DD237677A5 - PROCESS FOR PREPARING ALPHA-ERGOKRYPTIN - Google Patents

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DD237677A5
DD237677A5 DD85276810A DD27681085A DD237677A5 DD 237677 A5 DD237677 A5 DD 237677A5 DD 85276810 A DD85276810 A DD 85276810A DD 27681085 A DD27681085 A DD 27681085A DD 237677 A5 DD237677 A5 DD 237677A5
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ergokryptin
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DD85276810A
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Inventor
Detlef Wilke
Alfred Weber
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Schering Ag,Wb
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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
    • C12P17/183Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system containing an indolo[4,3-F,G]quinoleine nucleus, e.g. compound containing the lysergic acid nucleus as well as the dimeric ergot nucleus

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Herstellung von a-Ergokryptin beansprucht, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man den Mikroorganismus Claviceps paspali DSM 2836 kultiviert und das gebildete a-Ergokryptin nach Beendigung der Fermentation isoliert.A process for the production of α-ergokryptine is claimed, which comprises cultivating the microorganism Claviceps paspali DSM 2836 and isolating the α-ergokryptin formed after the end of the fermentation.

Description

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel der Erfindung ist die Suche nach einem Verfahren zur Herstellung von reinem a-Ergokryptin.The aim of the invention is the search for a process for the preparation of pure a-ergokryptin.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Er wurde nun gefunden, daß ein Pilzstamm Claviceps spec. α-Ergokryptin in hohen Ausbeuten und neben Spuren von Agroclavin und ansonsten frei von anderen Ergotalkaloiden in das Kulturmedium ausscheidet. Dieser Stamm Claviceps spec, wurde aus einem Mutterkorn eines wild wachsenden Schlickgrases der Species Spartina alterniflora isoliert. Er hat die interne Bezeichnung SCHERING, MBCE 5227 und ist bei der deutschen Sammlung für Mirkoorganismen unter der Nummer DSM 2836 hinterlegt.He was now found that a fungus strain Claviceps spec. α-ergocryptine in high yields and in addition to traces of agroclavin and otherwise free from other ergot alkaloids in the culture medium excreted. This strain Claviceps spec., Was isolated from an ergot of a wild growing silt grass of the species Spartina alterniflora. It has the internal name SCHERING, MBCE 5227 and is deposited with the German collection for microorganisms under the number DSM 2836.

Der Stamm bildet auf Agrarmedien mit Saccharose als Kohlenstoffquelle und Asparagin, als Stickstoffquelle flache, gelbliche Kolonien aus kompakten Mycel. Der Koloniendurchmesser beträgt nach 7 Tagen Kulturzeit 2 bis 3cm und nach 20 Tagen Kulturzeit 6 bis 8cm.The strain forms flat, yellowish colonies of compact mycelium on agricultural media with sucrose as the carbon source and asparagine, as a source of nitrogen. The colon diameter is 2 to 3cm after 7 days culture time and 6 to 8cm after 20 days culture time.

