DD247570A3 - Vesikulaeres trenn-, fuell- und traegermaterial - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft einen neuen Typ von partikulaerem Trenn-, Fuell- und Traegermaterial, der vor allem in der Fluessigchromatographie, Elektrophorese und Filtration anwendbar ist. Das Ziel besteht in der Herstellung und Verwendung von partikulaerem Trenn-, Fuell- und Traegermaterial, das sich durch guenstige mechanische Eigenschaften und durch eine hohe Intensitaet der Stoffaustauschvorgaenge auszeichnet. Hieraus wird die Aufgabe abgeleitet, einen Typ von partikulaerem Trenn-, Fuell- und Traegermaterial mit im Vergleich zu den bekannten poroesen Feststoffpartikeln neuen Eigenschaften zu entwickeln. Erfindungsgemaess werden die bekannten poroesen Feststoffpartikeln bei ihrer Verwendung als Trenn-, Fuell- und Traegermaterial durch duennwandige Hohlkoerper (Vesikeln) mit poroeser, potentiell flexibler und potentiell hydrophiler, einen Innenraum umgebender Feststoffhuelle ersetzt. Zweckmaessigerweise sind diese Hohlkoerper lebende, abgetoetete oder zusaetzlich veraenderte pflanzliche Zellen oder Mikroorganismen als Einzelzellen oder im Gewebeverband.
Description
Die Erfindung betrifft ein vesikuläres Trenn-, Füll- und Trägermaterial für die Stofftrennung, verwendbar bei der Flüssigchromatographie (Verteilungs-, Adsorptions-, Affinitäts-, Molekülsieb-, lonenaustauschchromatographie), Zentrifugation, Ultrafiltration, Elektrophorese und Elektrofocussierung.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen j
Als partikuläres poröses Trenn-, Füll- und Trägermaterial für die angeführten Anwendungsgebiete werden Feststoffpartikeln genutzt, die bestimmte Komponenten der sie umgebenden flüssigen Phase in ihren Poren und an ihrer Oberfläche adsorbieren (Hrapia, H.: Einführung in die Chromatographie, Akademie-Verlag, Berlin 1977.
Porath, J., Flodin, P.: Nature (London) 183,1657 [1959]). Die Trenneigenschaften dieser Materialien werden in hohem Maße durch die Partikelgröße bestimmt, da sie von der spezifischen Oberfläche oder der Geschwindigkeit des diffusionskontrollierten Stoffaustausches mit dem Porenraum (Innenphase) der Partikeln abhängen. Der Verwendung sehr kleiner Partikeln steht in der Chromatographie ein hoher Strömungswiderstand der Säulenfüllungen entgegen (Hrapia, H.: Einführung in die Chromatographie, Akademie-Verlag, Berlin 1977.
Kaiser, R. E., Oelrich, E.: Optimierung in der HPLC. Hüthig-Verlag, Heidelberg, New York, Basel 1975.
Eppert, G.: Einführung in die schnelle Flüssigchromatographie. Akademie-Verlag, Berlin 1979).
Ein prinzipieller Nachteil der bekannten porösen Feststoffpartikeln besteht darin, daß der gerüstbildende Feststoff durchgehend ist und im gesamten Partikelvolumen als Diffusionshindernis wirkt. Der Manipulation der Innenphase werden durch die Adsorptionseigenschaften der Poren Grenzen gesetzt.
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen^universell einsetzbaren partikulären Trenn-, Füll- und Trägermaterials.
Die Aufgabe besteht darin, einen neuen Typ von porösen partikulären Trenn-, Füll- und Trägermaterialien zu entwickeln, die die folgenden Vorteile einzeln oder in Kombination besitzen:
— hohe Geschwindigkeit der diffusionsbedingten Gleichgewichtseinstellung,
— günstige Packungseigenschaften (Kontinuität, Homogenität, geringer Strömungswiderstand einer Säulenfüllung),
— gute Manipulierbarkeit und Austauschbarkeit der inneren flüssigen Phase,
— Möglichkeit zum Trocknen,
— niedriger Feststoffanteil mit der Möglichkeit der Einstellung einer variablen Dichte,
— Möglichkeit der Immobilisierung von Kolloiden oder Makromolekülen,
— Eigenschaften wie Ionenaustausch, Permselektivität und Adsorption, die zur Trennung von Lösungsbestandteilen ausgenutzt werden können.
