DD242869A1 - Optische 4-kanal-mehrfachmesseinrichtung - Google Patents

Abstract

Es wurde eine in ihrem Aufbau einfache, aber auch aus schon vorhandenen Geraeten zusammenstellbare 4-Kanal-Mehrfachmesseinrichtung entwickelt, die alsa) 2-Kanal-Fluorimeter plus 2-Kanal-Photometerb) 4-Kanal-Fluorimeterc) 2-Kanal-Fluorimeter plus 2-Kanal-Refektometerd) 4-Kanal-Photometere) 2-Kanal-"Dual Wavelength"-Photometerbetrieben werden kann. Bei allen Messregimen a)-e) erfolgt die flexible aber optisch stabile Kopplung zwischen Messobjekt und Messgeraet mittels Lichtleitkabel und zwischengeschalteten optischen Adaptern, wobei die optische Weglaenge bei Absorptionsmessungen frei gewaehlt werden kann. Somit sind Messungen komplexer optischer Groessen am Organ in situ aber auch an komplexen Mehrfachmesseinrichtungen moeglich. Dabei geschieht die Synchronisierung der bis zu 8 verschiedenen Wellenlaengen zweckmaessig aber nicht notwendigerweise mittels eines einfachen elektromechanischen Choppers (M. Markefski WP G 01 N / 270 416 0). Weiterhin erfolgt die Bildung von Differenzen und Quotienten aus jeweils 2 Messkanaelen um sowohl korrigierte Fluoreszenz- als auch Absorptionssignale und damit aussagekraeftige Messgroessen von biologischen Materialien zu erhalten.

Description

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bei bekannten Geräten erfolgte die Lichtleitung vom Meßsystem zum Meßobjekt (Primärlicht) sowie die Rückführung des vom Meßobjekt abgenommenen Lichtes (Sekundärlicht) nicht komplett mittels Lichtleitkabel oder die Messung von bis zu 4 verschiedenen optischen Größen war nicht möglich

IM Chance, B. and Legallais, V.

Inst. Electr. Electron Eng. Trans Biomed. Eng. 10, (1963) 40-47 /2/ Chance, B.; Mayer, D. and Graham, N. and Legallais, V.

Rev. Sei. Instr. 41, (1970) 111-115 /3/ Chance, B.; Graham, N. and Mayer, D.

Rev. Sei. Instr. 42, (1971) 951-957 /4/ Kohen,E.;Kohen,C. and Thoreil, B.

Biochem. Biophys. Acta 1, (1972) 189-196 /5/ Chance, B.; Legallais, V.; Sorge, J. and Graham, N.

Anal. Biochem. 66, (1975) 498-514 /6/ Buecher, B.; Brauser, B.; Conze, A.; Klein, F.; Langgurth, O. and Sies, H.

Eur. J. Biochem. 27, (1972) 301-317 /7/ Brauser, B.; Buecher, T. and Dosiro, M.

FEBS Letters!}, (1970) 297-300 /8/ Popov, J.

Biomed. Biochim. Acta 42, (1983) 113-121 /9/ Hassinen, J. und Jaemsae, T.

Analyt. Biochem. 120, (1982) 365-372 /10/ Renault, G.; Raynal, E.; Sinet, M.; Muffat-Joly, M.; Berthies, J.P.; Cornillaut, J.; Godard, B. and Pacidalo, J. J.

Am. J. Physiol. 246, (1984) 4, Part 2 H 491-H 499

	der zentralen	24	Patentbibliothek der DDR	244	im Amt für Erfindungs- und	Patentwesen	-2- 242 869
Patentschriften in	Nr. der Patentschrift	2		688
	/11/	4	49	333	BRD	G 01	Int. Klassen-Nr.
/12/	3	359	853	BRD	G 01	N21/52
/13/	27	105	678	USA	G 01	N21/52
/14/	217	891	87	USA	G 01	N21/52
/15/		48		BRD	G 01	N21/52
/16/		8		DDR	G01	N K1/04
Ziel der Erfindung					N21/01