Auf Agar-Nährmedium mit Saccharose als Kohlenstoffquelle und Ammoniumsuccinat oder Ammoniumeitrat als Stickstoffquelle bildet der Pilz langsam wachsende, gewölbte und von der Agar-Oberfläche leicht abgehobene gelblich braune Kolonien. Die Kolonie hat eine durch Luftmycelbildung rauhe, insidiöse Oberfläche. Der Kolonienrand ist ausgefranst. Der Durchmesser der Kolonie beträgt nach 14 Tagen 2 bis 3cm und nach 30 Tagen 6 bis 7cm. Neben hyphenartigen Mycel treten kurze, runde bis unregelmäßig geformte, häufig in Ketten liegende und mit stark lichtbrechenden Vakuolen angefüllte Zellen auf (sklerotialer Zelltyp). Der Hyphendurchmesser beträgt 3 bis 4pm. Die vakuolisierten Zellen haben einen Durchmesser von 6 bis 10 pm und eine Länge von 10 bis 25pm.On agar nutrient medium with sucrose as a carbon source and ammonium succinate or ammonium citrate as a nitrogen source, the fungus forms slow-growing, domed and yellowish brown colonies slightly off the agar surface. The colony has a rough, insidious surface due to aerial mycelia. The colonial margin is frayed. The diameter of the colony is 2 to 3cm after 14 days and 6 to 7cm after 30 days. In addition to hypheniform mycelium occur short, round to irregularly shaped, often in chains and filled with highly refractive vacuoles cells (sclerotial cell type). The hyphal diameter is 3 to 4pm. The vacuolated cells have a diameter of 6 to 10 pm and a length of 10 to 25pm.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter Bedingungen durchgeführt, die man überlicherweise zur Anzucht von Pilzkulturen für eine Stoffwechselsynthese anwendet. So werden zunächst in allgemein üblichen Vorversuchen die günstigsten Fermentionsbedingungen, wie z. B. die Auswahl des günstigsten Nährmediums, der technischen Bedingungen wie Temperatur, Belüftung pH-Wert und der optimalen Zeiten für die Germination und die Entwicklung des Mikroorganismus ermittelt.The process according to the invention is carried out under conditions which are customarily used for the cultivation of fungal cultures for a metabolic synthesis. Thus, the most favorable fermentation conditions, such as. As the selection of the cheapest nutrient medium, the technical conditions such as temperature, aeration pH and the optimal times for the germination and development of the microorganism determined.

Als Kohlenstoffquelle kann für das Fermentationsmedium beispielsweise Glucose oder Saccharose verwendet werden. Als Stickstoffquelle dient unter anderem Asparagin, Ammoniumsuccinat oder Ammoniumsulfat. Ferner enthält das Medium die nötigen Wuchsstoffe (beispielsweise Hefeextrakt) und Mineralstoffe (Kalium-, Magnesium-, Kalzium-, Eisen- und Zink-Kationen, sowie Sulfat, Phosphat, Nitrat und Chlorid-Anionen) in der üblicherweise angewendeten Konzentration.As the carbon source, for example, glucose or sucrose may be used for the fermentation medium. The nitrogen source used is, among others, asparagine, ammonium succinate or ammonium sulfate. Furthermore, the medium contains the necessary growth substances (for example yeast extract) and minerals (potassium, magnesium, calcium, iron and zinc cations, as well as sulfate, phosphate, nitrate and chloride anions) in the concentration commonly used.

Die Fermentation kann ein- oder zweistufig erfolgen, wobei das für die Vorkultur verwendete Medium mit dem der Hauptkultur identisch sein oder von diesem verschieden sein kann. Für die Vorkultur wird vorzugsweise Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet, für die Hauptkultur vorzugsweise Saccharose. Das Vorkulturmedium enthält vorzugsweise 10 bis 100mg/l Kohlenstoffquelle, das Hauptkulturmedium vorzugsweise 100 bis 300mg.The fermentation can be carried out in one or two stages, wherein the medium used for the preculture may be identical to or different from the main culture. For the preculture glucose is preferably used as carbon source, for the main culture preferably sucrose. The preculture medium preferably contains 10 to 100 mg / l carbon source, the main culture medium preferably 100 to 300 mg.

Zu Beginn der Fermentation wird der pH-Wert des Mediums vorzugsweise in einem Bereich von 4 bis 6 eingestellt. Die Züchtungstemperatur liegt im Bereich von etwa 10 bis 35°C, vorzugsweise im Bereich von 20 bis 300C. Die Kulturbedingungen sind streng aerob. Die optimale Fermentationszeit wird durch Analyse des gebildeten a-Ergokryptins in üblicher Weise ermittelt.At the beginning of the fermentation, the pH of the medium is preferably adjusted in a range of 4 to 6. The cultivation temperature is in the range of about 10 to 35 ° C, preferably in the range 20-30 0 C. The culture conditions are strictly aerobic. The optimal fermentation time is determined by analysis of the formed a-ergokryptins in the usual way.