Die Aufgabe wird gelöst, indem anstelle der bisher verwendeten porösen Feststoffpartikeln erfindungsgemäß dünnwandige Hohlkörper (Vesikeln) mit einer aus porösem Feststoff gebildeten geschlossenen Oberfläche eingesetzt werden. Die Erfindung beruht darauf, daß zur räumlichen Fixierung von Phasengrenzen in Flüssigkeit dünne, poröse und möglicherweise flexible Hüllen geeignet sind, die einen inneren Hohlraum (Innenraum) umgeben, in den bestimmten Komponenten der äußeren Flüssigkeit penetrieren können. Flüssigkeitsgefüllte Hohlkörper (Vesikeln), die durch solche Hüllen gebildet werden, können als Trenn-, Füll-und Trägermaterial in ähnlicher Weise verwendet werden wie zahlreiche bekannte poröse Partikeln, die bisher Verwendung fanden, zeichnen sich aber durch spezifische Besonderheiten aus:
— Sie bestehen im mit Flüssigkeit gesättigten Zustand zum größten Teil aus einer einheitlichen flüssigen Phase und nur zum geringen Teil aus gequollener Festsubstanz, die vorwiegend hüllenbildend ist. Hierdurch werden die in der Aufgabe formulierten Vorteile ermöglicht.
— Die Diffusionsbehinderung durch den Feststoff betrifft nur eine dünne, poröse und potentiell permselektive Hülle.
— Die Füllung des Innenraumes ist in hohem Maße austauschbar und manipulierbar und kann durch eine nicht mit der Außenphase mischbaren Flüssigkeit erfolgen. Dichteunterschiede zur äußeren Flüssigkeit können variiert werden.
— Da relativ große Partikeln mit hoher Aktivität des Stoffaustausches eingesetzt werden können, kann der Strömungswiderstand einer Packung aus derartigen Vesikeln bei guter Trennleistung bzw. Reaktivität gering gehalten werden.
— In Abhängigkeit von der Deformierbarkeit der Vesikelhülle können Massenströme der Flüssigkeit mechanisch erzeugt werden.
Als vesikuläres Trenn-, Füll- und Trägermaterial sind erfindungsgemäß lebende, abgetötete und zusätzlich gereinigte bzw. verändert pflanzliche Zellen oder Mikroorganismen (Einzelzellen, Zellaggregate oder Gewebeteile) geeignet. Diese Objekte ermöglichen die Nutzung der Zellenwandmatrix zur Stabilisierung von Grenzschichten zwischen mehreren Phasen (z. B. mobiler und stationärer) sowie als Rezeptor und Reaktionsort. Ihre Zellenwandhüllen besitzen hydrophilen und permselektiven Charakter sowie lonenaustauschereigenschaften. Der Innenraum ist als manipulierbares Volumen nutzbar und je nach Behandlung beladbar mit Molekülen und Kolloiden. Die gequollenen Vesikeln sind in der Säulenpackung ausreichend druckstabil, obwohl sie eine flexible Hülle besitzen. Dies kann auf Kapilarkräften oder osmotischen Erscheinungen beruhen. Die Lösung des Innenraums läßt sich austauschen, abpressen oder durch Verdunstung entfernen.
Die Erfindung soll nachstehend an Beispielen erläutert werden.
