DD247685A5 - Process for the recovery and purification of proteins from the producing culture media - Google Patents
Process for the recovery and purification of proteins from the producing culture mediaInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Proteinen, insbesondere Hepatitis-B-Virus-Oberflaechenantigen und Alpha-1-Antitrypsin aus proteinerzeugenden Kulturmedien.The invention relates to a process for the recovery and purification of proteins, in particular hepatitis B virus surface antigen and alpha-1-antitrypsin from protein-producing culture media.
Description
Titel der ErfindungTitle of the invention
Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Proteinen aus den erzeugenden KulturmedienProcess for the recovery and purification of proteins from the producing culture media
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Proteinen aus proteinerzeugenden Kulturmedien; das Verfahren betrifft insbesondere die Gewinnung und Reinigung von Hepatitis B Virus-Oberflächenantigen und Alpha-1-Antitrypsin, das durch DNA-Rekombinations-Technologie in modifizierten Zellkulturen, insbesondere in Kulturen von modifizierten Hefestämmen, gebildet wird.The invention relates to an improved process for the recovery and purification of proteins from protein-producing culture media; More particularly, the method relates to the recovery and purification of hepatitis B virus surface antigen and alpha-1-antitrypsin formed by recombinant DNA technology in modified cell cultures, particularly in cultures of modified yeast strains.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen 25 Characteristic of the known technical solutions 25
Verschiedene Mikroorganismen, darunter Bakterien und Hefen, können als Wirtsorganismen für verschiedene Plasmide benutzt werden, die eine für ein Protein codierende Nucleotidsequenz enthalten. Unter diesen Mikroorganismen werden zur Zeit Hefen bevorzugt und gegenwärtig benutzt. Zum Beispiel ist aus der Europäischen Patentanmeldung 0 106 828 die Verwendung von Saccharomyces cerevisiae-Stämmen zur Produktion des Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigens (HBsAg) und aus der Europäischen Patentanmeldung 0 103 409 die Produktion von Alpha-1-Antitrypsin mittels Hefeplasmiden bekannt.Various microorganisms, including bacteria and yeast, can be used as host organisms for various plasmids containing a nucleotide sequence coding for a protein. Among these microorganisms, yeasts are currently preferred and currently used. For example, European Patent Application 0 106 828 discloses the use of Saccharomyces cerevisiae strains for the production of the hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) and from European patent application 0 103 409 the production of alpha-1-antitrypsin by means of yeast plasmids.
Die Produktion von Proteinen in Hefen weist gegenüber der Produktion in Bakterien erhebliche Vorteile auf. Diese Vorteile ergeben sich aus der einfachen Vermehrung von Hefen in Großfermentern und daraus, daß Hefen - im Gegensatz zu Bakterien ähnlich Säugetierzellen - Kohlenhydratgruppen an frisch synthetisierte Proteine anlagern können.The production of proteins in yeast has significant advantages over production in bacteria. These advantages result from the simple propagation of yeasts in large scale fermenters and from the fact that yeasts - in contrast to bacteria similar to mammalian cells - can attach carbohydrate groups to freshly synthesized proteins.
Nichtsdestoweniger ist die Gewinnung und Reinigung von Proteinen aus einer Hefekultur mit technischen Problemen verknüpft. Diese sind durch den komplexen chemischen Aufbau der Hefezelle bedingt und sie werden insbesondere durch den hohen Lipidgehalt verursacht, wenn/zur Erhöhung der Proteinausbeute über einen längeren Zeitraum vermehrt wird.Nonetheless, the recovery and purification of yeast culture proteins is associated with technical problems. These are due to the complex chemical structure of the yeast cell and they are caused in particular by the high lipid content, if / increased to increase the protein yield over a longer period.
Die Zellwand der Saccharomyceten besteht vermutlich aus drei Schichten: (a) einer Innenschicht aus alkaliunlöslichem ß-Glucan, (b) einer Mittelschicht aus alkalilösli-..The cell wall of the saccharomycetes is believed to consist of three layers: (a) an inner layer of alkali-insoluble β-glucan, (b) a middle layer of alkali-soluble ..
chem ß-Glucan und (c) einer Außenschicht aus einem Glykoprotein, in dem das Kohlenhydrat aus phosphoryliertem Mannan besteht. Unter der Zellwand liegt eine Cytoplasmamembran aus einem sehr komplexen Gemisch neutraler Lipide (Mono-, Di- und Triglyceride), freien und veresterten Sterinen, einem komplexen Sphingolipid, Glycerophosphatiden und neutralen sowie sauren Glykolipiden. Der Zellkern enthält DNA, verschiedene Arten von RNA und ein Polyphosphat. Die Vakuolen können eine große Vielzahl von Bestandteilen hohen und niederen Molekulargewichts enthalten. Sie dienen als Depot für eine Anzahl hydrolytischer Enzyme. Die Mitochondrien sind reich an Lipiden, Phospholipiden und Ergosterol-Komponenten des Membransystemsj und das Cytoplasma enthält unter anderem große Mengen an Ribosomen, Polyphosphaten, Glykogen und eine Anzahl glykolytiacher Enzyme. Die meisten Hefezellen (wie die Saccharomyces-Arten) enthalten auch eine gewisse Mengechem β-glucan and (c) an outer layer of a glycoprotein in which the carbohydrate is phosphorylated mannan. Under the cell wall is a cytoplasmic membrane of a very complex mixture of neutral lipids (mono-, di- and triglycerides), free and esterified sterols, a complex sphingolipid, glycerophosphatides and neutral as well as acidic glycolipids. The nucleus contains DNA, various types of RNA and a polyphosphate. The vacuoles may contain a wide variety of high and low molecular weight components. They serve as a depot for a number of hydrolytic enzymes. The mitochondria are rich in lipids, phospholipids and ergosterol components of the membrane system, and the cytoplasm contains, among other things, large amounts of ribosomes, polyphosphates, glycogen and a number of glycolytic enzymes. Most yeast cells (such as the Saccharomyces species) also contain a certain amount
.0 A flfi. 336845.0 A flfi. 336845
von Lipiden in Tropfenform, wobei deren Menge ansteigt in Kulturen, die über einen längeren Zeitraum gezüchtet werden.of lipids in the form of drops, the amount of which increases in cultures that are grown over a longer period of time.
Es ist bereits eine Anzahl von Mehrstufenverfahren zur Gewinnung und Reinigung von Proteinen aus unterschiedlichen Quellen bekannt. Beispiele, die sich auf Proteine beziehen, die von genetisch modifizierten Mikroorganismen erzeugt wurden, wurden von TH. STAEHLIN et al. (J. Biol. Chem. 256 (1981), 9750-54), K. MURRAY et al. (The EMBO J. 3_ (1984), 645-650) und R.A. HITZEMAN et al. (Nucl. Ac. Res. JJ_ (1983), 2745-2763) veröffentlicht.A number of multi-step processes for recovering and purifying proteins from different sources are already known. Examples relating to proteins produced by genetically modified microorganisms have been reported by TH. STAEHLIN et al. (J. Biol. Chem. 256 (1981), 9750-54), K. MURRAY et al. (The EMBO J. 3 (1984), 645-650) and R.A. HITZEMAN et al. (Nucl. Ac. Res. JJ (1983), 2745-2763).
• Wenn das erzeugte Protein zellgebunden ist, umfassen diese verschiedenen Verfahren im allgemeinen drei Reihen von Schritten.• If the protein produced is cell bound, the se various methods generally comprise three series of steps.
In der ersten Reihe von Verfahrensschritten wird das gewünschte Protein aus dem Zellinnern entfernt. Dazu werden die zellen entweder lysiert (z.B. durch Enzymbehandlung) oder aufgebrochen, z.B. durch mechanische Kräfte, wie Scherkräfte z.B. in einer X-Press oder French-Press oder Schütteln mit Glasperlen, gegebenenfalls unter Zusatz eines oberflächenaktiven Mittels; siehe z.B. K. MURRAY et al., a.a.O., und R.A. HITZEMAN et al., a.a.O..In the first series of steps, the desired protein is removed from the cell interior. For this, the cells are either lysed (e.g., by enzyme treatment) or disrupted, e.g. by mechanical forces, such as shearing forces e.g. in an X-press or French press or shaking with glass beads, optionally with the addition of a surface-active agent; see, e.g. K. Murray et al., Supra, and R.A. HITZEMAN et al., Supra.
