DD241269A1

DD241269A1 - Verfahren zur mikrobiellen gewinnung von glukoseoxydase

Info

Publication number: DD241269A1
Application number: DD28092185A
Authority: DD
Inventors: Wolf-Ruediger Rudat; Edda Knothe; Eberhard Gross
Original assignee: Dresden Arzneimittel
Priority date: 1985-09-24
Filing date: 1985-09-24
Publication date: 1986-12-03

Abstract

Die Erfindung beschreibt die mikrobiologische Gewinnung des Enzyms Glukoseoxydase aus einem Pilzstamm der Gattung Penicillium, die nur in Abwesenheit von bestimmten stoerenden Schwermetallionen insbesondere von Zinkionen in der Naehrloesung in oekonomisch interessanter Groessenordnung moeglich ist. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt auf dem Sektor der Humanmedizin und im Bereich der Nahrungsgueterwirtschaft.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein mikrobielles Verfahren zur Gewinnung des Enzyms Glukoseoxydase (GOD) aus einem Pilzstamm der Gattung Peniciliium.

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt auf dem Sektor der Humanmedizin, wobei GOD als spezifisches auf D-Glukose wirkendes Enzym zur Diagnose und Überwachung der Diabetes mellitus, einer der verbreitetsten Stoffwechselerkrankungen, und im Bereich der Nahrungsgüterwirtschaft zur Stabilisierung (Konservierung) von Lebensmitteln und Getränken in großem Umfang eingesetzt wird.

Charakteristik der bekannten technischen Lösung

Die Glukoseoxydase (EC 1.1.3.4.) ein Glykoprotein mit 2 Molekülen Flavinadenindinucleotid, gehört zu den Flavinenzymen, eine Gruppe von über 70 in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen vorkommenden Oxydoreduktasen.

Als Mikroorganismen, welche zur fermentativen Gewinnung von GOD verwendet werden, sind neben Bakterienarten (z. B.

Acetobacter- und Pseudomonasarten) vor allem Pilze (Aspergillus- und Penicilliumarten) als Produzenten bekannt.

Von den Penicilliumarten sind insbesondere folgende Species, die Glukoseoxydase zu synthetisieren vermögen, beschrieben worden:

Penicillium amagasakiense (NAKAMURA et FUJIKl 1968, KUSAi 1960)

(MÜLLER 1928) Penicillium notatum (GORNlAKet KACZKOWSK11974,

PITT et al 1981, NAKAM ATSU et. al. 1975)

Penicillium purpurogenum (Sho 49-109582; 1974, NAKAMATSU et. al. 1970)

Penicillium vitale (GULYI et. BILA11964,

POKROVSKAJA et. KISLJAKOVA1965)

In der Regel werden die Mikroorganismen in Leitungswasser mit bekannten Kohlenstoffquellen (vornehmlich Saccharose) und Stickstoff quellen (bevorzugt als NO3) kultiviert, wobei die Organismen stammspezifisch in Emers- und/oder in Submerskultur zur Produktsynthese von GOD befähigt sind. Das ökonomisch günstigste Herstellungsverfahren ist aber zweifeis die Submerskultur.

Einzelne der genannten Mikroorganismenstämme werden jedoch hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Bildung von GOD in Abhängigkeit der erwähnten Kultivierungsart (emers/submers) unterschiedlich beurteilt.

So beschreiben GORNIAK et. KACZKOWSKl (Bulletin de e'Academie Polonaise des Sciences Serie des sciences biologiques Cl. Il Vol. XXIl, No. 6,1974) bzw. PITT et. POOLE (Trans Br. Mycol. Soc. 76,1981,219-30) die Submerskultivierung des Stammes Penicillium notatum und ermittelten die intra- und extrazelluläre Glukoseoxydaseaktivität, während NAKAMATSU et. al. (Agr.

Biol.-Chem.39(9), 1975) am Beispiel von Penicillium notatum und Penicillium chrysogenum ausdrücklich darauf verweist, daß in submerser Kultivierungsweise der Stämme keine Glukoseoxydase gebildet wird.