Suspensionszellen von Beta vulgaris L wurden als vesikuläre Feststoffpartikeln verwendet, nachdem sie in 2%igerToluollösung abgetötet und mit destilliertem Wasser gewaschen wurden. Der schematische Aufbau der Vesikeln ist Fig. 1 zu entnehmen. Sie bestehen aus der Hülse 1 (Zellwand), dem mit einer flüssigen Phase gefüllten Innenraum 2 und koagulierten Resten des Zellinneren 3
Charakteristische Größen:
Y^esikeldurchmesser: 50... 100/um
Dicke der Hülle 1: <1μπη *"
Volumenanteil des Innenraumes 2: ca.70...95%
Form der Vesikeln: näherungsweise ellipsoid
Im beschriebenen Beispiel wurden Vesikelkomplexe (Fig.2) verwendet. Die Größe der Komplexe lag bei 0,5mm, ihre Form war irregulär. Beispiele zur Kinetik des Stoffaustausches an den Vesikeln sind Fig.3 zu entnehmen. Fig. 3 zeigt die polarimetrische Messung der Aufnahmekinetiken von Melibiose 4, Inulin 5 und Extran 6 (MG 200000) nach Zugabe von 0,5 ml Vesikelsuspension (Volumenanteil der Vesikeln ca. 40%). Dextran diffundiert nicht in den Innenraum der Vesikeln (Volumen des wirksamen Innenraumes AV). Die Porengröße der Hülle erlaubte jedoch das Eindringen der Melibiose und des Inulins mit einer Halbwertszeit von <20s. Zum Nachweis der Trennung von Nichtelektrolyten nach der Molekülgröße (Molekularsiebeffekt) durch die beschriebenen Vesikeln wurde eine herkömmliche Flüssigchromatographiesäule aus Glas mit Vesikelkomplexen durch Sedimentation gefüllt
Säulendaten:
Länge der Säule: 500 mm
Durchmesser der Säule: 15 mm
mobile Phase: H2O
Volumengeschwindigkeit: 0,87 m/min
spez. Permeabilität: 8,57-10-3 ms~1 MPa~1
(entspricht bei angelegter Druckdifferenz von 5,5 kPa
über der Säule einem Volumenfluß von 1 ml/min)
Die Packung der Säule erfolgt schnell und homogen, der Füllvorgang ist unproblematisch. Die Säule wurde vertikal, absteigend betrieben. Zur Stofftrennung wurden 0,5 ml eines Disaccharid-Polysaccharid-Gemisches (Saccharose, Dextran) injiziert, als Detektor ein handelsübliches Polarimeter (Perkim Eimer) verwendet. Fig.4 können die Chromatogrammparameter entnommen werden:
BruttoretentionszeitdesDextranpeake: 7:78 min
BruttoretentionsvolujnendesDextranpeaks: 68 ml
Bruttoretantionszeit des Saccharosepeaks 8: 116 min
BruttoretentionsvolumendesSaccharosepeaks: 101ml
Selektionskoeffizient a = T2/t, = 1,49
Peakauflösung R = ^z1Z2= 1,72
SvmmetrieDarametera/b= 1,1
Die verwendeten Vesikeln bieten den Vorteil eines leicht zugänglichen, großen stationären Volumens (Innenraum) bei relativ großer Partikel- und Aggregatgröße, guten Trenneigenschaften und geringem Feststoffanteil. Entsprechend läßt sich eine hohe Durchflußgeschwindigkeit der mobilen Phase bei geringem Druckgradienten erreichen. Die Auswaschbarkeit des Innenraumes ist vollständig.
Wie im Ausführungsbeispiel 1 verwendete poröse Vesilkomplexe von Beta vulgaris L. und Chenopodium album L wurden durch Heißluftbehandlung getrocknet. Sie schrumpften dabei auf Grund ihrer flexiblen Hülle auf ca. 1A des Ausgangsvolumens. Erneute Zugabe einer wäßrigen Lösung führt zur Quellung bis zum Ausgangsvolumen unter Aufrechterhaltung der permselektiven Eigeschaften der Hülle. Nach dem Prinzip der Ultrafiltration werden Substanzen, die nicht durch die Hülle der Vesikeln permeiren können (z.B. Dextran 250000), konzentriert.