In der zweiten Folge von Verfahrensschritten wird das Medium am gewünschten Protein angereichert, z.B. durch fraktionierte Fällung mit Ammoniumsulfat und/ oder in Gegenwart von Polyäthylenglykol. Schließlich werden in einer dritten Folge von Verfahrensschritten im" wesentlichen alle Verunreinigungen aus dem Medium entfernt, z.B. durch eine oder mehrere Maßnahmen, wie Ultrafiltration, Ionenaustausch, Gelfiltrationschromatographie und Zentrifugieren mit isopyknischen Gradienten.In the second series of procedures, the medium is enriched in the desired protein, e.g. by fractional precipitation with ammonium sulfate and / or in the presence of polyethylene glycol. Finally, in a third series of steps, substantially all contaminants are removed from the medium, for example, by one or more measures such as ultrafiltration, ion exchange, gel filtration chromatography and isopycnic gradient centrifugation.
Es liegt auf der Hand, daß bei einem solchen Verfahren Verunreinigungen, wie begleitende Proteine (angegeben durch R.A. HITZEMAN et al., a.a.O.), Nucleinsäuren und Lipide, und insbesondere hohe Lipidgehalte, einen ungünstigen Einfluß auf wenigstens einen der Schritte in der dritten Reaktionsfolge (z.B. Ultrafiltration und Säulenchromatographie) haben und die proteolytischen Enzyme schnell aus dem Medium entfernt werden müssen. Darüberhinaus wurde gefunden, daß die Fallung mit Ammoniumsulfat ohne eine vorherige Grobentfernung der Lipide nicht möglich ist, weil Lipide diese Fällung stören»It will be appreciated that in such a process, contaminants such as companion proteins (as reported by RA HITZEMAN et al., Supra), nucleic acids and lipids, and particularly high lipid levels, adversely affect at least one of the steps in the third reaction sequence (US Pat. eg ultrafiltration and column chromatography) and the proteolytic enzymes have to be rapidly removed from the medium. Moreover, it has been found that ammonium sulphate precipitation without prior coarse removal of the lipids is not possible because lipids interfere with this precipitation »
Daher ist es von größter Bedeutung, eine Methode zur Verfügung zu stellen, bei der die meisten der Verunreinigungen vor der dritten Verfahrensstufe entfernt werden.Therefore, it is of utmost importance to provide a method in which most of the impurities are removed before the third stage of the process.
Einige der zuvor beschriebenen Verfahren offenbaren den Einsatz von Polyathylenglykol als selektives Fällungsmittel für Proteine. Es wurde auch von einem Verfahren zur Fällung von Lipoproteinen aus Plasma durch Ausnutzen von Lipoprotein-Polyanion-Metall-Wechselwirkungen berichtet.Some of the methods described above disclose the use of poly (ethylene glycol) as a selective precipitant for proteins. There has also been reported a method of precipitating plasma lipoproteins by exploiting lipoprotein-polyanion-metal interactions.
Das Verfahren zur fraktionierten Fällung von Proteinen durch nichtionische, wasserlösliche Polymerisate, insbesondere Polyathylenglykol (PEG) wurde durch POLSON et al., Biochem. Biophys. Acta £2 (1964), 463-475, eingeführt und von verschiedenen Autoren besprochen. Unter ihnen erwähnen W. HONIG et al., Analyt. Biochem. 72. (1976), 502-512, daß "die Spezifität der Fällung, d.h. das Verhältnis des gewünschten Proteins zum Gesamtprotein dadurch verbessert werden kann, daß PEG-Fraktionen niedrigerer mittlerer Molmasse als das normalerweise eingesetzte PEG 6000 benutzt werden"The process for the fractional precipitation of proteins by nonionic, water-soluble polymers, in particular poly (ethylene glycol) (PEG), has been described by POLSON et al., Biochem. Biophys. Acta £ 2 (1964), 463-475, introduced and discussed by various authors. Among them mention W. HONIG et al., Analyt. Biochem. 72. (1976), 502-512 that "the specificity of the precipitation, i.e. the ratio of the desired protein to the total protein, can be improved by using PEG fractions of lower average molecular weight than the normally used PEG 6000"
Die Autoren haben folgendes ausgeführt: "Durch Einstellen des pH-Wertes können Konzentrate individueller. Plasma-The authors stated: "By adjusting the pH, concentrates of individual plasma
titi
proteine erhalten werden." Die Autoren betonen jedoch, daß die Reinigung komplexerer Proteingemische, wie.des Überstandes eines Zellhomogenats, wesentlich schlechter verläuft."However, the authors emphasize that the purification of more complex protein mixtures, such as the supernatant of a cell homogenate, is significantly worse. "
P.R. POSTER et al., Biochem. Biophys. Acta 317 (1973), 505-516, haben ein Verfahren .für die Fällung von Enzymen aus Zellextrakten von Saccharomyces cerevisiae mit Hilfe von PEG beschrieben. Verfahren 'zur Konzentrierung und Reinigung von Viren und Bakteriophagen mit PEG wurden durch B.P. VAJDA, Folia Microbiol. 2_3_ (1978), 88-96, und G.J. LANCZ, Arch. Virusforsch. 4_2 (1973), 303-306, beschrieben. Auf dem Gebiet der Isolierung des Hepatitis-Antigens wurde von Ph. ADAMOWICZ et al. (S. 3 7-49 INSERM SYMPOSIUM Nr. 18, HEPATITIS B VACCINE, Publ. ELSEVIER, Amsterdam, Holland, 1981) zur Reinigung des Hepatitis-B-Oberflächenantigens (HBsAg) ein Verfahren beschrieben, das zwei aufeinanderfolgende Behandlungen mit PEG 6000 umfaßt. Bei diesem Verfahren der HBsAg-Reinigung aus Plasma werden die Immunkomplexe und die meisten der Lipoproteine in einem ersten Schritt mit PEG 6000 in einer Konzentration von 5,5 % aus dem Serum niedergeschlagen und in einem zweiten Schritt wird HBsAg aus der isolierten überstehenden Flüssigkeit durch Zusatz von PEG in einer Endkonzentration von 10 % gefällt.PR POSTER et al., Biochem. Biophys. Acta 317 (1973), 505-516, have described a method for the precipitation of enzymes from cell extracts of Saccharomyces cerevisiae using PEG. Methods for concentrating and purifying viruses and bacteriophages with PEG were performed by BP VAJDA, Folia Microbiol. 2_3_ (1978), 88-96, and GJ LANCZ, Arch. Virus Research. 4_2 (1973), 303-306. In the field of hepatitis antigen isolation, Ph. ADAMOWICZ et al. (Pp. 3 7-49 INSERM SYMPOSIUM N ° 18, HEPATITIS B VACCINE, publ. ELSEVIER, Amsterdam, Holland, 1981) for the purification of hepatitis B surface antigen (HBsAg), a method comprising two consecutive treatments with PEG 6000 , In this method of plasma HBsAg purification, the immune complexes and most of the lipoproteins are first precipitated with serum PEG 6000 at a concentration of 5.5 % , and in a second step HBsAg is isolated from the isolated supernatant by addition precipitated by PEG at a final concentration of 10 % .
In der Patentliteratur offenbartDisclosed in the patent literature
- US-Patent 3 790 552 ein Verfahren zur Entfernung von Hepatitis-Antigen aus einer Proteinfraktion, wobei das Verfahren einen Schritt enthält, in dem PEG der Molmasse 200-6000 in einer Menge von 12-30 % (w/v) zum Fällen des Antigens benutzt wird.US Pat. No. 3,790,552 discloses a method of removing hepatitis antigen from a protein fraction, the method comprising a step in which PEG of molecular weight 200-6000 in an amount of 12-30 % (w / v) for precipitating the Antigen is used.
ψ- US-Patent 3 951 93 7 offenbart ein Verfahren zur Reinigung von Hepatitis B Antigen (HBAg), das eine Doppelfällung des HBAg mit PEG (4,0-4,5 Gew.-%) einer' Molmasse von wenigstens 600 enthält.U.S. Patent 3,951,937 discloses a method of purifying hepatitis B antigen (HBAg) containing a double precipitate of HBAg with PEG (4.0-4.5 wt%) having a molecular weight of at least 600.
1^ - US-Patent 3 994 870 offenbart ein Verfahren zur Reinigung von Hepatitis B Antigen (HBAg), wobei HBAg durch Zugabe von 4,0-4,5 Gew.-% PEG gefällt wird und danach der Affinitätschromatographie unterworfen wird, wobei unlösliches Concavalin A als chromatographisches Adsorptionsmittel benutzt wird. 1 ^ - US Patent 3,994,870 discloses a process for purifying hepatitis B antigen (HBAG), said HBAG is precipitated by addition of 4.0-4.5 wt .-% PEG, and then the affinity chromatography is subjected to form insoluble Concavalin A is used as a chromatographic adsorbent.