Das Ziel der Erfindung ist es, bis zu 4 optische Größen unterschiedlicher Natur am ganzen Organ (perfundiert und in situ) sowie an komplexen Mehrfachmeßeinrichtungen für Organschnitte, Zellen, Zellorganellen oder chemischen Systemen zu messen. Dazu sollte das Gerät einfach sein und somit harten Laboranforderungen genügen. Weiterhin ist ein solches Gerät flexibel einsetzbar. Die simultane Messung von 2 fluorimetrischen Größen bei gleichzeitiger Bildung eines Quotienten aus zwei fluorimetrischen Signalen hat den Vorteil, daß der gebildete Quotient unabhängig von der Anzahl der angestrahlten Fluorochrome ist. Ein solches Vorgehen gestattet deshalb die Ermittlung von Meßergebnissen durch Fluoreszenzmessungen unabhängig von der Güte der optischen Kopplung zwischen Meßobjekt und Meßkopf und ist somit besonders für Messungen in situ geeignet. Weiterhin ist der Quotient aus zwei fluorimetrischen Signalen weniger durch Störgrößen der fluorimetrischen Messung, z. B. Hämoglobin, beeinflußbar/17/, ein wichtiger Faktor bei der Messung am durchbluteten Organ. Durch die gemeinsame Messung von Fluoreszenz und Absorption, bei gleichzeitiger Bildung des Quotienten, ist die Ermittlung der Quantenausbeute von 2 verschiedenen Fluorochromen und dadurch eine Quantifizierung der Fluoreszenzsignale möglich. Das ist für viele Fragestellungen notwendig, da die Quantenausbeute von biologischen Materialien sich mit der jeweiligen Stoffwechsellage ändern kann/6,18,19 und 20/. Bei reinen Absorptionsmessungen ist die Messung bei 2 verschiedenen Wellenlängen sowie die Bildung des Differenzsignals zweckmäßig, um unerwünschte Verfälschungen der Meßsignale zu umgehen/21,22/. '

/17/ Chance, B.; Schoener, B.; Oshino, R.; Itshak, E. and Nakase, Y. '

J. Biol. Chem. 254 (11), (1979) 4764-4771 /18/ Rigler, R.jr

Acta physiol. scand. 67, (1966) 1-222 /19/ Galeotti.T.; Van Rossum, G.D.V.; Mayer, D.H. and Chance, B.

Eur. J. Biochem. 17, (1970) 485-^96 /20/ Sies, H.; Haussinger, D. und Grosskopf,

Hoppe-Seyler's 2. Physiol. Chem. 355 (1974) 305-320

Somit können gleichzeitig 2 korrigierte Absorptionssignale an biologischen Materialien hoher Trübung ermittelt werden. Weiterhin ist die Korrektur der durch hämodynamische Artefakte verfälschten Fluoreszenzsignale dadurch möglich, daß Differenz (unter normierten Bedingungen), zwischen Fluoreszenzsignalen und den Reflexionssignalen des Anregungslichtes gebildet wird/23,24 und 25/. Ein solches Vorgehen ist ebenfalls besonders bei Messungen in situ geeignet. /21/ Chance, B.

Rev. Sei. Instr. 18, (1947) 601-609 /22/ Chance, B.

Rev. Sei. Instr. 22, (1951) 634-638 /23/ Harbig, K. and Reivich, M.

Stroke 4, (1973) 341 (Abstract VI-43) /24/ Joebsis, F.F.; O'Conner, M.; Vitale, H. and Vreman, H.