Die Konzentrationserhöhung des Dextrans kann am registrierenden Polarimeter (Perkim-Elmer-Polarimeter 141 M) registriert werden. Die relative Konzentrationserhöhung
entspricht dem Volumenanteil der in den Vesikelinnenraum aufgenommenen Flüssigkeit
Die Zellwandhüllen der verwendeten abgetöteten und extrahierten Pflanzenzellen (Suspensionskulturen von Beta vulgaris, Chenopdium album und Lycopersicon esculentum) sind permeabel für Proteinmoleküle mit geringem Molekulargewicht wie Myoglybin (17000 D), Trypsin (21 000 D) und Chymotrypsin (23000 D). Diese in den Innenraum permeierenden Proteine werden scharf von Substanzen getrennt, die nicht in den Vesikelinnenraum diffundieren können, wie Humanserumalbum und Dextran mit Molmassen von 69000 D bzw. 250000 D. An Zellkomplexen von Chenopodium album wurde z. B. Trypsin auf einer Säule von 12cm Länge vollständig von Dextran 250000 abgetrennt, ebenso Myoglobin von Humanserumalbumin. Die permeierenden Proteine werden dabei gleichzeitig mit Zuckern und Salzen eluiert, ohne daß eine Peakverbreiterung festzustellen ist. Bei der verwendeten Elutionsgeschwindigkeit (0,5 ml/min) wird demnach die Gleichgewichtseinstellung durch Diffusion der Proteine in den Innenraum noch nicht begrenzend für die Qualität der chromatographischen Trennung. Im Unterschied zur Gelpermeation an Sephadex treten an dem untersuchten vesikulären Material zwei alternative Möglichkeiten für die diffusionsbedingte Verteilung auf, wie sie bereits am Beispiel 1 dargestellt wurden. Die poröse Zellwand hat einen so geringen Anteil am Gesamtvolumen der Packung, daß die in ihren Poren gelöste Substanzmenge gegenüber den in den Innenräumen und der äußeren mobilen Phase verteilten Mengen vernachlässigt werden kann. Wegen der geringen Dicke der Versikelhüllen (1-2/tm) erfolgt die Gleichgewichtseinstellung auch bei relativ großen Vesikelkomplexen schnell, wodurch gute Trennergebnisse bei geringem hydrodynamischen Widerstand und hoher Durchflußgeschwindigkeit erzielt werden können. Das aus Pflanzenzellen hergestellte Trägermaterial ist somit geeignet, Proteine zweier Molekülgrößenklassen voneinander zu trennen. Die Verteilungsräume verschiedener Stoffe sind nicht graduell von der Molekülgröße abhängig wie bei porösen Gelpartikeln vom Sephadex-Typ. Eine graduelle Trennung nach der Molekülgröße ist zu erreichen, wenn Vesikeln mit graduell verschiedenen Molekülsiebeigenschaften der Hüllen hergestellt und vermischt werden.