Die bisher höchsten Ausbeuten einer Submerskultur gelangen unter Verwendung des speziellen Pilzstammes Penicillium purpurogenum No.778 (NAKAMATSU) mit einem Niveau von 32400E/ml/1/ in einem 1-l-Rührglasfermenter nach 3 Kulturtagen. Angaben für den industriellen Maßstab werden nicht beschrieben. Bei Penicillium notatum sind als Höchstwerte lediglich gefunden worden: 0,700E/ml für intra-und 0,950E/ml für extrazelluläre Aktivität/2/(GORNIAK et. KACZKOWSKl 1974) und 0,981 U/ml/3/ (PITT et. al. 1983; Trans Br. Mycol. Soc. 81 (1) 1983). ·

1 Angabe der Einheiten nach NAKAMATSU: 1E entspricht der Enzymaktivität, welche 1 μΙ 0₂/ml/h aufnimmt.

2 Angabein Sarett-Einheiten, 1 Sarett-Einheit entspricht der Aufnahme von 10μΙ 0₂/min.

3 1U= die Menge des Enzyms, die 1 /j.mol D-Glukose pro Minute bei 25°C zu Glukonsäure oxydiert.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung soll die Herstellung von Glukoseoxydase auf mikrobiellem Wege in Submerskultur mit Hilfe des Pilzstammes Penicillium notatum unter ökonomisch günstigen Bedingungen ermöglichen um ausreichende Mengen dieses Enzyms für medizinisch-diagnostische Zwecke sowie für die Nahrungsgüterwirtschaft bereitzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung _ ....

Die Erfindung löst die Aufgabe trotz der widersprüchlichen Literaturangaben, ein mikrobiologisches Verfahren zu entwickeln, das es gestattet, den Pilzstamm Penicillium notatum (Westling) ZIMET-Nr. 43798 in submerser Kulturführung zu industriell verwertbaren GOD-Biosynthese zu aktivieren. Wie in den Referenzbeispielen GOD-Biosynthese zu aktivieren. Wie in den Referenzbeispielen ausgeführt, ist das bei Anwendung bekannter Medien unter mikrobiologisch allgemein angewendeten Kultivierungsmethoden nicht möglich gewesen.

Erfindungsgemäß konnte gezeigt werden, daß nach einer speziellen Vorbehandlung eines Nährlösungsbestandteiles unter nachfolgender Komplettierung des Mediums mit bekannten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie diverser Mineralsalze der Stamm Penicillium notatum (Westling) ZIMET-Nr. 43798 befähigt wird, Glukoseoxydase in Schüttel- und Rührkultur, also in Submerskultur, in industriellem Maßstab zu bilden.

Überraschenderweise konnte festgestellt werden, daß eine ökonomisch interessante Syntheseaktivität des genannten Stammes erst dann nachweisbar ist, wenn bestimmte Schwermetallionen, die sich natürlicherweise in geringsten Konzentrationen im Trinkwasser, als in der Mikrobiologie allgemein üblichen Basis zur Zubereitung von Nährlösungen, befinden, entfernt werden.

Dabei zeigte sich, daß neben anderen Metallionen insbesondere Zink die Biosynthese von GOD unterdrückt.

Die normale und für die verschiedensten mikrobiologischen Verfahren bekannte-sowie für die jeweiligen Produktsynthesen anderer Art unbedenkliche Konzentration an Zn²⁺-Kationen im Trinkwasser liegt in der Größenordnung von 100 ppm.

Die ausreichende Biosynthese von Glukoseoxydase wird erfindungsgemäß in Submerskultur in ökonomisch interessanter Größenordnung mit dem Stamm Penicillium notatum (Westling) ZIMET-Nr. 43798 erst dann ermöglicht, wenn ein bestimmter Schwellenwert des Gehalts an Zink-Ionen in der Nährlösung, der deutlich unter dem Niveau von Trinkwasser liegt, unterschritten

Mit fortschreitender experimentell vorgegebener Verminderung des Zinkgehaltes in der Nährlösung vor Beimpfung mit dem o.g. Stamm bis zu Werten nahe null kann eine entsprechende Erhöhung der Biosyntheseaktivität für GOD erreicht werden.

Dieses Ergebnis ist insofern überraschend, da im Gegensatz zur Biosynthese das gebildete Enzym selbst nach seiner Isolierung und Reinigung bekanntermaßen in seiner vom Mikroorganismus losgelösten und unabhängigen Form bei Zinkkonzentrationen wie im Trinkwasser üblich, in seiner Enzymaktivität nicht beeinflußt wird. Ebenso wirkt sich die Anwesenheit von Zink-Ionen nicht störend auf die Mycelbildung als solche aus.

Die Entfernung der störenden Zink-Ionen wird in an sich bekannter Weise durch übliche Verfahren der Vorentsalzung und/oder Destillation von Trinkwasser in entsprechenden Anlagen durchgeführt. Anschließend erfolgt die quantitative Bestimmung der Metalle mit Hilfe eines Atomadsorptionsspektrographen.

