DD239222A1 - Verfahren zur herstellung von plasmid-dna vom cole1-typ - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Plasmid-DNA vom ColE1-Typ. Die erfindungsgemaesse Aufgabe, Plasmid-DNA nach einem einfachen oekonomischen Verfahren ohne Zusatz von Chloramphenicol in hohen Ausbeuten zu erzeugen, wird dadurch geloest, dass man relaxed kontrollierte Staemme von Escherichia coli und andere Enterobacteriaceae durch Aminosaeurelimitation in eine stationaere Wachstumsphase bringt und aus der Zellsuspension die Plasmid-DNA nach bekannten Verfahren isoliert. Mit dieser Methode, die sich durch eine bestechende Einfachheit im Vergleich mit bisher genutzten technischen Loesungen auszeichnet, koennen noch hoehere Plasmidausbeuten erzielt werden als mit bisher international ueblichen Verfahren. Insbesondere wird hier erstmalig eine neue Variante vorgelegt, wonach Plasmide, die durch die bisherigen Verfahren (Amplifikation mit Chloramphenicol) nicht zu vermehren sind, in hoechster Ausbeute praepariert werden koennen (z. B. pBR 325, pBR 328). Dieses Verfahren ist nicht nur fuer alle Forschungslaboratorien von Bedeutung, die sich mit molekularbiologischen/gentechnischen Fragestellungen befassen, sondern in gleicher Weise fuer alle Einrichtungen, die an der Isolation von Plasmid-DNA interessiert sind (Produktion von Biochemikalien, Produktion von Stoffen mit Hilfe der Gentechnik). Schliesslich koennen auch E. coli relA-Staemme als Expressionswirte zum Einsatz gelangen.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Plasmid-DNA vom CoIEI-Typ in höchsten Ausbeuten für folgende Gebiete
— alle molekularbiologischen/gentechnischen Laboratorien, die an der Isolation von Plasmid-DNA (pBR 322, pBR 325, rekombinanter Plasmide und dergleichen) interessiert sind,
— Produktion von Plasmid-DNA als Fein- und Biochemikalie in der chemisch-pharmazeutischen Industrie,
— Produktion rekombinanter DNA als molekulare Sonden beispielsweise für die Virusdiagnostik,
— chemisch-pharmazeutische Insustrie, sofern mit Hilfe gentechnischer Methoden Produktsynthesen betrieben werden.
Die bisherfürdie Plasmidpräparation verwendeten Escherichia coli-Stämme sind stringent kontrolliert (E.coli rel A+). Nach den bekannten Verfahren werden die Zellen in synthetischen oder komplexen Medien in die stationäre Phase gebracht und anschließend die Plasmid-DNA mit geringen Ausbeuten, beispielsweise 160/u.g/i gewonnen. Ein anderes Verfahren beruhtauf dem Einsatz von Chloramphenicol. Da Chloramphenicol in der logarithmischen Wachstumsphase (O.D.50o bei etwa 0,8-1,0) zugesetzt werden muß, ist eine Überwachung des Wachstumsverlaufs erforderlich. Nach 5- bis 8stündiger Kultur (in Abhängigkeit vom Animpftiter sowie vom physiologischen Zustand des Inokulums) wird Chloramphenicol zugegeben. Die Plasmidausbeute bezogen auf Biomasse ist zwar hoch, aber unter Bezug auf die Ausbeute pro I Kulturflüssigkeit, relativ gering, da das Wachstum der Bakterien durch Chloramphenicolzugabe gestoppt wird (etwa 800/xg-2mg/l) (NORGARD et al., J.Bacteriol.138, 270-272 [1979], MARKO et al.. Anal. Biochem. 121,382-387 [1982]). Außerdem hat diese Methodeden Nachteil, daß eine Vermehrung von Plasmiden, die Chloramphenicolresistenz-Gene tragen, nicht möglich ist. Es ist weiter bekannt, daß nach Fütterung von E. coli-rel A-Mutanten mit Valin bzw. nach Leucin-Limitation eine Stimulation der Synthese von pBR322-DNA stattfindet. Bei stringentkontrollierten E.coli-rel A+-Stämmen konnte dagegen nach Leucin-Limitation eine drastische Steigerung der für das Wachstum erforderlichen hochphosphorylierten Guanosinucleotide(p)ppGpp und eine Stagnation der Bildung von Plasmid-DNA beobachtet werden (HECKER et al., Mol. Gen. Gent. 190,355-357 [1983]).
Das Ziel der Erfindung besteht darin, auf rationelle Weise und ohne Einsatz von Antibiotica Plasmid-DNA für gentechnische Zwecke, als Biochemikalie oder für die Diagnostik herzustellen.