Das aus pflanzlichen Suspensionskulturen hergestellte Material kann folgenden Behandlungen unterworfen werden, ohne daß sich die Ultrafiltereigenschaften der Zellwände und die hierdurch bedingte Trennwirksamkeit (vergl. Beispiele 1 und 3) verändern: 5%ige Essigsäure bei 1000C (1 h), Extraktion im Soxhlet-Apparat mit Aceton oderChloroform/Ethanol im Verhältnis4/1, Behandlung mit einer Lösung von Trypsin (0,5%), MgCI2 (5mM), Na2HPO4 (2%, pH 8,4) und NaN3 (2OmM) in Wasser bei Zimmertemperatur oder 37°C, Waschen mit erwärmten Lösungen von Detergentien in destilliertem Wasser (etwa 500C), destilliertem Wasser und Ethanol, Trocknen aus 96%igem Ethanol, Aceton oder Chloroform/Ethanol-Mischungen. Wurde aus dem Material das Wasser ausreichend mit organischen Lösungsmitteln extrahiert, verklumpen die Zellkomplexe beim Trocknen nicht und bilden ein feinkörniges Pulver, das in wäßrigen Lösungen oder Ethanol schnell quillt und eine gebrauchsfähige Suspension für die Säulenchromatographie liefert. Durch die oben beschriebenen Reinigungsverfahren können lichtmikroskopisch sichtbare Protoplasmareste nahezu vollständig entfernt werden. Durch die Trypsinbehandlung wird die Lichtstreuung der Vesikelpackung stark vermindert, anschließend ist das Material glasig. Bereits nach Extraktion mit heißer Essigsäure und Na2HPO4-Lösung ist das Material lösungsmittelfest im pH-Bereich 2-8 und gibt keine nachweisbaren Mengen an UV-absorbierenden oder optisch aktiven Stoffen mehr ab. Die mehrmalige Verwendbarkeit wurde am Beispiel derTrennung von Humanserumalbumin und Fruktose an einer Säulenfüllung aus gereinigten Zellkomplexen von Beta vulgaris (2,5 χ 8cm) getestet. In 10 wiederholten Trennungen änderte sich die Selektivität und die Peakbreite nicht signifikant. Nach Benutzung kann das Material aus 96%igem Alkohol getrocknet werden, ohne daß sich die Gebrauchseigenschaften verschlechtern. Das Material ist autoklavierbar nach Quellung in destilliertem Wasser.
Da molekulardispers gelöste Stoffe bis zu einem Molekulargewicht von etwa 30000 D schnell in aus Pflanzenzellen hergestellte Vesikeln eindringen, Humanserumalbumin (69000D) aber bereits von der Diffusion durch die Versikelwand ausgeschlossen wird, ergeben sich zahlreiche Möglichkeiten für die Immobilisierung von Makromolekülen und Kolloiden. Teilchen, die auf Grund ihrer Größe von der Diffusion durch die Vesikelwand ausgeschlossen werden, können im Vesikelinnenraum aus permeablen Bausteinen gebildet und gleichzeitig am Verlassen der Vesikeln gehindert werden. Liposomen entsteht im Innenraum z. B. dadurch, daß die präparierten Zellkomplexe mit einer Lösung von Lecithin in Ethanol und Chloroform gesättigt werden, dann in Aceton und anschließend in eine wäßrige Pufferlösung überführt werden.
-4- Z47&7Ü
Das vesikuläre Material läßt sich mit hydrophoben organischen Flüssigkeiten füllen. Abgetötete und gereinigte Zellen von Chenopodium album und Beta vulgaris werden hierfürzunächst mit Ethanol und anschließend mit verschiedenen hydrophoben Flüssigkeiten (bisher verwendet: n-Butanol, Isobutanol, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Mischungen aus n-Butanol oder Isobutanol mit Chloroform) gesättigt. Werden sie danach in die mit der entsprechenden organischen Flüssigkeit gesättigte wäßrige Pufferlösung überführt, quellen die Zellen deutlich, wobei im Innenraum eine organische Phase in Form eines kugeligen Flüssigkeitströpfchens verbleibt. Ist die verwendete Pufferlösung nicht mit der organischen Phase gesättigt, lösen sich die Tröpfchen auf oder verkleinern sich, bis die Sättigung der wäßrigen Phase erreicht ist. Völlige Auflösung der organischen Tröpfchen außerhalb der Vesikeln erreicht man durch kräftiges Rühren der