Diese Prozedur hat zudem den Vorteil, daß weitere störende Kationen wie z. B. Pb, Cu und Fe aus dem Medium eliminiert werden, die allerdings in den im Trinkwasser normalerweise vorkommenden Konzentrationen im Gegensatz zu Zn zu keiner Beeinflussung der Biosynthese von GOD führen. Sie erlangen jedoch Bedeutung in Summation zum Eintrag aus anderen Einsatzstoffen des Mediums. So zeigte sich, daß auch in anderen Nährlösungsbestandteilen, die als reine Standardsubstanzeh eingesetzt werden, wie z. B. Saccharose und Kaseinpepton unerwartet hohe — im Hinblick auf den erkannten störenden Einfluß — und lieferantenbedingte Anteile an Metallionen nachweisbar sind, die in besonderer Weise unabhängig von der zugeführten Wasserqualität eine Ursache für Minderausbeuten bzw. Fehlversuche sein können. Bemerkenswert ist, daß dieselben kommerziell genutzten Einsatzstoffe für die Gewinnung anderer Produkte aus Mikroorganismen (Enzyme, Antibiotika) ohne Bedenken oder auffällige Mangel eingesetzt werden.

Die Kultivierung des Pilzstammes Penicillium notatum (Westling) ZlMET-Nr. 43798 erfolgt unter aeroben Bedingungen durch Anzucht von Sporenmaterial auf geeigneten Agarnährböden und nachfolgender Überführung in flüssige, vorher sterilisierte und erfindungsgemäß von Schwermetall insbesondere Zink-Ionen befreite Nährmedien, wobei das entstehende Mycel in an sich bekannterWeise bei einer Temperatur zwischen 20 und 28°C, vorzugsweise 24°C, über einen Zeitraum von 2 bis 8 Tagen, vorzugsweise 5 Tage, im Rundkolben aus Glas, im Glasfermenter und/oder in Fermentatoren aus hochveredelten Stahllegierungen submers kultiviert wird. Als Kohlenstoffquellen können vor allem Glukose und Saccharose verwendet werden.

Als Stickstoffquellen eignen sich neben Peptonen vor allem Nitrate.

Als Mineralsalze haben sich insbesondere Magnesiumsulfat und Kaliumsalze als vorteilhaft erwiesen.

Das extrazellulär in der Kulturlösung vorliegende Enzym Glukoseoxydase konnte mit Hilfe der Warburg-Technik quantitativ bestimmt werden. Die hierbei erzielten Werte für Penicillium notatum liegen im Vergleich zu den Angaben der Literatur deutlich höher im Ausbeuteniveau.

Folgende Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu erläutern, ohne sie hierauf zu beschränken.

Ausführungsbeispiele

500-ml-Erlenmeyer-Rundkolben enthalten je 150ml des folgenden Mediums:

Saccharose	4%
NaNO₃	0,2%
KH₂PO₄	0,1 %
KCI	0,05 %
MgSO₄-7H₂O	0,05%
Kaseinpepton	0,05 %

in entionisierten Wasser, frei von Zinkionen"", pH 6,5 Sterilisierung: 60Min. bei 115°C

Ϊ) Die Prüfung auf Nichtanwesenheit von Zinkionen erfolgt mittels Flammen-Atomadsorptionsspektrograph.

Jeder Rundkolben wird mit einer Sporensuspension als Inokulum des Stammes Penicillium notatum (Westling) ZIMET-Nr. 43798 beimpft (1,5 · 10⁷ Sporen pro Liter), welche mit steriler, isotonischer Kochsalzlösung von einer 10 bis 14 Tagen alten Kultur des Stammes auf Hirse hergestellt wird.

Die Beimpfung der Hirsekultur selbst erfolgt mit Sporenmaterial, welches einer Lyophilampulle entnommen und bei 24°C für ca. 7 Tage auf einem Schrägagar folgender Zusammensetzung bebrütet wurde:

Saccharose	0,52%
Glyzerin	0,41 %
Kaseinpepton	0,35%
NaCI	0,28%
MgSO₄-7 H₂O	0,035%
KH₂PO₄	0,042 %
FeSO₄	0,0021 %
CuSO₄	0,0007 %

in Aqua destilliert, pH 6,0

Sterilisierung: 60 Minuten bei 115°C

Die beimpften Rundkolben werden 96-144 Stunden bei 24°C auf einer Schüttelmaschine mit einer Frequenz von 190 U/min bebrütet. Die Glukoseoxydaseaktivität in der Kulturlösung beträgt am 7. Kulturtag maximal 7 500/xl/O₂/ml/h nach NAKAMATSU.

Referenzbeispiel 1

Die Anzucht und Kultivierung des Stammes Penicillium notatum (Westling) ZIMET-Nr.43798 erfolgt ebenso wie im

1. Ausführungsbeispiel beschrieben, jedoch wird im Gegensatz dazu zur Herstellung der Nährlösung Trinkwasser eingesetzt. Im Verlauf der Kultivierung wird bis zum 7.Tag keine Aktivität von Glukoseoxydasein der Kulturlösung nachgewiesen.