- Die Europäische Patentanmeldung 0 112 506 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gegen Hepatitis B Infektionen aus Plasma, wobei das Verfahren eine Ammoniumsulfatfällung, gefolgt von-einer Adsorption an kolloidalem Silikat und zwei aufeinanderfolgenden . Fällungsschritten mit PEG (mit einer Molmasse von 2000 10 000) bei 3-7 % (w/v) zur Fällung von Hepatitis B Virus und Immunkomplexen und bei einer Konzentration von 15-20 % (w/v) in der überstehenden Flüssigkeit zum Fällen von HBsAg umfaßt.European Patent Application 0 112 506 discloses a method of producing a vaccine against hepatitis B infection from plasma, which method comprises ammonium sulfate precipitation followed by adsorption on colloidal silicate and two consecutive. Precipitating steps with PEG (having a molecular weight of 2000-10,000) at 3-7 % (w / v) for precipitation of hepatitis B virus and immune complexes and at a concentration of 15-20 % (w / v) in the supernatant fluid for precipitation of HBsAg.
- Auf dem Gebiet der Alpha-1-Antitrypsin-Isolierung offenbart die Japanische Patentanmeldung 9128-335 (Derwent Abstract 84-217127) die Fällung von Alpha-1-Antitrypsin aus einer Plasmafraktion durch Zugabe von PEG in einer Menge von 15-20 % (w/v).In the field of alpha-1-antitrypsin isolation, Japanese Patent Application 9128-335 (Derwent Abstract 84-217127) discloses the precipitation of alpha-1-antitrypsin from a plasma fraction by adding PEG in an amount of 15-20 % ( w / v).
Wie bereits erwähnt-, wurde schon früher über ein Verfahren zur Fällung von Lipoproteinen unter Ausnutzung der Lipoprotein-Polyanion-Metall-Wechselwirkung berichtet (z.B.As already mentioned, a method of precipitating lipoproteins utilizing lipoprotein-polyanion-metal interaction has previously been reported (e.g.
M. BÜRSTEIN et al. Adv. Lip. Res. JMj (1973), 67-108; und A. VAN DALEN et al. Biochem. et Biophys. Acta 147 (1967), 421-427. Dieses Verfahren wird durch Wechselwirkung zwischen den Lipoproteinen, einem zweiwertigen Metallkation und einem sauren Polysaccharid durchgeführt. Unter diesen Verfahrensbedingungen ist die Menge des Niederschlags eine Funktion der Konzentration der zweiwertigen Metallkationen im Medium.M. BÜRSTEIN et al. Adv. Lip. Res. JMj (1973), 67-108; and A. VAN DALEN et al. Biochem. et biophys. Acta 147 (1967), 421-427. This process is performed by interaction between the lipoproteins, a divalent metal cation and an acidic polysaccharide. Under these process conditions, the amount of precipitate is a function of the concentration of divalent metal cations in the medium.
Ziel der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von zellgebundenen Proteinen aus den erzeugenden Kulturmedien.The aim of the invention is an improved process for the recovery and purification of cell-bound proteins from the producing culture media.
Das Ausgangsmaterial für das erfindungsgemaße Verfahren (im folgenden auch als "Rohextrakt" bezeichnet) ist die überstehende Flüssigkeit von genetisch modifizierten Hefezellen, die ein zellgebundenes Protein erzeugt haben und in an sich bekannter Weise in Gegenwart eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels zerstört wor-The starting material for the process according to the invention (hereinafter also referred to as "crude extract") is the supernatant liquid of genetically modified yeast cells which have produced a cell-bound protein and which have been destroyed in a manner known per se in the presence of a nonionic surfactant.
den sind.they are.
Nach der vorliegenden Erfindung wird die fraktionierte Fällung mit PEG (im folgenden als erste Stufe bezeichnet) gefolgt von entweder einer fraktionierten Fällung durch mehrwertige Metallkationen (insbesondere von zweiwertigen Metallen, wie Calcium und Mangan) oder durch Behandlung mit Ammoniumsulfat durchgeführt, wobei der Ammoniumsulfatbehandlung gegebenenfalls eine Ultrafiltration der überstehenden Flüssigkeit aus dem ersten Schritt vorangeht,According to the present invention, the fractionated precipitation is carried out with PEG (hereinafter referred to as the first stage) followed by either a fractional precipitation by polyvalent metal cations (especially divalent metals such as calcium and manganese) or by treatment with ammonium sulfate, the ammonium sulphate treatment optionally Preceded by ultrafiltration of the supernatant liquid from the first step,
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Befund, daß HBsAg nicht, ausfällt, wenn festes PEG (z.B. PEGThe present invention is based on the finding that HBsAg does not precipitate when solid PEG (e.g., PEG
6000) in einer Konzentration von 6-12 % (w/v) zur Extrak-6000) at a concentration of 6-12 % (w / v) to the extract
genetisch HBsAg aus/modifizierten Hefezellen eingesetztgenetically used HBsAg from / modified yeast cells
wird, die in Gegenwart eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels zerstört wurden. Darüberhinaus wird bei nachfolgender Zugabe von Ammoniumsulfat ein Zweiphasensystem gebildet, das dadurch charakterisiert ist, daßwhich were destroyed in the presence of a nonionic surfactant. Moreover, upon subsequent addition of ammonium sulfate, a two-phase system is formed which is characterized in that
HBsAg sich in der PEG-Phase befindet, während die Mehrzahl 35HBsAg is in the PEG phase, while the majority 35
der Verunreinigungen in der wäßrigen Phase vorliegen.the impurities in the aqueous phase are present.
-o lh- 336845-o lh- 336845
Dieses Ergebnis ist überraschend, weil gemäß der allgemeinen Lehre des Standes der Technik in anderen Rohmedien diese operativen Bedingungen eine Fällung von HBsAg hervorrufen sollten. Der erste Erfindungsgegenstand besteht daher aus dem Einsatz von PEG als Lösemittel für das gewünschte, durch Hefezellkulturen erzeugte Protein, während die meisten Verunreinigungen durch ,Fällung aus dem Medium entfernt werden.This result is surprising because, according to the general teaching of the prior art in other raw media, these operative conditions should cause precipitation of HBsAg. The first subject of the invention is therefore the use of PEG as a solvent for the desired protein produced by yeast cell cultures, while most impurities are removed by precipitation from the medium.
In Abhängigkeit von seiner Molmasse ist PEG entweder ein Feststoff oder eine Flüssigkeit; die Grenze zwischen beiden Formen liegt bei einer Molmasse von ungefähr 1500.Depending on its molecular weight, PEG is either a solid or a liquid; the boundary between the two forms is about 1500 molar mass.
Im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens (der auch als Klärschritt bezeichnet werden könnte), könnenIn the first step of the method according to the invention (which could also be referred to as a clarification step), can
(PEG) offensichtlich Polyäthylenglykole/verschiedener Molmasse in einer Konzentration verwendet werden, die an die entsprechende Molmasse angepaßt sind.(PEG) are obviously polyethylene glycols / different molecular weight used in a concentration that are adapted to the corresponding molecular weight.