J. Neurophysiol. 34, (1971) 735-749 /25/ Majevsky, A. and Chance, B.

Brain Research 98, (1975) 149-165

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung ist es, mit einem sehr einfachen und technologisch wenig aufwendigen, dabei aber leistungsfähigem Gerät bis zu 4 optische Signale bei bis zu 8 verschiedenen Wellenlängen zu ermitteln. Dabei kann es sich um Fluoreszenzsignale, um optische Absorption, aber auch um vom Meßobjekt reflektiertes Licht handeln. Gemessen werden können jeweils 2 Fluoreszenzsignale plus 2 Absorptionssignale oder 4fluorimetrische Signale oder 2 reflektometrische Signale oder 4 Absorptionssignale sowie 2 korrigierte Absorptionssignale. Die optische Kopplung zwischen Meßobjekt und Meßgerät wird in allen Fällen komplett mittels Lichtleitkabel sowie optischen Sensoren vorgenommen und somit eine flexible, aber optisch stabile Kopplung zwischen Meßobjekt und Meßgerät erreicht. Dadurch können austauschbare optische Sensoren von kleiner und unterschiedlicher Geometrie eingesetzt werden. Somit ist das Gerät sehr anwendungsfreundlich und auch für optische Messungen an komplexen Meßeinrichtungen sowie am Organ in situ gut geeignet, wobei die Austauschbarkeit der optischen Sensoren eine gute Adaption der Meßeinrichtung an das Meßobjekt gestattet. Weiterhin sind die optischen Sensoren auf Grund ihrer Austauschbarkeit gut sterilisierbar und verhindern eine optische Beeinträchtigung der Lichtleitkabel durch Verschmutzung.

Ausführungsbeispiel

Das Gerät besteht aus dem rotierenden elektromechanischen Lichtchopper (M. Markefski: Patenteinrichtung WP G 01 N — 2704160 „Einfacher elektromechanischer Lichtchopper für verschiedene Wellenlängen"), der in sehr einfacher, aber effektiver Art die Synchronisation von 4 verschiedenen optischen Kanälen mit bis zu 8 verschiedenen Wellenlängen erlaubt. Zu diesem Zweck wird das Licht einer vorzugsweise eingesetzten Hg-Lampe, die naturgemäß ein Bandenspektrum aussendet (Fig. 1; λροΙν), durch 4 im elektromechanischen Lichtchopper befindliche Interferenzfilter geleitet. Der Einsatz einer Hg-Lampe hat den Vorteil, daß bei der gewählten Technik der Fluoreszenzmessung (180 Grad Strahlenablenkung) der auftretende große Reflektions- bzw. Streulichtanteil vom sehr geringen Nutzlichtanteil (Fluoreszenzstrahlung) mittels Filter besser getrennt werden kann. (Bei den biologisch interessanten Fluorochromen beträgt die Intensität des Nutzlichtanteiles im Vergleich zur Intensität des Anregungslichtes nur ca. 1 %.) Die optisch stabile aber flexible Weiterleitung des Beleuchtungslichtes mit 4 verschiedenen Wellenlängen zum Untersuchungsobjekt sowie die Zuleitung des vom Untersuchungsobjekt abgenommenen Lichtes zum Gerät erfolgt komplett mittels Lichtleitkabel (Fig. 1; LLK A = Einfachlichtleitkabel + y-Lichtleitkabel, LLK B, C, D = y-Lichtleitkabel), wobei es sich als sinnvoll erweist, zwischen Versuchsobjekt und Lichtleitkabel jeweils einen auswechselbaren Quarzkonus zwischenzuschalten, der von unterschiedlicher Geometrie sein kann (Fig. 1; QK, A und QK, B). Die Synchronisation der 4 verschiedenen Wellenlängen zur Beleuchtung des Meßobjektes sowie die Zuführung des vom Meßobjekt abgenommenen Lichtes zu 4 getrennt arbeitenden opto-elektrischen Wandlern geschieht, wie schon aufgezeigt, mittels im Chopper befindlicher Interferenzfilter sowie im Chopper eingearbeiteter Schlitzblenden (M. Markefski WP G 01 N — 2704160). Zweckmäßig werden dabei die von den opto-elektrischen Wandlern zu verarbeitenden erwünschten Lichtanteile (Fig.3; λ5, λ6, λ'1 und\'2) durch unmittelbar vor den opto-elektrischen Wandlern befindlichen Filter von den unerwünschten Lichtanteilen (Reflektionslicht und Streulicht) befreit. Weiterhin wird die optisch stabile, aberflexible Verbindung zwischen Chopper und den opto-elektrischen Wandlern (SEVs) mittels Lichtleitkabel hergestellt und somit ein erschütterungsfreies Arbeiten der SEVs gewährleistet (Fig.3; λ5, λ6, λ'1,λ'2). Die Herstellung der einzelnen Meßbereitschaften läßt sich durch einfaches Anschließen der Lichtleitkabel (Fig. 1; LLK, A und LLK, B) an die entsprechenden Quarzkonen (Fig. 1; QK, A und QK, B und Fig. 2) sowie der Verknüpfung der einzelnen Lichtleitkabel untereinander durch Aneinanderstecken (Fig. 1, durch einen Querstrich gekennzeichnet) erreichen. Ein so konzipiertes System hat den Vorteil, daß die nachfolgende elektronische Meßwertverarbeitung auch mittels kommerziell gefertigter Geräte erfolgen kann. Somit können schon vorhandene Geräte ohne großen Umbauaufwand zu 4-Kanalmeßsystemen umgerüstet werden. Die elektronische Meßwertverarbeitung kann jedoch zusammen mit der Beleuchtungseinrichtung und dem elektromechanischen Chopper in einem Gerät untergebracht werden, wobei für die elektronische Meßwertverarbeitung folgende Grundlösung zweckmäßig erscheint.