Referenzbeispiel 2

Die Anzucht und Kultivierung des Stammes Penicillium notatum (Westling) ZIMET-Nr.43798 erfolgt ebenso wie im 1 .Ausführungsbeispiel beschrieben, jedoch wird im Gegensatz dazu zur Herstellung der Nährlösung Trinkwasser eingesetzt und ein aus Edelstahl gefertigter 450-l-Fermenter (200I Nettovolumen) mit 1,5 · 10⁷ Sporen beimpft und bei einer Temperatur von 25°C bei einer Luftzufuhr von 2000I pro Stunde mit einer Rührgeschwindigkeit von 100 U/min bebrütet.

Die maximal erreichte Aktivität an Glukoseoxydasein der Kulturlösung beträgt am 5. Kulturtag 510^l/O₂/ml/h nach NAKAMATSU.

Referenzbeispiel 3

Die Anzucht und Kultivierung des Stammes Peniciliium notatum (Westling) ZIMET-Nr.43798 erfolgt wie im 1 .Ausführungsbeispiel beschrieben, jedoch werden dem völlig entionisiertem Wasser der Nährlösung differenzierte Mengen an Zinkionen im Bereich von 0,0025-0,25 mg/l in Form von Zinksulfat zugegeben. Die Aktivität an Glukoseoxydase in der Kulturlösung wird in Abhängigkeit der zugeführten Menge an Schwermetall bei nahezu konstant vorliegender, gebildeter Biomasse deutlich negativ beeinflußt, wie aus der nachfolgenden Tabelle hervorgeht:

Abhängigkeit der GOD-Aktivität in Kulturlösung vom Gehalt an Zink in der Nährlösung (Versuchsbeispiel)

mg Zn²⁺ pH-Wert Biomasse [g/l] GOD-Aktivität [μ\/0₂/π\\/\]

nach NAKAMATSU

0,0000 6,55 9,168 6 885

0,0025 6,55 9,889 6697

0,0050 6,55 9,769 6 614

0,0075 6,55 9,700 5 272

0,0100 6,55 10,307 6232

0,0250 6,55 10,704 1836

0,0500 6,55 11,398 345

0,0750 6,55 10,869 276

0,1000 6,50 10,352 124

0,2500 6,50 11,237 .102

2. Ausführungsbeispiel

Ein 16-1-Glasfermentor (Nettovolumen 121) enthält ein Vorzuchtmedium folgender Zusammensetzung:

Glukose	4%
NaNO₃	0,2%
KH₂PO₄	0,1 %
KCI	0,05 %
MgSO₄-7 H₂O	0,05 %
Kaseinpepton	0,125%

in entionisiertem Wasser, frei von Zinkionen, pH 6,3 Sterilisierung: 60 Minuten bei 115°C Das Vorzuchtmedium wird mit einer Sporensuspension entsprechend dem 1. Ausführungsbeispiel jedoch mit 1,5 10⁸ Sporen pro Liter beimpft und bei einer Temperatur von 25°C bei einer Luftzufuhr von 1501 pro Stunde mit einer Rührgeschwindigkeit von 270U pro Minute für 42—44 Stunden bebrütet. 10 Liter einer so bebrüteten Vorzuchtkultur dienen zur Beimpfung eines aus Edelstahl gefertigten 450-l-Fermentors (Nettovolumen 2001) der bei einerTemperaturvon25°C bei einer Luftzufuhr von maximal 240001 pro Stunde mit einer Rührgeschwindigkeit von 100 U pro Minute 5 Tage bebrütet wird und folgendes Produktionsmedium enthält: - .-

Saccharose 4%

NaNO₃ 0,4%

KH₂PO₄ 0,1 %

KCI 0,05%

MgSO₄-7 H₂O 0,05%

Kaseinpepton 0,05%

in entionisiertem Wasser, frei von Zinkionen, pH 6,3 Sterilisierung: 60 Minuten bei 115°C Die maximal erreichbare Aktivität in der Kulturlösung beträgt am 5. Kulturtag 15000μ.Ι/02/ml/h nach NAKAMATSU.

Claims

-1- 241 2S9

Erfindunganspruch:

1. Verfahren zur mikrowellen Gewinnung von Glukoseoxydase durch Fermentation eines Penicillium notatum (Westling) Stammes unter Verwendung üblicher Nährlösungsbestandteile, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Penicillium

.. notatum (Westling) ZIMET Nr.43798 unter aeroben Bedingungen in einem von störenden Schwermetallionen insbesondere von Zinkionen freien flüssigen Nährmedium submers kultiviert.
2. Verfahren nach Punkt !,dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung des flüssigen Nährmediums entmineralisiertes Trinkwasser verwendet, welches frei von störenden Schwermetallionen insbesondere von Zinkionen ist.