Zum Beispiel liegt die PEG-Konzentration vorzugsweise bei 6 bis 12 % (w/v), wenn festes PEG (z.B. PEG 6000) eingesetzt wird und im Bereich von 10 bis 35 % (v/v) - bevorzugt im Bereich von 20. bis 30 % (v/v) -wenn flüssiges PEG (z.B. PEG 300 oder 400) eingesetzt wird. Nichtsdestoweniger wird der Einsatz von flüssigem PEG aus technischen Gründen, darunter die Erleichterung der späteren Ultrafiltration, bevorzugt. s For example, the PEG concentration is preferably 6 to 12 % (w / v) when solid PEG (eg PEG 6000) is used and in the range of 10 to 35 % (v / v) - preferably in the range of 20 to 30 % (v / v) - if liquid PEG (eg PEG 300 or 400) is used. Nonetheless, the use of liquid PEG for technical reasons, including the facilitation of later ultrafiltration, is preferred. s
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Proteinen, insbesondere HBsAg oder Alpha-1-Antitrypsin, aus der überstehenden Flüssigkeit von in Gegenwart eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels zerstörten Hefezellen (vorzugsweise eines Polysorbat-tensids) bereitgestellt, wobei die überstehende Flüssigkeit im folgenden als "Rohextrakt" bezeichnet wird. Dieses Verfahren umfaßt einen ersten Schritt, in dem entweder 6 bisAccording to the invention, there is provided a process for recovering and purifying proteins, especially HBsAg or alpha-1-antitrypsin, from the supernatant liquid of yeast cells (preferably a polysorbate surfactant) destroyed in the presence of a nonionic surfactant, the supernatant being hereinafter referred to as " Crude Extract "is called. This method comprises a first step in which either 6 to
12 % (w/v) festes PEG oder bevorzugt 10-25 % (v/v) flüssiges PEG zum Rohextrakt gegeben werden, der auf pH 6 (+ 0,1) eingestellt ist. Die Grenzen der PEG-Konzentrationen werden hauptsächlich durch den Punkt bestimmt, an dem die Klärung erreicht ist, weil weitere Zugabe von PEG nur schädliche Wirkungen zeigt, d.h. höhere Viskosität des Mediums und die Gefahr der unerwünschten gemeinsamen Fällung von HBsAg oder Alpha-1-Antitrypsin.12 % (w / v) solid PEG or preferably 10-25 % (v / v) liquid PEG to the crude extract adjusted to pH 6 (+ 0.1). The limits of PEG concentrations are mainly determined by the point at which clarification is achieved, as further addition of PEG shows only deleterious effects, ie higher viscosity of the medium and the risk of unwanted co-precipitation of HBsAg or alpha-1-antitrypsin ,
im Verfahren nach der Erfindung wird PEG als poly -In the process according to the invention PEG is used as poly
meres organisches Lösemittel betrachtet, das unter anderem die Fällung der (Lipo)Proteine, deren isoelektrischer Punkt nahe bei pH 6 liegt und die Lösung der anderen (Lipo)Proteine fördert, d.h. solcher Lipoproteine,It considers, among other things, the precipitation of the (lipo) proteins whose isoelectric point is close to pH 6 and promotes the dissolution of the other (lipo) proteins, i. such lipoproteins,
die einen wesentlich verschiedenen isoelektrischen Punkt haben und solcher, die in hohem Maße hydrophob sind.which have a significantly different isoelectric point and those which are highly hydrophobic.
-* Es wurde beobachtet, daß dieser PEG-Klärschritt ungefähr 75 % der verunreinigenden Proteine, 90 % der Polysaccharide, 94 % der Nucleinsäuren und 45 % der Lipide niederschlägt, während im wesentlichen der ganze HBsAg- oder Alpha-1-Antitrypsingehalt in der überstehenden Flüssigkeit zurückbleibt.It has been observed that this PEG clarification step precipitates approximately 75 % of the contaminating proteins, 90 % of the polysaccharides, 94 % of the nucleic acids and 45 % of the lipids, while substantially all of the HBsAg or alpha 1-antitrypsin content is in the supernatant Liquid remains.
Wie bereits erwähnt, umfaßt die vorliegende Erfindung eine Kombination von Schritten, deren erster ein Klärungsschritt ist, der zu einer teilweise gereinigten und gegebenenfalls etwas opalisierenden Lösung des gewünschten Proteins führt.As already mentioned, the present invention comprises a combination of steps, the first of which is a clarification step, which leads to a partially purified and possibly slightly opalescent solution of the desired protein.
Im zweiten Schritt des Verfahrens nach der Erfindung wird die erhaltene, teilweise gereinigte Lösung entweder mit einem mehrwertigen - insbesondere zweiwertigen - Metallkation, wie etwa in Form einer wäßrigen Lösung von Calcium- oder Manganchlorid, bei einer Endkonzentration vonIn the second step of the process of the invention, the resulting partially purified solution is treated either with a polyvalent - especially divalent - metal cation, such as in the form of an aqueous solution of calcium or manganese chloride, at a final concentration of
-ιοί 30 rnMol oder rait Ammoniumsulfat behandelt. Diese Ammoniumsulfatbehandlung wird 'entweder nach Ultrafiltration der opalisierenden Lösung durch Zugabe festen Ämmoniumsulfats bis zu einer Sättigung bei 40-50 % entsprechend den klassischen Aussalzmethoden durchgeführt,wobei ein Niederschlag des gewünschten Proteins entsteht, der in einem Phosphatpuffer aufgenommen werden kann oder durch Zusatz von Ammoniumsulfat zur PEG-enthaltenden überstehenden Flüssigkeit bis zu einer 40-50 &Lgen Sättigung, wobei ein Zweiphasensystem mit dem gewünschten Protein in der PEG-Phase gebildet wird.-ιοί 30 mmol or ammonium sulfate treated. This ammonium sulphate treatment is carried out either after ultrafiltration of the opalescent solution by addition of solid ammonium sulphate to saturation at 40-50 % according to the conventional salting-out methods to give a precipitate of the desired protein which can be taken up in a phosphate buffer or by addition of ammonium sulphate PEG-containing supernatants to a 40-50 & Lgen saturation, forming a two-phase system with the desired protein in the PEG phase.
Jede dieser Ausführungsformen der zweiten Folge von Reaktionsschritten führt zu einer klaren Lösung des gewünschten, im wesentlichen reinen Proteins, was den GehaltEach of these embodiments of the second series of reaction steps results in a clear solution of the desired, substantially pure protein, which is the content
an Polysacchariden, Nucleinsäuren, Lipiden und verunreinigenden Proteinen angeltt.fished on polysaccharides, nucleic acids, lipids and contaminating proteins.
Die so erhaltene Lösung kann dann in der vorstehend angegebenen klassischen dritten Folge von Verfahrensschritten,z.B. gegebenenfalls Ultrafiltration, Gelfiltration und Säulenchromatographie, weiterverarbeitet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt diese dritte Folge von Verfahrensschritten nacheinander eine Ultrafiltration, eine erste GeIfiltration,eine Säulenchromatographie an einem schwach alkalischen Anionenaustauscher mit Diäthylaminoäthyl (DEAE) Gruppen und eine zweite Gelfiltration oder eine Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation. Man erhält eine hochreine, für medizinische Zwecke geeignete HBsAg- oder Alpha-1-Antitrypsinlösung.The solution thus obtained can then in the above-mentioned classic third series of process steps, for. optionally ultrafiltration, gel filtration and column chromatography, further processed. In a preferred embodiment of the present invention, this third series of steps comprises an ultrafiltration, a first gel filtration, a column chromatography on a weakly alkaline anion exchanger with diethylaminoethyl (DEAE) groups and a second gel filtration or a cesium chloride density gradient centrifugation. This gives a high-purity, suitable for medical purposes HBsAg or alpha-1-antitrypsin solution.
Beim Test durch Gelelektrophorese an SDS-Polyacrylamid (SDS = Natriumdodecylsulf at) zeigte sich, daß das Produkt nach der zweiten Gelpermeation eine Reinheit von mehr als 98 % aufweist, wenn die 23 K-Bande zugrundegelegt wird, die charakteristisch für HBsAg aus Hefe ist.When tested by gel electrophoresis on SDS-polyacrylamide (SDS = sodium dodecylsulfate), it was found that the product after the second gel permeation has a purity of more than 98 % , based on the 23 K band characteristic of yeast HBsAg.
Somit ist der hervorstechendste Vorteil des Verfahrens nach dieser Erfindung die im wesentlichen vollständige Entfernung aller Polysaccharide, Nucleinsäuren, Lipide und der eiweißartigen Substanzen. Ein weiterer Vorteil der Erfindung liegt darin, daß das gewünschte Protein zum Schluß in relativ hoher Ausbeute erhalten wird.Thus, the most salient advantage of the method of this invention is the substantially complete removal of all polysaccharides, nucleic acids, lipids and proteinaceous substances. Another advantage of the invention is that the desired protein is ultimately obtained in relatively high yield.
Wenn das erfindungsgemäßs Verfahren auf einen Rohextrakt von HBsAg aus genetisch modifizierten Hefezellen angewendet wird, sist das erhaltene HBsAg an das nichtionische oberflächenaktive Mittel gebunden und bildet damit gemischte Micellen, die einen Durchmesser von ungefähr 17 bis 20 nm haben. Es wurde gefunden, daß das Verhältnis der Menge des nichtionischen oberflächenaktiven Mittels verglichen mit der Menge an Proteinen, den gesamten Lipiden und Polysorbat in einer Polysorbatmischmicelle bei 15 bis 35 % (w/v) liegt, wenn die Bestimmung durch colorimetrische Methoden für Proteine (LOWRY), Gesamtiipida (ZOLLNER) und das nichtionische oberflächenaktive Mittel (HUDDLESTON und ALLRED) durchgeführt wird.When the method of the present invention is applied to a crude extract of HBsAg from genetically modified yeast cells, the HBsAg obtained is bound to the nonionic surfactant to form mixed micelles having a diameter of about 17 to 20 nm. It has been found that the ratio of the amount of nonionic surfactant compared to the amount of proteins, total lipids and polysorbate in a polysorbate admixture is 15 to 35 % (w / v) when determined by colorimetric methods for proteins (LOWRY ), Total lipid (ZOLLNER) and the nonionic surfactant (HUDDLESTON and ALLRED).