Elektronische Meßwertverarbeitung

Die von den SEVs gewandelten Signale werden in 4 identischen Verstärkern elektronisch verarbeitet. Als jeweils 1. Verstärkerstufe dient ein Operationsverstärker mit MOSFET-Eingang (Fig. 3; V1). Dieser Verstärker ist in seiner Empfindlichkeit logarithmisch durch ein 10KOhm/5dB-Glied im invertierten Rückführungszweig programmierbar. Dadurch läßt sich der Meßbereich der elektronischen Meßwertverarbeitung zwischen 10A und 10A wählen.

Somit reicht die Empfindlichkeit der Meßverstärker in den Dunkelstrombereich der SEVs. Diese erste Verstärkerstufe arbeitet gleichzeitig als Mittelwertbildner mit geringer Zeitkonstante und gestattet somit eine verläßliche analoge Verarbeitung der durch den elektromechanischen Lichtchoppergetriggerten Signale. Durch ein nachgeschaltetes aktives Filter 4. Ordnung (Tiefpaß mit BUTER-WORTH-Charakteristik) wird eine gute Filterung der Nutzsignale für die weitere Verarbeitung erreicht. Da die Einstellzeiten der zu verfolgenden biologischen Vorgänge in der Regel verschieden, aber auch langsam sind, ist es zweckmäßig, für diese elektronische Filterkombination verschiedene programmierbare Einstellzeiten (1-24 Sekunden fürx 95%) zu wählen. Dadurch kann eine stabile Meßwerterfassung gesichert werden und das Meßsystem wird somit optimal an die einzelnen Meßbedingungen angepaßt, wobei die Einstellzeiten für das Meßsystem entsprechend den Regeln der Meßwertverarbeitung schneller als die Einstellzeiten des Meßobjektes gewählt werden. Durch eine Nullpunktunterdrückung (Fig. 3; NP) erfolgt eine starke Unterdrückung der Untergrundstrahlung. Somit werden bis zu 90% der nicht erwünschten Untergrundstrahlung unterdrückt und nur etwa bis zu 10% der Signalbreite (Nutzsignal) einer Spreizung unterzogen, so daß eine Kalibrierung der Meßkanäle für die analoge Ausgabe der Meßsignale durch die nachfolgende Verarbeitung mittels der Divisoren (Fig.3; D1 und D2) sowie der Differenzierer möglich ist (Fig.3; Diff. 1 und Diff.2).

Auf eine Entlogarithmierung von Meßsignalen (Absorptionsmessung + Reflexionsmessung) kann für die Lösung der meisten Probleme verzichtet werden, da.zur Bestimmung der Quantenausbeuten sowie für die Korrekturen der Fluoreszenzstrahlung lediglich die Absorption sowie die Reflexionen erforderlich sind, a) 2-Kanal-Fluorimeterund 2-Kanal-Photometer