Vesikelsuspension. In der klaren, mit der organischen Phase gesättigten Lösung lassen sich die Vesilkomplexe bequem in Säulen füllen. Die in den präparierten Pflanzenzellen gebildeten hydrophoben Tröpfchen bleiben stabil, da ihre Vereinigung durch die mit Wasser gequollene feinporige Vesikelhülle verhindert wird. Auf diese Weise entsteht, gestützt auf die Vesikelwand, eine stationäre flüssige hydrophobe Phase in Form kleiner Tröpfchen in einer mobilen wäßrigen Phase. Das vesikuläre Material ermöglicht in dieser Form eine neue Art der Flüssig-Flüssig-Chromatographie mit zahlreichen Freiheitsgraden für die gezielte Anpassung an die Trennaufgabe. Folgende Wechselwirkungen können dabei einzeln oder in Kombination zur Anwendung gebracht werden: Verteilung zwischen den hydrophoben Flüssigkeitströpfchen und der mobilen wäßrigen Phase, Adsorption an der Tröpfchenoberfläche, Adsorption an der Vesikelwand, Ausschluß von Makromolekülen von der Diffusion in den Vesikelinnenraum und der Wechselwirkung mit der dort befindlichen hydrophoben Phase. Alle genannten Wechselwirkungen konnten in Modellexperimenten für die chromatographische Trennung wirksam gemacht werden. Als organische Phasen wurden verwendet: Chloroform/n-Butanol sowie Chloroform/Isobutanol im Verhältnis 1/1. Als Stützphase wurden extrahierte Zellkomplexe aus der Suspensionskultur von Beta vulgaris und Chenopodium album eingesetzt. Gut bewährt haben sich Säulenabmessungen von 3,5 x 8cm und Elutionsgeschwindigkeiten von 1-3 ml/min, die mit geringen Druckdifferenzen (0,1-0,2 kPa) erreicht werden. Die Sulfophthaleine Bromthymolblau, Bromphenolblau und Phenolrot dienten zur Demonstration der chromatographischen Wechselwirkung saurer organischer Verbindungen mit den eingeschlossenen hydrophoben Tröpfchen. Bei pH4 liegen die benutzten Indikatoren zum großen Anteil in der Säureform vor und werden erwartungsgemäß am Auftragungsort in den Tröpfchen konzentriert und äußerst langsam eluiert. Bei pH 7 liegt das Verteilungsgleichgewicht der benutzten Indikatoren auf der Seite der wäßrigen Phase, wenn sie in dem System Chloroform/Butanol/Wasser ausgeschüttelt werden. Dennoch werden besonders Bromthymolblau und Bromphenolblau an den Trennsäulen aus mit Chloroform/Butanol gefüllten Vesilkomplexen mit starker Verzögerung eluiert, da die bei pH7 auftretenden Anionen amphiphil sind und an der Oberfläche der immobilisierten Tröpfchen adsorbiert vorliegen. Bei pH7 werden in einer gut reproduzierbaren Trennung die Farbstoffe in der Reihenfolge Phenolrot — Bromphenolblau — Bromthymolblau nacheinander eluiert und auf einer Strecke von 4cm vollständig in scharfen Banden voneinander getrennt. Die guten Packungseigenschaften des aus pflanzlichen Suspensionskulturen hergestellten Materials werden durch die Farbstoffzonen belegt. An den mit Chloroform/Butanol gefüllten Zellen wurde weiterhin gezeigt: Trennung von Saccarose und Dextran, Adsorption von denaturiertem Humanserumalbumin an der Vesikelwand (vergl. Beispiele 1 und 10).
Käufliche Bäckerhefe (Saccharamyces cerevisiae) wurde folgenden Behandlungsschritten unterworfen:
1. Waschen mit destilliertem Wasser,
2. Extraktion mit3N NaOH (1000C, 5h),
3. Extraktion mit 0,5N Essigsäure (1000C, 1 h),
4. Waschen mit Ethanol,
5. Extraktion mit Ethanol/Chloroform im Verhältnis 4/1 im Soxhlet-Apparat,
6. Trocknen an der Luft. Es entsteht vesikuläres Material als weißes Pulver mit folgenden Eigenschaften:
— Größe der Einzelvesikeln im gequollenen Zustand (in H2O): 2-6cm.
— Stickstoffgehalt kleiner als 0,3%.
— geschlossene, lösungsmittelfeste Zellwandhüllen ausweitgehend gereinigtem Hefe-Glucan (vorwiegend/3-1,3-Glucan), die für polymere Stoffe mit Molekulargewichten über 6000D undurchlässig sind.