Die gemischten Micellen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren durch Einsatz eines Polysorbats als nichtionisches oberflächenaktives Mittel erhalten werden, sind neue Produkte, die ebenfalls Gegenstand dieser Erfindung sind; sie sind immunogen und können, wie klassisches HBsAg zu einem Impfstoff" verarbeitet werden, wie es für den Impfstoff gegen Hepatitis-B-Virus-Infektion bekannt ist.The mixed micelles obtained by the process of the present invention by using a polysorbate as a nonionic surfactant are novel products which are also the subject of this invention; they are immunogenic and, like classical HBsAg, can be 'processed into a vaccine' as it is known for the vaccine against hepatitis B virus infection.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele verdeutlich!:.The invention is illustrated by the following examples!
/nc./ Nc.
-12-Ausführungsbeispiele -12- embodiments
Beispiel 1example 1
Abzentrifugierte Hefezellen (3850 g) eines genetisch modifizierten Hefestamms, der HBsAg exprimiert und die bis auf 30 g Trockenzellgewicht pro Liter Kulturmedium gezüchtet worden sind, werden in 7,12 Liter Na2HPO4~Lösung (7,098 g/Liter) suspendiert.Centrifuged yeast cells (3850 g) of a genetically modified yeast strain expressing HBsAg and grown to 30 g dry cell weight per liter of culture medium are suspended in 7.12 liters of Na 2 HPO 4 solution (7.098 g / liter).
Diese Suspension wird mit 142,5 ml 4%iger (w/v) EDTA-Lösung, 38,5 ml Polysorbat 20 und 385 ml Isopropanol, das 2,7 g Phenylmethylsulfonylfluorxd (PMSF) enthält, ergänzt. Der pH-Wert wird mit NaOH (10 % w/v in Wasser) auf 8,1 ( + 0,1) eingestellt. Die Suspension wird in einem Eisbad eingefroren und durch zwei Durchgänge durch einen gekühlten Glasperlenhomogenxsator zerstört. Das Homogenisat (Rohextrakt) wird dann 30 Minuten lang bei 13 000 g zentrifugiert .This suspension is supplemented with 142.5 ml of 4% (w / v) EDTA solution, 38.5 ml of polysorbate 20 and 385 ml of isopropanol containing 2.7 g of phenylmethylsulfonylfluorxd (PMSF). The pH is adjusted to 8.1 (+ 0.1) with NaOH (10 % w / v in water). The suspension is frozen in an ice bath and destroyed by passing through a cooled glass bead homogenizer. The homogenate (crude extract) is then centrifuged for 30 minutes at 13,000 g.
PEG 400 (2,5 Liter) wird unter Rühren langsam zum Rohextrakt (7,7 Liter) gegeben, wobei dieser auf einer Temperatur unter 15°C gehalten wird. Der pH-Wert wird dann durch Zugabe von Essigsäure (5 M) auf 6 (+0,1) eingestellt. Das Medium wird 1 Stunde lang bei 4°C gehalten, bevor es 45 Minuten lang bei 7400 bis 11 000 g zentrifugiert wird.PEG 400 (2.5 liters) is added slowly with stirring to the crude extract (7.7 liters), keeping it at a temperature below 15 ° C. The pH is then adjusted to 6 (+0.1) by the addition of acetic acid (5 M). The medium is kept at 4 ° C for 1 hour before being centrifuged for 45 minutes at 7400 to 11000 g.
Die überstehende Flüssigkeit wird mit N NaOH auf den pH-Wert 7,0 (+ 0,05) gebracht. Dann werden 300 ml einer M CaCl„-Lösung (d.h. 30 ml pro Liter der überstehenden Flüssigkeit) zugegeben. Der pH-Wert wird mit N NaOH wieder auf 7 (+0,05) eingestellt. Die Lösung wird über Nacht bei 40C gehalten und dann bei 36Q0 g 45 Minuten lang zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird der Ultrafilt'ration mit Hilfe eines Geräts unterworfen, das mit einer Membran versehen ist, deren Ausschlußgrenze bei 100The supernatant is brought to pH 7.0 (+ 0.05) with N NaOH. Then, 300 ml of an M CaCl "solution (ie, 30 ml per liter of the supernatant liquid) is added. The pH is readjusted to 7 (+0.05) with N NaOH. The solution is kept overnight at 4 0 C and then centrifuged for 45 min at 36Q0 g. The supernatant liquid is subjected to ultrafiltration by means of a device provided with a membrane whose exclusion limit is 100
λ λ r ο /ι Γλ λ r ο / ι Γ
Dalton liegt. Dabei wird eine erste Aufkonzentrierung auf 1/4 (1500 ml) des Anfangsvolumens erreicht. Die Lösung wird dann kontinuierlich mit 12,5 Liter einer 1OmM Trometamol-Lösung gewaschen, die durch Zugabe von N-SaIzsäure auf den pH-Wert 8 (+0,1) gebracht worden ist (dieser Puffer wird im folgenden als Trometamol pH 8 bezeichnet) und mit PMSF (1 mM), Isopropanol (2,5 % v/v) und EDTA (2 mM) (Endkonzentration) ergänzt. Das Retentat wird dann weiter auf 350 ml eingeengt.Dalton is lying. In this case, a first concentration is reached to 1/4 (1500 ml) of the initial volume. The solution is then washed continuously with 12.5 liters of a 10 mM Trometamol solution which has been brought to pH 8 (+0.1) by the addition of N-acidic acid (this buffer is referred to below as Trometamol pH 8) ) and supplemented with PMSF (1 mM), isopropanol (2.5 % v / v) and EDTA (2 mM) (final concentration). The retentate is then further concentrated to 350 ml.
Die konzentrierte Lösung wird dann auf eine Säule (0 10 cm χ 100 cm) gebracht, die 7 Liter eines halbfesten Gels aus hydrophilen Vinylpolymeren mit einer Vielzahl von Hydroxylgruppen auf der Matrixoberfläche und einer Partikelgröße von 32 bis 63 um (FractogeüP^TSK HW65(F), nachstehend mit TSK bezeichnet) enthält, das in einem Trometamol/HCl-Puffer (10 mMol, pH-Wert 7 (+ 0,01)), der zusätzlich 5 % (v/v) Äthylenglykol enthält, äquilibriert worden ist.The concentrated solution is then placed on a column (0 10 cm χ 100 cm) containing 7 liters of a semi-solid gel of hydrophilic vinyl polymers having a plurality of hydroxyl groups on the matrix surface and a particle size of 32 to 63 microns (FractogeüP ^ TSK HW65 (F , hereinafter referred to as TSK) equilibrated in a trometamol / HCl buffer (10 mM, pH 7 (+ 0.01)), which additionally contains 5 % (v / v) ethylene glycol.
Ω Die HBsAg enthaltende Fraktion wird auf eine mit 300 ml eines schwach basischen Anionenaustauschers gefüllte Säule (0 5 cm χ 30 cm) gebracht. Bei diesem Austauscher sind Diäthylaminoäthylgruppen an Hydroxylgruppen durch Ätherbin-• düngen an die Matrix gebunden (Fractogel0' TSK DEAE 650 (M)) _5 Der Austauscher wurde in Trometamol pH 8 bei 40C äquilibriert. Gewaschen wird mit Trometamol pH 8 mit einem Gehalt von 0,05 M NaCl, HBsAg wird mit 0,15 M NaCl in Trometamol pH 8 Lösung eluiert. Ω The HBsAg-containing fraction is placed on a column filled with 300 ml of a weakly basic anion exchanger (0 5 cm χ 30 cm). In this exchanger Diäthylaminoäthylgruppen are of hydroxyl groups by Ätherbin- • fertilize bound to the matrix (Fractogel 0 'TSK DEAE 650 (M)) _ 5 The exchanger was equilibrated in trometamol pH 8 at 4 0 C. Washing is carried out with trometamol pH 8 with a content of 0.05 M NaCl, HBsAg is eluted with 0.15 M NaCl in trometamol pH 8 solution.
g0 Das Eluat wird auf eine Säule gebracht, die mit TSK — äquilibriert mit Na2HPO4/NaH2PO4-Puffer (10 mM) mit einem pH-Wert von 6,8 mit einem zusätzlichen Gehalt von NaCl (150 mM)~gefüllt ist, wobei eine Lösung von gemischten Micellen aus HBsAg/Polysorbat erhalten wird. g0 The eluate is placed on a column equilibrated with TSK equilibrated with Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 buffer (10mM) pH 6.8 with additional NaCl (150mM) ~ is filled, whereby a solution of mixed micelles of HBsAg / polysorbate is obtained.