In dem elektromechanischen Lichtchopper (Patenteinreichung WPG 01 N — 2704160) befinden sich jeweils 2 Interferenzfilter mit identischer Duchlaßcharakteristik nebeneinander in 4 im Rotor des Choppers ausgearbeiteten Filterpositionen. Am besten geeignet für die Herausfilterung eines spektralreinen Anregungslichtes sind Doppelresonanzspezialinterferenzfilter (DRSIF) sowie UV-Kopplungsspezialinterferenzfilter (VKSIF). Diese IF-Filter haben den Vorteil, daß das Verhältnis von Halbwertsbreiten zu Zehntelwertsbreiten gegenüber den normalen IF-Filtern vom Fabry-Perot-Typ kleiner ist. Somit ist bei der Verwendung einer Hg-Lampe, die naturgemäß ein Bandenspektrum aussendet, eine hohe spektrale Reinheit des Anregungslichtes erreichbar. Das Ausfiltern von nicht erwünschten Streulichtanteilen und des Reflexionslichtes aus dem Fluoreszenzlicht ist somit bei geringerer Filtergüte der Filter für die Trennung der erwünschten Fluoreszenzstrahlungen (Fig. 1 a, Fig. 3; \5undX6) möglich. Demzufolge sind die in die opto-elektrischen Wandler gelangenden Nutzlichtanteile im Verhältnis zu den nicht Nutzlichtanteilen hoch, wodurch sich die Empfindlichkeit der Fluoreszenzmessungen erhöht.

Wie in der Fig. 1 a und Fig.3 dargestellt, ergibt

K1 = die Fluoreszenz des Fluorochromes 1

K2 = die Fluoreszenz des Fluorochromes 2

K3 = die Absorption des Fluorochromes 1

K4 = die Absorption des Fluorochromes 2

K1 /K 3 = die Quantenausbeute des Fluorochromes 1

K2/K4 = die Quantenausbeute des Fluorochromes 2

Die Messung der Differenzen K1-K2und K3-K4 ist bei diesem Meßregim nicht unbedingt erforderlich. Jedoch lassen bei entsprechender Kalibrierung die Differenzsignale der Fluoreszenzen und speziell der Absorptionen Rückschlüsse auf eine eventuelle Gleichgewichtseinstellung beider fluorochromer Systeme unter gewählten definierten Bedingungen zu.

b) 4-Kanal-Fluorimeter

Bei der Messung im Betriebsregime 4-Kanal-Fluorimeter (Fig. 1 b) sind 4 verschiedene IF-Filter in dem elektromechanischen Chopper befindlich. Dadurch gelangt Licht mit 4 verschiedenen Wellenlängen (Fig. 1 b; λ1,λ2,λ3 und λ4) auf das Versuchsobjekt und erzeugt 4 verschiedene Fluoreszenzstrahlungen, die über das Lichtleitkabelsystem (Fig. 1 b; LLK, Averbunden mit dem LLK, B und dem LLK, G) zu den 4 getrennt arbeitenden SEVs (Fig. 1 b; λ5, λ6, λ7, λ8) gelangen.

c) 2-Kanal-Fluorimeter plus2-Kanal-Reflektometer

Bei dieser Meßanordnung befinden sich die Lichtleitkabel in der gleichen Position wie bei der Betriebsart 4-Kanal-Fluorimeter (Fig. 1 [c]). Neben der Fluoreszenzstrahlung (Fi.g 1 b; λ7 und λ8) wird die Reflexionsstrahlung der beiden Anregungswellenlängen (Fig. 1 [c]; λ1 und λ2) registriert (Fig. 1 [c]; λ1 refl. und A2 refl.), oder auf das Versuchsobjekt wird eine für dieses Meßregime geeignet zur Reflexion bestimmte Strahlung (Fig. 1 [c]; A3 und A4) geleitet, deren Reflexion (Fig. 1 [c]; A3 refl. und A4 refl.) dann sondiert wird. Neben den beiden in den Kanälen 1 und 2 sondierten Fluoreszenzstrahlungen sind speziell die über die Differenzierer ermittelten Differenzbeträge zwischen den Fluoreszenzstrahlungen und den Reflexionen, also die korrigierten Fluoreszenzsignale interessant.

d) 4-Kanal-Photometer

Diese Modifikation derVielzweckmeßeinrichtung erfordert durch das Lichtleitkabelsystem lediglich die Beleuchtung des Meßobjektes, die zweckmäßig über einen Quarz-Konus bei optisch verschlossener Y-Verzweigung vorgenommen wird (Fig. 1 d; LLK, A und QK, A). Die Zuführung des mittels des Quarz-Konus vom Meßobjekt abgekommenen Lichtes (Fig. 1 d; QK, B) erfolgt dann über das Lichtleitkabelsystem und den elektromechanischen Lichtchopperzu den getrennt arbeitenden SEVs (Fig. 1 d; LLK, B; LLK, C und LLK, D). Registriert werden jeweils die einzelnen Absorptionssignale, wobei auf eine zusätzliche Filterung des Lichtes unmittelbar vor den SEVs verzichtet werden kann (Fig. 3; Filter).

e) 2-Kanal-„Dual Wavelanghf'-System .