Im Unterschied zu Zuckern, die ohne meßbare Verzögerung in den Innenraum diffundieren, werden Inulin (6000D), Dextrane und Humanserumalbumin vom Innenraum ausgeschlossene und konzentrieren sich beim Quellen der getrockneten Vesikeln in der Außenlösung. Neben den in der beschriebenen Weise gereinigten Vesikeln läßt sich aus Bäckerhefe ein stark adsorbierendes Material herstellen, wenn das Hefe-Eiweiß nur unvollständig extrahiert wird (kürzere Extraktionszeit in NaOH oder Extraktion mit heißer 1 N H2SO4 (1000C, 3 h). Das Material liegt nach dem Trocknen aus Ethanol oder Chloroform/Ethanol ebenfalls als weißes Pulver vor, enthält jedoch größere Mengen (bis zu 30%) von denaturiertem Protein im Innenraum. Es puffert stark in einem weiten pH-Bereich und adsorbiert gelöste Stoffe entsprechend den Affinitätseigenschaften denaturierter Proteine. Humanserumalbumin wird jedoch nicht adsorbiert, ebensowenig Inulin oder Dextran, da diese Stoffe nicht durch die Vesikelwand permeiern. Ein möglicher Einsatz besteht daher in der Reinigung polymerer Stoffe von adsorptionsfähigen niedermolekularen Beimengungen. In Wasser sedimentierte Hefe-Vesikeln besitzen einen zu hohen Filtrationswiderstand für den Normaldruckbetrieb. Sie eignen sich dagegen gut als polares Trägermaterial für Säulenchromatographie mit hydrophoben Laufmitteln (vergl. auch Beispiel 8). Mit gereinigten Hefe-Vesikeln als stationärer Phase und einer mobilen Phase aus n-Butanol/ Essigsäure/Wasser im Verhältnis 7/1/1,5 wurden im Modellversuch D-Fruktose und Raffinose getrennt. Säulenparameter: 6 χ 1,6cm, Laufgeschwindigkeit: 0,5 ml/min, aufgetragene Substanzmenge: 6 mg von jedem Zucker in 0,3 ml. Elutionsvolumen des Fruktose-Peaks: 38ml, Elutionsvolumen des Raffinose-Peaks: 164ml, Peakauflösung R 2,3. Detektor: Perkin Elmer-Polarimeter141 M.
Werden getrocknete Vesikeln nach ihrer Herstellung aus pflanzlichen Suspensionskulturen (Beispiel 4) oder Bäckerhefe (Beispiel7) in Toluol, Butanol oder einer anderen hydrophoben Flüssigkeit auspendiert, quellen sie weit weniger als beim Suspendieren in Wasser. Gibt man unterständigem Rühren zu einer solchen Suspension Wasser, kann der Anteil der wäßrigen
-υ- £f*i ο/υ
Tröpfchen erfolgt. Zunächst füllen sich die porösen Vesikelwände, dann die Innenräume mit der wäßrigen Phase. Erst wenn die Vesikelinnenräume maximal gefüllt sind, kommt es bei weiterer Zugabe der wäßrigen Phase zur Entmischung in der freien Flüssigkeit und gleichzeitig zu einer stärkeren Aggregation der Vesikeln. Auf diese Weise lassen sich biogenVesikeln in variabler Weise für eine Verteilungschromatographie präparieren, bei der eine stationäre hydrophile und eine mobile hydrophobe Phase zusammenwirken.