Es bestand daher die Aufgabe, ein Verfahren zu entwickeln, welches eine einfachere mikrobiologische Handhabung der Plasmidamplifikation ohne Zusatz von Chloramphenicol erlaubt und ferner höhere Ausbeuten ergibt. Es soll auch bei Plasmiden einsetzbar sein, die Chloramphenicolresistenz-Gene tragen. Diese Aufgabe wird nach der Erfindung dadurch gelöst, daß man relaxed kontrollierte Stämme von E.coli oder anderer Enterobacteriaceae durch Aminosäurelimitation in eine stationäre Wachstumsphase bringt, wodurch eine starke Bildung der entsprechenden Plasmide vom E. coli 1-Typ eintritt. Dabei kann man entsprechend von vorteilhaften Varianten der Erfindung so verfahren, daß die Kultivierung bei einem Überschuß von Glukose,
NHj und Phosphat entweder in Batch-Kultur bis zur Aminosäurelimitation oder unter Fed-Batch-Bedingungen bei Zufütterung von Aminosäuren in limitierenden Konzentrationen oder im Chemostaten unter Aminosäurelimitation bei niedrigen Verdünnungsraten erfolgt. In jedem Fall wird unter den Bedingungen der Aminosäurelimitation die gesamte DNA-Synthesekapazität der Zelle auf die Plasmidvermehrung konzentriert. Diese Ausbeuteerhöhung trifft beispielsweise auf die bekannten Plasmide pBR 322, pBR 325 ebenso zu wie für rekombinante Plasmide mit fremden DNA-Sequenzen. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet somit gegenüber der Amplifikation mit Chloramphenicol folgende Vorteile:
1. Vermehrung von Plasmiden, die Chloramphenicolresistenz-Gene tragen und deshalb durch Chloramphenicol nicht zu amplifizieren sind (z. B. pBR 325),
2. Einsparung von Chloramphenicol in einer Größenordnung von 200mg/l,
3. Da der Plasmidgehalt in der stationären Phase des Wachstums mehr als 50 Stunden stabil bleibt, genügt es, den Fermentorzu beimpfen und nach 1 oder 2 Tagen zu ernten. Das Verfahren ist so einfacher zu handhaben.
4. E. coli relA-Zellen, deren Plasmide durch Aminosäurehunger amplifiziert wurden, sind potentiell geeignete Expressionswirte. Der hohe Plasmidgehalt sichert nach Zugabe der zum Wachstum benötigten Aminosäuren für einige Stunden eine Steigerung der Expression derauf dem Plasmid lokalisierten Gene um den Faktor 5-10.
Die Erfindung wird nachstehend anhand eines Ausführungsbeispiels erläutert.
Zellen von Escherichia coli CP 79 (rel A, thr~, leu", his", arg", thi", siehe HECKER et al., 1983) werden in folgendem Kulturmedium unter Sauerstoffeintrag (Schüttelkultur oder Belüftungskultur) bei 300C bis in die stationäre Wachstumsphase gebracht (Bestandteile pro Liter):
6,05 g Tris-Puffer 20 g Glukose
5,80 g Maleinsäure IOmgThiamin
2,5OgNaCI 300mgL-Threonin
2,00 g KCI 300 mg L-Leucin
1,0OgNH4CI 300 mg L-Histidin
1,015 g MgCI2-6 H2O 300mgL-Arginin
0,142 g-Na2SO4
1,0OgNa2HPO4 pH-Wert 7,0.
(bei einfach-auxotrophen rel Α-Stämmen genügt die Zugabe von einer Aminosäure). Anstelle der Aminosäuren können auch „Casamino acids" oder Hefeextrakt eingesetzt werden.
Der Plasmidgehalt pro Liter, präpariert nach BIRNBOIM, Methods in Enzymology 100,243-256 (1983), beträgt etwa 5 mg Plasmid-
Claims (6)
- Erfindungsanspruch:1. Verfahren zur Herstellung von Plasmid-DNA vom CoIE 1-Typ,dadurch gekennzeichnet, daß man relaxed kontrollierte Stämme von Escherichia coli u. a. Enterobacteriaceae durch Aminosäurelimitation in eine stationäre Wachstumsphase bringt und aus der Zellsuspension die Plasmid-DNA nach bekannten Verfahren isoliert.
- 2. Verfahren nach Punkt 1 ^dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung in Batch-Kultur bis zur Aminosäurelimitation durchführt.
- 3. Verfahren nach Punkt 1 ^dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung im Fed-Batch-Verfahren unter Zufütterung von Aminosäuren in limitierender Konzentration durchführt.
- 4. Verfahren nach Punkt 1,dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultur im Chemostaten unter Aminosäurelimitation bei niedrigen Verdünnungsraten durchführt.
- 5. Verfahren nach Punkt 1,dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäurelimitation unter den Bedingungen eines Überschusses an Glukose, NHj und Phosphat unter aeroben Bedingungen realisiert werden.
- 6. Verfahren nach Punkt 1-5,dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von Plasmid-DNA den Stamm Escherichia coli CP79 (rel A, thr", leu", his", arg", thi~) verwendet.
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| WO2015140708A1 (en) * | 2014-03-19 | 2015-09-24 | Pfizer Inc. | Method of cell culture |
| EP4512889A3 (de) * | 2014-03-19 | 2025-05-07 | Pfizer Inc. | Zellkultur-verfahren |
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