λ r\ Γ λ r \ Γ
Der Reinigungsgrad^ der in der jeweiligen Reinigungsstufe erreicht wird, ist in Tabelle I dargestellt.The degree of purification of ^ is achieved in each purification step is shown in Table I below.
Fraktionfraction
Rohextraktcrude extract
7.7 12327.7 1232
überstehendesupernatant
PEG-Losung 8.02 11Q0 überstehendePEG solution 8 .02 11Q0 supernatant
259259
114 32500114 32500
104104
9.59.5
641 53.7641 53.7
RIA: RadioxmmunoassayRIA: Radio Immunoassay
In Tabelle II sind die Bestandteile der gemischten Micellen aus drei verschiedenen, nach dem Verfahren mit PoIysorbat 20 erhaltenen Impfstoff-Ansätzen zusammengefaßt.In Table II, the components of the mixed micelles are summarized from three different vaccine formulations obtained by the process with polyisorbate 20.
.Hifi.Hi-Fi
PEG 400 (882 ml) wird langsam zu 2,650 Liter des nach Beispiel 1 hergestellten Rohextraktes gegeben. Der pH-Wert wird auf 6 (+0,1) eingestellt. Das Medium wird 1 Stunde lang bei 4°C gehalten und dann bei 7400 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird auf 1000 ml unter Benutzung eines Geräts konzentriert, das mit einer Membran ausgerüstet ist, die eine Ausschlußgrenze bei 100 000 Dalton hat und dann mit dem dreifachen Volumen an 20 mM Trometamol pH 8 gewaschen. Gepulvertes Ammoniumsulfat (277 g) wird dann langsam unter Rübren bei 4°C zum Retentat gegeben. Nach 1 Stunde bei 4°C wird der Niederschlag 15 Minuten lang bei 1000 g zentrifugiert.PEG 400 (882 ml) is slowly added to 2.650 liters of the crude extract prepared according to Example 1. The pH is adjusted to 6 (+0.1). The medium is kept at 4 ° C for 1 hour and then centrifuged at 7400 g. The supernatant liquid is concentrated to 1000 ml using a device equipped with a membrane having an exclusion limit of 100,000 daltons and then washed with three times the volume of 20 mM trometamol pH 8. Powdered ammonium sulfate (277 g) is then added slowly to the retentate with stirring at 4 ° C. After 1 hour at 4 ° C, the precipitate is centrifuged for 15 minutes at 1000 g.
Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und das Präzipitat in 400 ml einer Lös'ung von 20 mM Trometamol pH 8, die 1 mM PMSF enthält, aufgenommen. Die Lösung wird mit Hilfe eines Geräts das mit einer Membran ausgerüstet ist, die eine. Ausschlußgrenze von 106 Dalton hat, der Ultrafiltration unterworfen. Das Retentat (500 ml) wird mit dem zweifachen Volumen an Trometamol pH 8 gewaschen und dann auf eine Säule gebracht, die 300 ml TSK-DEAE Gel enthält, das in Trometamol pH 8 äquilibriert wurde. Wenn der Durchfluß der Probe erfolgt ist, wird die Säule mit 0,05 M NaCl in Trometamol pH 8 gewaschen und ein linearer NaCl-Gradient (0,05 M - 0,5 M) auf der Säule er-The supernatant is discarded and the precipitate taken up in 400 ml of a solution of 20 mM trometamol pH 8 containing 1 mM PMSF. The solution is carried out by means of a device equipped with a membrane, which has a. Exclusion limit of 10 6 daltons, subjected to ultrafiltration. The retentate (500 ml) is washed with twice the volume of trometamol pH 8 and then placed on a column containing 300 ml TSK-DEAE gel equilibrated in trometamol pH 8. When the sample has flowed through, the column is washed with 0.05 M NaCl in trometamol pH 8 and a linear NaCl gradient (0.05 M-0.5 M) is obtained on the column.
o ο C Q L Γ.o ο CQ L Γ.
zeugt. Die mit 0,15 M NaCl eluierte Fraktion enthält das HBsAg; sie wird in 'einem Gerät, das mit einer Membrantestifies. The fraction eluted with 0.15 M NaCl contains the HBsAg; It is in a device that has a membrane
Daltpn ausgerüstet ist, deren Ausschlußgrenze bei 10 OQO/liegt, auf 50 ml eingeengt und auf eine Säule (50 χ 100 cm) gebracht, die mit einem agarhaltigen Gel (im folgenden genannt Sepharose) gefüllt ist, das mit 20 mM Trometamol pH 8 äquilibriert wurde, das zusätzlich 5 % Äthylenglykol enthielt. Dabei wird eine Lösung erhalten, die gemischte Micellen aus HBsAg/Polysorbat enthält.Daltpn equipped whose exclusion limit is 10 OQO /, concentrated to 50 ml and placed on a column (50 χ 100 cm) filled with an agar-containing gel (hereinafter called Sepharose), which equilibrates with 20 mM trometamol pH 8 which additionally contained 5 % ethylene glycol. This gives a solution containing mixed micelles of HBsAg / polysorbate.
Die Reinheitsgrade, die auf jeder Stufe erreicht werden, sind in Tabelle III angegeben.The purity levels achieved at each stage are given in Table III.
RIA : RadioimmunoassayRIA: Radioimmunoassay
Beispiel 3Example 3
HBsAg-Rohextrakt (2 Liter) wird mit PEG 400 nach der Methode von Beispiel 1 geklärt. 450 g pulverisiertes Ammoniumsulfat (AMS) wird unter Rühren dazugegeben, bis die Endkonzentration bei einer Sättigung von 45 % AMS erreicht ist. Nach Auflösung des AMS wird die Lösung 3 Stunden langHBsAg crude extract (2 liters) is clarified with PEG 400 according to the method of Example 1. 450 g of powdered ammonium sulfate (AMS) is added with stirring until the final concentration is reached at a saturation of 45 % AMS. After dissolution of the AMS, the solution becomes 3 hours long
bei 40C gehalten und die beiden getrennten Phasen, die sich am Ende dieser Zeitspanne bilden, werden in einem Scheidetrichter getrennt. Man erhält eine klare (gelbe) obere Phase (PEG 400-Phase) und eine klare untere Phase (wäßrige Phase). Jede Phase macht ungefähr±50 % des Ursprungsvolumens aus. Die wäßrige Phase wird verworfen und die Oberphase mit Hilfe eines Geräts nach der Methode ultrafiltriert, die für die überstehende CaCl2-Lösung in Beispiel 1 beschrieben ist. Das Reinigungsverfahren wird sodann weiter so durchgeführt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Es wird eine Lösung von gemischten Micellen aus HBsAg/Polysorbat erhalten.held at 4 0 C and the two separate phases that form at the end of this period are separated in a separating funnel. This gives a clear (yellow) upper phase (PEG 400 phase) and a clear lower phase (aqueous phase). Each phase accounts for approximately ± 50 % of the original volume. The aqueous phase is discarded and the upper phase is ultrafiltered by means of a device according to the method described for the supernatant CaCl 2 solution in Example 1. The purification process is then further carried out as described in Example 1. A solution of mixed micelles of HBsAg / polysorbate is obtained.
Die Reinigungsgrade, die auf jeder Stufe erreicht werden, sind in Tabelle IV angegeben.The degrees of purification achieved at each stage are given in Table IV.