Nach erfolgter Fermentation wird das gebildete α-Ergokryptin in an sich bekannter Weise isoliert, beispielsweise indem man die Fermentationsansätze mit einem nicht mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Ethylacetat, Methylisobutylketon, Dichlormethan, Chloroform oder Tetrachlorethan extrahiert, die Extrakte einengt und das erhaltene Rohprodukt durch Chromatographie und/oder Kristallisation reinigt.After the fermentation, the α-ergokryptin formed is isolated in a conventional manner, for example by extracting the fermentation mixtures with a water-immiscible organic solvent such as ethyl acetate, methyl isobutyl ketone, dichloromethane, chloroform or tetrachloroethane, the extracts are concentrated and the crude product obtained Purifies chromatography and / or crystallization.

Das nachfolgende Ausführungsbeispiel dient zur Erläutertung des erfindungsgemäßen Verfahrens.The following embodiment serves to explain the method according to the invention.

Beispielexample

Claviceps spec. DSM 2836 wird auf einem Nährmedium angezüchtet, welches folgende Komponenten enthält:Claviceps spec. DSM 2836 is grown on a nutrient medium containing the following components:

Saccharose (100g/l), Citronensäure (10g/l), Hefeextrakt (0,1 g/l), Kaliumdihydrogenphosphat (500mg/l), Magnesiumsulfat-Heptahydrat (300mg/l), Ammoniumsulfat (6g/l), Calciumnitrat-Tetrahydrat (1 g/l), Einensulfat-Heptahydrat (7mg/l), Zinksulfat-Heptahydrat(6mg/I), Agar (16 g/l). Das Nährmedium ist auf pH 5,1 eingestellt. Die Anzuchtskultur wird 5 bis 20 Tagelang bei 300C im Brutschrank aufbewahrt.Sucrose (100 g / l), citric acid (10 g / l), yeast extract (0.1 g / l), potassium dihydrogen phosphate (500 mg / l), magnesium sulfate heptahydrate (300 mg / l), ammonium sulfate (6 g / l), calcium nitrate tetrahydrate (1 g / l), one sulfate heptahydrate (7 mg / l), zinc sulfate heptahydrate (6 mg / l), agar (16 g / l). The nutrient medium is adjusted to pH 5.1. The seed culture is stored for 5 to 20 days at 30 0 C in the incubator.

Ein ca. 1 cm2 großes Mycelstückwird mittels eines Ultraturrax unter sterilen Bedingungen in 5 ml physiologischerAn approximately 1 cm 2 large piece of mycelium is physiological by means of an Ultraturrax under sterile conditions in 5 ml

Kochsalzlösung zerkleinert und damit 50ml eine Vorkultur enthaltend Glucose (HOg/l). Citronensäure (7,5g/l). Kaliumdihydrogenphosphat (0,59g/l), Magnesiumsulfat-Heptahydrat (300mg/l), Ammoniumsulfat (6g/l), Eisen(ll)-sulfat-Heptahydrat (7 mg/1), Zinksulfat-Heptahydrat (7 mg/1). Calziumnitrat-Tetrahydrat(1 g/l), Hefeextrakt (0,1 g/l) — eingestellt auf pH 5,1 —die sich in einem 500 ml Erlenmeyerkolben befindet, beimpft und auf einem Rundschüttler 4 Tage lang bei24°Cund 220 Umdrehungen pro Minute kultiviert.Saline solution comminuted and thus 50ml a preculture containing glucose (HOg / l). Citric acid (7.5g / l). Potassium dihydrogen phosphate (0.59 g / l), magnesium sulfate heptahydrate (300 mg / l), ammonium sulfate (6 g / l), ferrous sulfate heptahydrate (7 mg / l), zinc sulfate heptahydrate (7 mg / l). Calcium nitrate tetrahydrate (1 g / L), yeast extract (0.1 g / L) - adjusted to pH 5.1 - which is in a 500 ml Erlenmeyer flask, inoculated and placed on a rotary shaker for 4 days at 24 ° C and 220 revolutions per minute Cultivated minute.

