DD247685A5 - Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Proteinen aus den erzeugenden Kulturmedien - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Proteinen aus den erzeugenden KulturmedienInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Proteinen, insbesondere Hepatitis-B-Virus-Oberflaechenantigen und Alpha-1-Antitrypsin aus proteinerzeugenden Kulturmedien.
Description
Titel der Erfindung
Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Proteinen aus den erzeugenden Kulturmedien
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Proteinen aus proteinerzeugenden Kulturmedien; das Verfahren betrifft insbesondere die Gewinnung und Reinigung von Hepatitis B Virus-Oberflächenantigen und Alpha-1-Antitrypsin, das durch DNA-Rekombinations-Technologie in modifizierten Zellkulturen, insbesondere in Kulturen von modifizierten Hefestämmen, gebildet wird.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen 25
Verschiedene Mikroorganismen, darunter Bakterien und Hefen, können als Wirtsorganismen für verschiedene Plasmide benutzt werden, die eine für ein Protein codierende Nucleotidsequenz enthalten. Unter diesen Mikroorganismen werden zur Zeit Hefen bevorzugt und gegenwärtig benutzt. Zum Beispiel ist aus der Europäischen Patentanmeldung 0 106 828 die Verwendung von Saccharomyces cerevisiae-Stämmen zur Produktion des Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigens (HBsAg) und aus der Europäischen Patentanmeldung 0 103 409 die Produktion von Alpha-1-Antitrypsin mittels Hefeplasmiden bekannt.
Die Produktion von Proteinen in Hefen weist gegenüber der Produktion in Bakterien erhebliche Vorteile auf. Diese Vorteile ergeben sich aus der einfachen Vermehrung von Hefen in Großfermentern und daraus, daß Hefen - im Gegensatz zu Bakterien ähnlich Säugetierzellen - Kohlenhydratgruppen an frisch synthetisierte Proteine anlagern können.
Nichtsdestoweniger ist die Gewinnung und Reinigung von Proteinen aus einer Hefekultur mit technischen Problemen verknüpft. Diese sind durch den komplexen chemischen Aufbau der Hefezelle bedingt und sie werden insbesondere durch den hohen Lipidgehalt verursacht, wenn/zur Erhöhung der Proteinausbeute über einen längeren Zeitraum vermehrt wird.
Die Zellwand der Saccharomyceten besteht vermutlich aus drei Schichten: (a) einer Innenschicht aus alkaliunlöslichem ß-Glucan, (b) einer Mittelschicht aus alkalilösli-..
chem ß-Glucan und (c) einer Außenschicht aus einem Glykoprotein, in dem das Kohlenhydrat aus phosphoryliertem Mannan besteht. Unter der Zellwand liegt eine Cytoplasmamembran aus einem sehr komplexen Gemisch neutraler Lipide (Mono-, Di- und Triglyceride), freien und veresterten Sterinen, einem komplexen Sphingolipid, Glycerophosphatiden und neutralen sowie sauren Glykolipiden. Der Zellkern enthält DNA, verschiedene Arten von RNA und ein Polyphosphat. Die Vakuolen können eine große Vielzahl von Bestandteilen hohen und niederen Molekulargewichts enthalten. Sie dienen als Depot für eine Anzahl hydrolytischer Enzyme. Die Mitochondrien sind reich an Lipiden, Phospholipiden und Ergosterol-Komponenten des Membransystemsj und das Cytoplasma enthält unter anderem große Mengen an Ribosomen, Polyphosphaten, Glykogen und eine Anzahl glykolytiacher Enzyme. Die meisten Hefezellen (wie die Saccharomyces-Arten) enthalten auch eine gewisse Menge
.0 A flfi. 336845
von Lipiden in Tropfenform, wobei deren Menge ansteigt in Kulturen, die über einen längeren Zeitraum gezüchtet werden.
Es ist bereits eine Anzahl von Mehrstufenverfahren zur Gewinnung und Reinigung von Proteinen aus unterschiedlichen Quellen bekannt. Beispiele, die sich auf Proteine beziehen, die von genetisch modifizierten Mikroorganismen erzeugt wurden, wurden von TH. STAEHLIN et al. (J. Biol. Chem. 256 (1981), 9750-54), K. MURRAY et al. (The EMBO J. 3_ (1984), 645-650) und R.A. HITZEMAN et al. (Nucl. Ac. Res. JJ_ (1983), 2745-2763) veröffentlicht.
• Wenn das erzeugte Protein zellgebunden ist, umfassen diese verschiedenen Verfahren im allgemeinen drei Reihen von Schritten.