Fraktionfraction
VoIVoI
Rohextrakt überstehende PEG-Lösung PEG-PhaseCrude extract supernatant PEG solution PEG phase
2000 2000 1000 502000 2000 1000 50
Retentat HBsAg Fraktion TSK 123 Eluat TSK-DEAE 25 HBsAa Fraktion. TSK 60 RIA : RadioimmunoassayRetentate HBsAg fraction TSK 123 eluate TSK-DEAE 25 HBsAa fraction. TSK 60 RIA: Radioimmunoassay
Gesamtgehalttotal content
99 92 98 98 52 54 3599 92 98 98 52 54 35
5555
13.2 2.8 1.5 .288 .0377 .020713.2 2.8 1.5 .288 .0377 .0207
2222
5.68 1.5365.68 1,536
.14 .0077 .0011 .00154.14 .0077 .0011 .00154
55885588
243 98243 98
6.666.66
2.84 .44 .392.84 .44 .39
Beispiel 4Example 4
HBsAg Rohextrakt (2 Liter) wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit PEG 400 geklärt. 450_g gepulvertes Ammoniumsulfat (AMS) wird unter Rühren dazugegeben, bis die Endkonzentration bei der AMS-Sättigung von 45 % erreichtHBsAg crude extract (2 liters) is clarified with PEG 400 as described in Example 1. 450 g powdered ammonium sulfate (AMS) is added with stirring until the final concentration reaches 45 % at AMS saturation
-uoi;.-uoi ;.
ist. Nach der Lösung des AMS wird die Lösung 3 Stunden lang bei 40C gehalten. Am Ende dieser Zeitspanne werden zwei getrennte Phasen erhalten, die in einem Scheidetrichter getrennt werden (eine klare (gelbe) Oberphase (PEG 400-Phase) und eine klare Unterphase (wäßrige Phase)). Jede Phase macht ungefähri50 % des Ursprungsvolumens aus. Die wäßrige Phase wird verworfen und ein 1-Liter-Aliquot der PEG-Phase (Oberphase) wird mit 10 mM Trometamol pH 8 aufs Zweifache verdünnt und auf eine Säule gegeben, die 300 ml TSK-DEAE Gel, äquilibriert in Trometamol pH 8, bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 100 ml/Std., enthält. Das Gel wird mit Trometamol pH 8 gewaschen, das 0,05 M NaCl enthält und das HBsAg wird dann unter Anwendung eines NaCl Gradienten (0,05 - 0,5 M NaCl in Trometamol pH 8) eluiert. Eine HBsAg Fraktion wird mit 0,15 M NaCl eluiert· Nach Aufkonzentrieren in einem Gerät, das mit einer Membran mit einer Ausschlußgrenze bei 10 000 Dalton ausgerüstet ist, wird das Retentat auf eine Säule (5 χ 100 cm) gebracht, die Sepharose 4B-C1, äquilibriert mit Trometamol pH 8 mit 5 % (v/v) Äthylenglykol, enthält. Es wird eine Fraktion von zusammengesetzten HBsAg-PoIysorbat-Micellen erhalten.is. After dissolving the AMS, the solution is kept at 4 ° C. for 3 hours. At the end of this period, two separate phases are obtained which are separated in a separatory funnel (a clear (yellow) upper phase (PEG 400 phase) and a clear lower phase (aqueous phase)). Each phase accounts for approximately 50 % of the original volume. The aqueous phase is discarded and a 1 liter aliquot of the PEG phase (upper phase) is diluted 2-fold with 10 mM Trometamol pH 8 and applied to a column containing 300 ml of TSK-DEAE gel equilibrated in trometamol pH 8 a flow rate of 100 ml / hr., Contains. The gel is washed with trometamol pH 8 containing 0.05 M NaCl and the HBsAg is then eluted using a NaCl gradient (0.05-0.5 M NaCl in trometamol pH 8). An HBsAg fraction is eluted with 0.15 M NaCl. After concentration in a device equipped with a membrane with an exclusion limit of 10 000 daltons, the retentate is placed on a column (5 × 100 cm) containing Sepharose 4B. C1 equilibrated with trometamol pH 8 with 5 % (v / v) ethylene glycol. A fraction of composite HBsAg polysorbate micelles is obtained.
Die Reinheitsgrade auf jeder Stufe sind in Tabelle V angegeben.The purity levels at each stage are given in Table V.
RIA : Radio immunoassayRIA: Radio immunoassay
HBsAg Rohextrakt (500'ml) wird durch langsame Zugabe einer Lösung von 50 g PEG 6000 in 160 ml Wasser unter Rühren bei 4"C geklärt. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 5 M Essigsäure auf 6,1 eingestellt. Nach 1 Stunde Stehen bei 4°C wird der Extrakt 15 Minuten lang bei 7000 g zentrifugiert. 157 g gepulvertes Ammoniumsulfat werden dann unter Rühren zur überstehenden Flüssigkeit gegeben, bis die Endkonzentration von 50 % Ammoniumsulfat-Sättigung erreicht ist.HBsAg crude extract (500 ml) is clarified by slowly adding a solution of 50 g of PEG 6000 in 160 ml of water while stirring at 4 ° C. The pH is adjusted to 6.1 by addition of 5M acetic acid after 1 hour The extract is centrifuged for 15 minutes at 7000 g at 4 ° C. 157 g of powdered ammonium sulfate are then added with stirring to the supernatant liquid until the final concentration of 50% ammonium sulfate saturation is reached.
Nach der Auflösung wird die Lösung 3 Stunden lang bei 40C gehalten. Nach dieser Zeitspanne werden zwei getrennte Phasen erhalten, die in einem Scheidetrichter getrennt werden. Die Oberphase (PEG-Phase, die das HBsAg enthält) wird mit Trometamol pH 8 aufs zweifache verdünnt und dann auf eine Säule gegeben, die 300 ml TSK-DEAE Gel enthält, die mit Trometamol pH 8 bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 100 ml/Std. äquilibriert worden ist. Das Gel wird mit Trometamol pH 8 gewaschen, das 0,05 M NaCl enthält und HBsAg wird mit TrometamolAfter dissolution, the solution is kept at 4 ° C. for 3 hours. After this period, two separate phases are obtained, which are separated in a separatory funnel. The upper phase (PEG phase containing the HBsAg) is diluted 2-fold with trometamol pH 8 and then added to a column containing 300 ml of TSK-DEAE gel diluted with trometamol pH 8 at a flow rate of 100 ml / hr. has been equilibrated. The gel is washed with trometamol pH 8 containing 0.05 M NaCl and HBsAg is treated with trometamol
und pH 8 eluiert, das 0,15 M NaCl enthält,/mit Hilfe eines Geräts,das mit einer Membran mit einer Ausschlußgrenze bei 10 000 Dalton ausgerüstet ist, aufkonzentriert. Das Retentat wird dann auf eine 2 Liter-Säule (5 χ 100 cm) gegeben, die mit TSK (F) gefüllt ist, das mit Trometamol pH 8 aufgeschlämmt worden ist, das 10 % (v/v) Athylenglykol enthält. Es wird eine Lösung von gemischten HBsAg/Polysorbat-Micellen erhalten.and eluting pH 8 containing 0.15 M NaCl / concentrated by means of a device equipped with a membrane with a cut-off of 10 000 daltons. The retentate is then loaded onto a 2 liter column (5 x 100 cm) filled with TSK (F) slurried with trometamol pH 8 containing 10 % (v / v) of ethylene glycol. A solution of mixed HBsAg / polysorbate micelles is obtained.
Die Reinigungsgrade auf jeder Stufe werden in Tabelle VI angegeben.The degrees of purification at each stage are given in Table VI.
