12,0 wählt.
- 27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man nach dem Inlösungbringen des Niederschlags bei einem pH-Wert von etwa 9,0-12,0 den pH-Wert auf etwa 10,5 senkt.
- 28. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man der in Stufe (f) erhaltenen Lösung eine geeignete Menge einer geeignet konzentrierten wäßrigen Natriumboratlösung einverleibt.
- 29. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Stufe (f) angefallene Lösung durch Flüssigkeits-/ Feststoff-Kontakt unter geeigneten Bedingungen klärt, die einem Flüssigkeits-/Feststoff-Kontakt unterworfene Lösung unter geeigneten Bedingungen zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit abtrennt und die Flüssigkeit filtriert, um eine das Hormon oder dessen Analoges enthaltene geklärte Lösung zu gewinnen.
- 30. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung durch Ultrafiltration in Stufe (g) mit einer geeigneten Membran eines Schnittpunktes (cut-off point) von etwa 100K Molekulargewicht durchführt.
- 31. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der in Stufe (g) angefallene Rückstand vor oder nach Durchführung der Behandlung in Stufe (h) mindestens noch einmal einer Ultrafiltration unterwirft.
- 32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß man den Rückstand vor der erneuten Ultrafiltration mit einem geeigneten Puffer bei einem geeigneten alkalischen pH-Wert verdünnt.
- 33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß man als alkalischen pH-Wert etwa 9,0-12,0 wählt.
- 34. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verdünnung und Ultrafiltration mindestens einmal wiederholt.
- 35. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß man den Rückstand während der Ultrafiltration bei praktisch konstantem Volumen hält.
- 36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ultrafiltration bei praktisch konstantem Rückstandsvolumen mindestens noch einmal wiederholt.
- 37. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung des in Lösung gebrachten Hormons in Stufe (h) als lonenaustauschchromatographie durchführt.
- 38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß man die lonenaustauschchromatographie mit einem aminhaltigen lonenaustauscherharz durchführt.
- 39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß man als aminhaltiges lonenaustauscherharz Diethyläminoethyldextran oder -sepharose verwendet.
- 40. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das gereinigte Hormon oder Analoge desselben durch Ultrafiltration konzentriert.
- 41. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das gereinigte Hormon oder Analoge desselben durch Dialyse und anschließende Trocknung weiter reinigt.
- 42. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß man die Dialyse gegen eine Lösung mit einer geeigneten Konzentration eines geeigneten Salzes durchführt.
- 43. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß man als geeignetes Salz Ammoniumhydroxid oder Ammoniumbicarbonat verwendet.
- 44. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß man die Trocknung als Lyophilisierung durchführt.
- 45. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß man die Trocknung als Sprühtrocknung unter geeigneten Bedingungen durchführt.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US64443584A | 1984-08-27 | 1984-08-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD236942A5 true DD236942A5 (de) | 1986-06-25 |
Family
ID=24584893
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD85279990A DD236942A5 (de) | 1984-08-27 | 1985-08-26 | Verfahren zur gewinnung eines gereinigten eukaryotischen wachstumshormons |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD236942A5 (de) |
| ZA (1) | ZA856226B (de) |
-
1985
- 1985-08-16 ZA ZA856226A patent/ZA856226B/xx unknown
- 1985-08-26 DD DD85279990A patent/DD236942A5/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA856226B (en) | 1986-03-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69103755T2 (de) | Wachstumshormonkristalle und verfahren zu deren herstellung. | |
| DE69331507T2 (de) | Verfahren zur Reinigung von menschlichem, rekombinantem Serumalbumin | |
| DE69929612T2 (de) | Purifikation von viruspräparaten | |
| DE3876401T2 (de) | N-terminale fragmente von menschlichem serumalbumin. | |
| DE2535554C2 (de) | Biologisches Verfahren | |
| DE69432859T2 (de) | Verfahren zur reinigung von kollagenase | |
| DE2333883C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von hochgereinigtem Humanalbumin | |
| DE69121018T2 (de) | Lipopeptid Deacylase | |
| DE3587391T2 (de) | Verfahren zur Rückgewinnung von gereinigten Wachstumshormonen aus genetisch modifizierten Mikro-organismen. | |
| DE3853224T2 (de) | Produktion von Proteinen in aktiver Form. | |
| DE69021729T2 (de) | Verfahren zur gewinnung von natürlich hergestelltem chymosin. | |
| DE2721027A1 (de) | Verfahren zur reinigung von glucagon | |
| DE2456589A1 (de) | Verfahren zur herstellung eines plasminogen-aktivators und denselben enthaltendes mittel | |
| DE3485923T2 (de) | Dna-gen, verfahren zu seiner herstellung und dieses gen enthaltendes plasmid. | |
| DE2353318A1 (de) | Verbessertes verfahren zur herstellung von plasminogen-aktivator | |
| DE3886281T2 (de) | Herstellung eines Enzyms des beta-Glucuronidase-Typs, Glycyrrhizin-Hydrolyse und Herstellung von beta-Glycyrrhetinsäure. | |
| DD236942A5 (de) | Verfahren zur gewinnung eines gereinigten eukaryotischen wachstumshormons | |
| EP0343275A1 (de) | Verfahren zur Herstellung eines hochreinen, virusfreien Antihämophiliefaktors mittels Chromatographie | |
| DE69434126T2 (de) | Verfahren zum Entfärben von menschlichen Serum-Albumin | |
| DE2333884C3 (de) | Verfahren zum Herstellen von hochgereinigtem Humanalbumin | |
| DE2259404A1 (de) | Verfahren zur gewinnung von orgotein aus tierischem gewebe | |
| DE2626626C2 (de) | Verfahren zur Gewinnung von löslicher Invertase aus Hefe | |
| AT392003B (de) | Verfahren zur herstellung eines insbesondere zur wundheilung oder zur behandlung in der geriatrie verwendbaren wirkstoffes aus saeugetierblut durch papainhydrolyse und ein einen solchen wirkstoff enthaltendes praeparat | |
| DE2555587C3 (de) | Verfahren zur Extraktion und Sammlung von Kallidinogenase | |
| DE1810823B2 (de) | Verfahren zur entfernung von verunreinigungen von geschmacksverschlechternden, unspezifischen proteolytischen enzymen aus labfermenten von mikroorganismen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ENJ | Ceased due to non-payment of renewal fee |