Bei ansonsten identischer Lichtführung wie bei der 4-Kanal-PhotoVneter-Anordnung werden jeweils für die Nutzabsorptionen (Fig. 1 [e]; A1 und A2) sowie 2für die Korekturabsorptionen geeignete Wellenlängen auf das Versuchsobjekt geleitet (Fig. 1 [el; A1 korr. und A2 korn). Das vom Untersuchungsobjekt abgenommene Licht wird wie schon unter d) beschrieben elektronisch so verarbeitet, daß nur jeweils die Differenzen zwischen Nutzabsorptionen und Korrekturabsorptionen gebildet werden. Somit werden Absorptionssignale erhalten, die weitgehend durch die Trübung des Untersuchungsobjektes unbeeinflußt sind (21, 22).

Claims (2)

1. Erfindungsanspruch:

   Optische 4-Kanal-Mehrzweckmeßeinrichtung für Messungen am Organ und für die Kombination mit multifunktionellen Mehrfachmeßeinrichtungen, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer optischen 4-Kanal-Meßeinrichtung die Zuführung von Licht mit bis zu 4 verschiedenen Wellenlängen zum Meßobjekt (Primärlicht) sowie die Rückführung des vom Meßobjekt abgenommenen Lichtes ebenfalls mit bis zu 4 verschiedenen Wellenlängen zum Meßsystem komplett mittels Lichtleitkabel und zwischengeschalteten Koppelungsstücken, die aber nicht unbedingt erforderlich sind, erfolgt; die nicht invasive optische Messung von Stoffwechselvorgängen am ganzen Organ sowie komplexen Meßeinrichtungen als jeweils

   a)
2. 2-Kanal-Fluorimeter plus 2-Kanal-Photometer (bei freier Wählbarkeit der optischen Weglänge)

   b) 4-Kanal-Fluorimeter

   c) 2-Kanal-Fluorimeter plus 2-Kanal-Reflektometer

   d) 4-Kanal-Photometer (bei freier Wählbarkeit der optischen Weglänge) ,

   e) 2-Kanal-„Dual Wavelength"-Photometer (bei freier Wählbarkeit der optischen Weglänge) betrieben werden kann und bei gleichzeitiger Bildung der Quotienten und Differenzen von jeweils 2 Meßkanälen bei sehr geringer Umrüstzeit zur Herstellung der einzelnen Meßkombinationen geeignet ist.

   Hierzu 3 Seiten Zeichnungen
   Anwendungsgebiet der Erfindung

   Die Erfindung betrifft eine 4-Kanal-Mehrzweckmeßeinrichtung, die speziell für die Messung an Organen (auch in situ) sowie für Messungen optischer Größen an komplexen Meßeinrichtungen konzipiert wurde. Diese optische Mehrfachmeßeinrichtung kann jeweils als . -

   a) 2-Kanal-Fluorimeter plus 2-Kanal-Photometer

   b) 4-Kanal-Fuorimeter

   c) 2-Kanal-Fluorimeter plus 2-Kanal-Reflektometer

   d) 4-Kanal-Photometer

   e) 4-Kanal-„Dual Wavelength"-Photometer
   genutzt werden.

   Die Umrüstzeit zur Herstellung der Meßbereitschaft a) bis e) beträgt nur einige Minuten. Da die Zuführung und die Abnahme des Lichtes vom Meßobjekt komplett mittels Lichtleitkabel erfolgt, ist eine flexible aber stabile Trennung von Meßsystem und Meßobjekt gegeben. Dadurch ist dieses Meßsystem multifunktionell einsetzbar.