Fraktionfraction
VoIVoI
Gesamtgehalttotal content
HBsAg Proteine Polysac- Nuclein-HBsAg Proteins Polysac Nuclein
___ . , säuren___. , acids
im RIA charidein the RIA charide
RIA : RadioimmunoassayRIA: Radioimmunoassay
Beispiel 6 PEG 4QO (13 ml) wird langsam zu einem Alpha-1-Antitrypsin-Rohextrakt (120 ml) gegeben, der aus einer Kultur genetisch modifizierter Hefen stammt. Der pH-Wert wird mit 5 M Essigsäure auf 6,1 eingestellt. Nach 1 Stunde Stehen bei 40C wird das Medium bei 5000 g 15 Minuten lang zentrifugiert. Eine 1 M CaCl_-Lösung wird langsam zugegeben, bis die Endkonzentration 40 mM erreicht ist. Der pH-Wert wird mit 1 M NaOH auf 7 eingestellt und das Medium wird nach Stehenlassen bei 4°C über Nacht bei 7000 g 15 Minuten lang zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird aufs Zweifache mit 50 mM Trometamol verdünnt, durch Zugabe von 0,1 N Salzsäure auf den pH-Wert 8,7 eingestellt und auf eine Säule gebracht, die TSK-DEAE (20 ml) enthält, das mit 50 mM Trometamol pH 8,7, das wie oben beschrieben hergestellt worden ist und mit einem Zusatz von 5 mM Mercaptoäthanol versehen worden ist, äquilibriert worden ist. Die Säule wird mit Trometamol pH 8,7 gewaschen, das wie oben angegeben zusammengesetzt ist, aber zusätzlich 10 mM NaCl enthält. Ein NaCl-Gradient wird angelegt (10 mM - 250 mM) und das Alpha-1-Antitrypsin wird, bei einer NaCl-Konzentration vonExample 6 PEG 4QO (13 ml) is added slowly to a crude alpha-1-antitrypsin extract (120 ml) derived from a culture of genetically modified yeasts. The pH is adjusted to 6.1 with 5 M acetic acid. After 1 hour standing at 4 0 C, the medium is centrifuged at 5000 g for 15 minutes. A 1 M CaCl_ solution is slowly added until the final concentration reaches 40 mM. The pH is adjusted to 7 with 1 M NaOH and the medium is centrifuged after standing at 4 ° C overnight at 7000 g for 15 minutes. The supernatant is diluted 2-fold with 50 mM trometamol, adjusted to pH 8.7 by the addition of 0.1 N hydrochloric acid, and applied to a column containing TSK-DEAE (20 ml) supplemented with 50 mM trometamol pH 8.7, which has been prepared as described above and provided with an addition of 5 mM mercaptoethanol, has been equilibrated. The column is washed with trometamol pH 8.7, which is composed as indicated above but additionally contains 10 mM NaCl. A NaCl gradient is applied (10 mM - 250 mM) and the alpha-1-antitrypsin is incubated at a NaCl concentration of
124 mM eluiert, getrennt von einer Protein-Fraktion,die bei 80 mM NaCl eluiert wird. Die Alpha-1-Antitrypsin-Fraktion wird mit Hilfe eines Geräts aufkonzentriert, das mit einer Membran mit einer Äusschlußgrenze bei 10 000 DaI-ton ausgerüstet ist und auf eine Säule gebracht, die mit Sephadex 150 gefüllt ist,' das in 50 mM Trometamol pH 8,7, das wie oben beschrieben hergestellt worden ist, äqulibriert worden ist. Es wird eine Lösung des gereinigten Alpha-1-Antitrypsins erhalten124 mM eluted, separated from a protein fraction eluted at 80 mM NaCl. The alpha-1-antitrypsin fraction is concentrated by means of a device equipped with a membrane with an exclusion limit of 10,000 DaI-ton and placed on a column filled with Sephadex 150 'in 50 mM Trometamol pH 8.7, which has been prepared as described above, has been äqulibriert. A solution of the purified alpha-1-antitrypsin is obtained
10 10
Die Reinigungsgrade, die in jeder Stufe erreicht werden, sind in Tabelle VII angegeben.The degrees of purification achieved in each stage are given in Table VII.
1^ , Gesamtgehalt 1 ^, total content
Fraktion VoI *Group VoI *
AAT Proteine Polysacim ELISA charide ml) (ma) (σ) (α) AAT Proteins Polysacim ELISA charide ml) (ma) (σ) (α)
AAT : Alpha-1-Antitrypsin ' AAT: alpha-1-antitrypsin '
Das Verfahren ist so, wie in Beispiel 1 beschrieben, aber statt der 300 ml M CaCl2-Lösung, die dort angegeben werden, werden 300 ml einer M MnCl2-Lösung eingesetzt. Die Eigenschaften des Endprodukts sind denen ähnlich, die für das Endprodukt nach Beispiel 1 erhalten werden.The procedure is as described in Example 1, but instead of the 300 ml of M CaCl 2 solution reported there, 300 ml of an M MnCl 2 solution are used. The properties of the final product are similar to those obtained for the final product of Example 1.
Beispiel 8Example 8
Das Verfahren entspricht dem Verfahren nach Beispiel 1. Statt der 38,5 ml Polysorbat 20, die dort angegeben werden, werden 20 ml Triton X-100 eingesetzt. Die Eigen-The procedure corresponds to the procedure according to example 1. Instead of the 38.5 ml Polysorbat 20, which are indicated there, 20 ml Triton X-100 are used. The eigen-
schaften des Endprodukts ähneln denen des Produkts, das nach Beispiel 1 erhalten wird.properties of the final product are similar to those of the product obtained according to Example 1.
Das Verfahren entspricht der in Beispiel 1 angegebenen Vorgehensweise. Statt der dort beschriebenen 38,5 ml Polysorbat 20 werden aber 38,5 ml Polysorbat 80 eingesetzt. Die Eigenschaften des Endprodukts sind ähnlich denen, die für das Produkt nach Beispiel 1 erhalten werden.The procedure corresponds to the procedure given in example 1. Instead of the 38.5 ml of polysorbate 20 described there, however, 38.5 ml of polysorbate 80 are used. The properties of the final product are similar to those obtained for the product of Example 1.
Beispiel 10Example 10
Die Lösung zusammengesetzter HBsAg-Micellen, die nach Durchführung des Verfahrens von Beispiel 1 erhalten werden, wird durch Zugabe von NaCl zu einer Endkonzentration von 0,9 % (w/v)von Phosphatpuffer (Na2HPO4ZNaH2PO4) bis zu einer Endkonzentration von 20 mM und von Aluminiumhydroxidgel bis zu einer Endkonzentration von 0,15 % (w/v) an Al(OH)3 auf eine Proteinkonzentration von 1.0 ug/ml eingestellt. Der endgültige pH-Wert beträgt 6,9.The solution of composite HBsAg micelles obtained following the procedure of Example 1 is added by adding NaCl to a final concentration of 0.9 % (w / v) of phosphate buffer (Na 2 HPO 4 ZNaH 2 PO 4 ) up to at a final concentration of 20 mM and from aluminum hydroxide gel to a final concentration of 0.15 % (w / v) of Al (OH) 3 to a protein concentration of 1.0 μg / ml. The final pH is 6.9.
Das Präparat wird sterilisiert und in 2 ml Glasampullen gefüllt, von denen jede eine 1 ml Einheitsdosis des Impf-The preparation is sterilized and filled into 2 ml glass ampoules, each containing a 1 ml unit dose of the vaccine.
Stoffs enthält. " 'Stoffs contains. ''
Einheitsdosen des Impfstoffs nach Beispiel 10 wurden intramuskulär durch zwei aufeinanderfolgende Injektionen imUnit doses of the vaccine of Example 10 were administered intramuscularly by two consecutive injections in the
aü Abstand von einem Monat an zwei Reihen seronegativer Personen verabreicht. Diese Injektionen dienen zur Vorimtnunisierung. Beispielsweise kann zwei Monate nach der ersten Impfung eine Auffrischungsimpfung erfolgen. Es wurden positive Antikörperreaktionen ein bzw. zwei Monate nach der ersten Impfung beobachtet. tn interval of one month to two series of seronegative individuals administered. These injections are used for preliminary immunization. For example, a booster dose may be given two months after the first vaccination. Positive antibody responses were observed one and two months after the first vaccination, respectively.
Λ ΛΛ Λ
In der ersten Versuchsreihe (32 seronegative Personen) war ein Monat nach der ersten Impfung die Serokonversions-Rate 20/32, d.h. 62,5 % mit einem geometrischen Mittel des Titers (GMT) von 9,95 Tausendstel internationalen Einheiten (MIU). Ein Monat nach der zweiten Impfung lag die Serokonversionsrate bei 31/32, d.h. 96,9^ mit einem GMT von 36 MIU.In the first series of experiments (32 seronegative individuals), one month after the first vaccination, the seroconversion rate was 20/32, ie 62.5 % with a geometric mean titre (GMT) of 9.95 thousandths international units (MIU). One month after the second vaccination, the seroconversion rate was 31/32, ie 96.9 ^ with a GMT of 36 MIU.
In der zweiten Versuchsreihe (46 seronegative Personen) lag die Serokonversionsrate einen Monat nach der ersten Verabreichung bei 31/46, d.h. 6 7,4 %, wobei der GMT 13/6 MIU betrug.In the second series of experiments (46 seronegative individuals), the rate of seroconversion one month after the first administration was 31/46, ie 6.7.4 %, with GMT being 13/6 MIU.
Die Aufzeichnung klinischer Anzeichen und Symptome zeigte keine Temperaturerhöhung und keine merkbare lokale Gewebsreaktion bei den Geimpften.The recording of clinical signs and symptoms showed no increase in temperature and no noticeable local tissue reaction in the vaccinated.
O /, Qfi.O /, Qfi.
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