In der ersten Reihe von Verfahrensschritten wird das gewünschte Protein aus dem Zellinnern entfernt. Dazu werden die zellen entweder lysiert (z.B. durch Enzymbehandlung) oder aufgebrochen, z.B. durch mechanische Kräfte, wie Scherkräfte z.B. in einer X-Press oder French-Press oder Schütteln mit Glasperlen, gegebenenfalls unter Zusatz eines oberflächenaktiven Mittels; siehe z.B. K. MURRAY et al., a.a.O., und R.A. HITZEMAN et al., a.a.O..
In der zweiten Folge von Verfahrensschritten wird das Medium am gewünschten Protein angereichert, z.B. durch fraktionierte Fällung mit Ammoniumsulfat und/ oder in Gegenwart von Polyäthylenglykol. Schließlich werden in einer dritten Folge von Verfahrensschritten im" wesentlichen alle Verunreinigungen aus dem Medium entfernt, z.B. durch eine oder mehrere Maßnahmen, wie Ultrafiltration, Ionenaustausch, Gelfiltrationschromatographie und Zentrifugieren mit isopyknischen Gradienten.
Es liegt auf der Hand, daß bei einem solchen Verfahren Verunreinigungen, wie begleitende Proteine (angegeben durch R.A. HITZEMAN et al., a.a.O.), Nucleinsäuren und Lipide, und insbesondere hohe Lipidgehalte, einen ungünstigen Einfluß auf wenigstens einen der Schritte in der dritten Reaktionsfolge (z.B. Ultrafiltration und Säulenchromatographie) haben und die proteolytischen Enzyme schnell aus dem Medium entfernt werden müssen. Darüberhinaus wurde gefunden, daß die Fallung mit Ammoniumsulfat ohne eine vorherige Grobentfernung der Lipide nicht möglich ist, weil Lipide diese Fällung stören»
Daher ist es von größter Bedeutung, eine Methode zur Verfügung zu stellen, bei der die meisten der Verunreinigungen vor der dritten Verfahrensstufe entfernt werden.
Einige der zuvor beschriebenen Verfahren offenbaren den Einsatz von Polyathylenglykol als selektives Fällungsmittel für Proteine. Es wurde auch von einem Verfahren zur Fällung von Lipoproteinen aus Plasma durch Ausnutzen von Lipoprotein-Polyanion-Metall-Wechselwirkungen berichtet.
Das Verfahren zur fraktionierten Fällung von Proteinen durch nichtionische, wasserlösliche Polymerisate, insbesondere Polyathylenglykol (PEG) wurde durch POLSON et al., Biochem. Biophys. Acta £2 (1964), 463-475, eingeführt und von verschiedenen Autoren besprochen. Unter ihnen erwähnen W. HONIG et al., Analyt. Biochem. 72. (1976), 502-512, daß "die Spezifität der Fällung, d.h. das Verhältnis des gewünschten Proteins zum Gesamtprotein dadurch verbessert werden kann, daß PEG-Fraktionen niedrigerer mittlerer Molmasse als das normalerweise eingesetzte PEG 6000 benutzt werden"
Die Autoren haben folgendes ausgeführt: "Durch Einstellen des pH-Wertes können Konzentrate individueller. Plasma-
ti
proteine erhalten werden." Die Autoren betonen jedoch, daß die Reinigung komplexerer Proteingemische, wie.des Überstandes eines Zellhomogenats, wesentlich schlechter verläuft."
P.R. POSTER et al., Biochem. Biophys. Acta 317 (1973), 505-516, haben ein Verfahren .für die Fällung von Enzymen aus Zellextrakten von Saccharomyces cerevisiae mit Hilfe von PEG beschrieben. Verfahren 'zur Konzentrierung und Reinigung von Viren und Bakteriophagen mit PEG wurden durch B.P. VAJDA, Folia Microbiol. 2_3_ (1978), 88-96, und G.J. LANCZ, Arch. Virusforsch. 4_2 (1973), 303-306, beschrieben. Auf dem Gebiet der Isolierung des Hepatitis-Antigens wurde von Ph. ADAMOWICZ et al. (S. 3 7-49 INSERM SYMPOSIUM Nr. 18, HEPATITIS B VACCINE, Publ. ELSEVIER, Amsterdam, Holland, 1981) zur Reinigung des Hepatitis-B-Oberflächenantigens (HBsAg) ein Verfahren beschrieben, das zwei aufeinanderfolgende Behandlungen mit PEG 6000 umfaßt. Bei diesem Verfahren der HBsAg-Reinigung aus Plasma werden die Immunkomplexe und die meisten der Lipoproteine in einem ersten Schritt mit PEG 6000 in einer Konzentration von 5,5 % aus dem Serum niedergeschlagen und in einem zweiten Schritt wird HBsAg aus der isolierten überstehenden Flüssigkeit durch Zusatz von PEG in einer Endkonzentration von 10 % gefällt.