Vesikuläres Trenn-, Füll- und Trägermaterial kann aus pflanzlichen Parenchymgeweben durch geeignete Verfahren der Zerkleinerung (enzymatische oder chemische Mazeration, mechanische Verfahren) hergestellt werden. Die Zellenwände von mit heißem Wasser und Ethanol extrahieren Parenchymgeweben der Roten Rübe (Beta vulgaris) sind in ihren Ultrafiltereigenschaften denen der Zellkomplexe aus der Suspensionskultur (vergl. Beispiele 2 und 4) vergleichbar. Parenchymscheiben der Roten Bube lassen sich nach vollständiger Extraktion des Zuckers, des Betanins und der anderen löslichen Bestandteile aus Ethanol trocknen und quellen in wäßriger Lösung bis zur ursprünglichen Größe. Dabei werden Humanserumalbumin und Extran (M = 250000) von den Zeilinnenräumen ausgeschlossen und konzentrieren sich im äußeren Flüssigkeitsvolumen um den theoretisch aus der aufgenommenen Flüssigkeitsmenge berechenbaren Betrag. Ein für die Chromatographie geeignetes Material erhält man beispielsweise, indem extrahierte Parenchymschnitte in heißem Wasser durch ein feines Sieb gepreßt werden. Mit diesem Material läßt sich eine Trennung von Humanserumalbumin und Dextran von den Zuckern demonstrieren, wie sie in Beispiel 1 beschrieben ist. Wegen des bei dem verwendeten Zerkleinerungsverfahren noch hohen Anteils an zerstörten Zellen und der notwendigen Grobkörnigkeit des Materials wird jedoch für eine vollständige Trennung der hochmolekularen von der niedermolekularen Fraktion eine deutlich längere Trennstrecke (etwa 40cm) benötigt. Die mechanischen Eigenschaften des parenchymatischen Materials sind in wäßriger Lösung sehr stabil und erlauben ein bequemes Arbeiten mit geringen Druckgradienten. Die hydraulische Leitfähigkeit einer Säulenfüllung aus präparierten Parenchymteilchen von ca. 1 mm Durchmesser beträgt etwa 4mm2s~1kPa~1.
Filterschichten aus biogenen Vesikeln eignen sich zur Entfernung verschiedener Substanzen aus Lösungen. Biogene Vesikeln aus Pflanzenzellen adsorbieren beispielsweise denaturierte Proteine in schwach saurem Medium. Trübungen, die beim Erhitzen oder Ansäuern von Humanserumalbumin-Lösungen entstehen, werden beim Filtrieren durch dünne Schichten (etwa 2cm) des parenchymatischen Materials (vergl. Beispiel 9) oder der gereinigten und präparierten Chenopodium-Zellen (Beispiel 4) vollständig entfernt.
Claims (7)
- Erfindungsanspruch:1. Vesikuläres Trenn-, Füll- und Trägermaterial für die absorptive, chromatographische und elektrophoretisch^ Stofftrennung, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Hohlkörpern (Vesikeln) besteht, die eine poröse, dünne Hülle besitzen und daß es im mit Lösungsmittel gesättigten Zustand zum größeren Volumenanteil aus einer den Innenraum füllenden flüssigen Phase und zum geringeren Teil aus dem die Hülse bildenden gequollenen Feststoff besteht.
- 2. Vesikuläres Trenn-, Füll- und Trägermaterial nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hohlkörper aus lebenden, abgetöteten oder zusätzlich veränderten pflanzlichen Zellen oder Mikroorganismen bestehen.
- 3. Vesikuläres Trenn-, Füll- und Trägermaterial nach Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einzelne getrennte Vesikeln oderVesikelaggregate handelt.
- 4. Vesikuläres Trenn-, Füll- und Trägermaterial nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Innenraum mit einer flüssigen Phase gefüllt ist, die sich nicht mit der äußeren Phase mischt.
- 5. Vesikuläres Trenn-, Füll- und Trägermaterial nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Hülle eine Flüssigkeit enthält, die sich nicht mit den flüssigen Phasen des Innen- und des Außenraumes mischen läßt.
- 6. Vesikuläres Trenn-, Füll- und Trägermaterial nach Punkt 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß im Innenraum reaktionsfähige Moleküle oder Kolloide eingeschlossen sind.
- 7. Vesikuläres Trenn-, Füll- und Trägermaterial nach einem oder mehreren der Punkte 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Hohlkörper eine flexible Hülle besitzen.
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|---|---|---|---|---|
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