5ml der so erhaltenen Vorkultur werden in 80 ml eines Mediums enthaltend Saccharose (200g/l), Citronensäure (10g/l), Hefeextrakt (0,1 g/l), Kaliumdihydrogenphosphat (500mg/l), Magnesiumsulfat-Haptahydrat (300mg/l), Ammoniumsulfat (6g/l), Calciumnitrat-Tetrahydrat (1 g/l), Eisensulfat-Heptahydrat (7 mg/l) und Zinksulfat-Heptahydrat (6mg/l) — eingestellt auf ph 5,1 — die sich in einem 500ml Erlenmeyerkolben befindet, überführt und 9 Tage lang bei 240C auf einem Rundschuttier mit 240 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Dann wird das Kulturmedium abfiltriert und der Gehalt an a-Ergokryptin mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (FreseniusZ. Anal. Chem. 303,1980,208) ermittelt. Die Konzentration des Kulturfiltrates beträgt 525 mg/l.5 ml of the preculture thus obtained are dissolved in 80 ml of a medium containing sucrose (200 g / l), citric acid (10 g / l), yeast extract (0.1 g / l), potassium dihydrogen phosphate (500 mg / l), magnesium sulfate haptahydrate (300 mg / l ), Ammonium sulfate (6g / l), calcium nitrate tetrahydrate (1g / l), ferric sulphate heptahydrate (7mg / l) and zinc sulphate heptahydrate (6mg / l) - adjusted to pH 5.1 - resulting in a 500ml Erlenmeyer flask is located, transferred and shaken for 9 days at 24 0 C on a round decker at 240 revolutions per minute. The culture medium is then filtered off and the content of α-ergokryptin is determined by means of high pressure liquid chromatography (FreseniusZ, Anal. Chem., 303, 1980,208). The concentration of the culture filtrate is 525 mg / l.

Claims (1)

Erfindungsanspruch:Invention claim: Verfahren zur Herstellung von α-Ergokryptin, gekennzeichnet dadurch, daß man den Mikrorganismus Claviceps paspali DSM2836 kultiviert und das gebildete a-Ergokryption nach Beendigung der Fermentation isoliert.Process for the preparation of α-ergokryptine, characterized in that the microorganism Claviceps paspali DSM2836 is cultivated and the a-ergokryption formed is isolated after completion of the fermentation. Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von a-Ergokryptin.The invention relates to a process for the preparation of α-ergokryptine. Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions a-Ergokryptin = 9,10a-Dihydro-12'-hydroxy-241-methyl-ethyl)-5'a-(2-methylpropyl)-ergotaman-3',6',18-trion ist bekanntlich pharmakologisch wirksam. Nach den bisher bekannten Verfahren wird es aber auf fermentativem Wege nur im Gemisch mit anderen Ergotalkaloiden und Peptidalkaloiden erhalten (DE-OS 31 04151). Demzufolge ist seine Herstellung und Isolierung sehr aufwendig.A-ergokryptine = 9,10a-dihydro-12'-hydroxy-241-methyl-ethyl) -5'a- (2-methylpropyl) -ergotaman-3 ', 6', 18-trione is known to be pharmacologically active. According to the previously known methods, however, it is obtained by fermentation only in a mixture with other ergot alkaloids and Peptidalkaloiden (DE-OS 31 04151). Consequently, its production and insulation is very expensive.
DD85276810A 1984-06-01 1985-05-30 PROCESS FOR PREPARING ALPHA-ERGOKRYPTIN DD237677A5 (en)

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