In der Patentliteratur offenbart
- US-Patent 3 790 552 ein Verfahren zur Entfernung von Hepatitis-Antigen aus einer Proteinfraktion, wobei das Verfahren einen Schritt enthält, in dem PEG der Molmasse 200-6000 in einer Menge von 12-30 % (w/v) zum Fällen des Antigens benutzt wird.
ψ- US-Patent 3 951 93 7 offenbart ein Verfahren zur Reinigung von Hepatitis B Antigen (HBAg), das eine Doppelfällung des HBAg mit PEG (4,0-4,5 Gew.-%) einer' Molmasse von wenigstens 600 enthält.
1^ - US-Patent 3 994 870 offenbart ein Verfahren zur Reinigung von Hepatitis B Antigen (HBAg), wobei HBAg durch Zugabe von 4,0-4,5 Gew.-% PEG gefällt wird und danach der Affinitätschromatographie unterworfen wird, wobei unlösliches Concavalin A als chromatographisches Adsorptionsmittel benutzt wird.
- Die Europäische Patentanmeldung 0 112 506 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gegen Hepatitis B Infektionen aus Plasma, wobei das Verfahren eine Ammoniumsulfatfällung, gefolgt von-einer Adsorption an kolloidalem Silikat und zwei aufeinanderfolgenden . Fällungsschritten mit PEG (mit einer Molmasse von 2000 10 000) bei 3-7 % (w/v) zur Fällung von Hepatitis B Virus und Immunkomplexen und bei einer Konzentration von 15-20 % (w/v) in der überstehenden Flüssigkeit zum Fällen von HBsAg umfaßt.
- Auf dem Gebiet der Alpha-1-Antitrypsin-Isolierung offenbart die Japanische Patentanmeldung 9128-335 (Derwent Abstract 84-217127) die Fällung von Alpha-1-Antitrypsin aus einer Plasmafraktion durch Zugabe von PEG in einer Menge von 15-20 % (w/v).
Wie bereits erwähnt-, wurde schon früher über ein Verfahren zur Fällung von Lipoproteinen unter Ausnutzung der Lipoprotein-Polyanion-Metall-Wechselwirkung berichtet (z.B.
M. BÜRSTEIN et al. Adv. Lip. Res. JMj (1973), 67-108; und A. VAN DALEN et al. Biochem. et Biophys. Acta 147 (1967), 421-427. Dieses Verfahren wird durch Wechselwirkung zwischen den Lipoproteinen, einem zweiwertigen Metallkation und einem sauren Polysaccharid durchgeführt. Unter diesen Verfahrensbedingungen ist die Menge des Niederschlags eine Funktion der Konzentration der zweiwertigen Metallkationen im Medium.
Ziel der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von zellgebundenen Proteinen aus den erzeugenden Kulturmedien.
Das Ausgangsmaterial für das erfindungsgemaße Verfahren (im folgenden auch als "Rohextrakt" bezeichnet) ist die überstehende Flüssigkeit von genetisch modifizierten Hefezellen, die ein zellgebundenes Protein erzeugt haben und in an sich bekannter Weise in Gegenwart eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels zerstört wor-
den sind.
Nach der vorliegenden Erfindung wird die fraktionierte Fällung mit PEG (im folgenden als erste Stufe bezeichnet) gefolgt von entweder einer fraktionierten Fällung durch mehrwertige Metallkationen (insbesondere von zweiwertigen Metallen, wie Calcium und Mangan) oder durch Behandlung mit Ammoniumsulfat durchgeführt, wobei der Ammoniumsulfatbehandlung gegebenenfalls eine Ultrafiltration der überstehenden Flüssigkeit aus dem ersten Schritt vorangeht,
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Befund, daß HBsAg nicht, ausfällt, wenn festes PEG (z.B. PEG
6000) in einer Konzentration von 6-12 % (w/v) zur Extrak-
genetisch HBsAg aus/modifizierten Hefezellen eingesetzt
wird, die in Gegenwart eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels zerstört wurden. Darüberhinaus wird bei nachfolgender Zugabe von Ammoniumsulfat ein Zweiphasensystem gebildet, das dadurch charakterisiert ist, daß
HBsAg sich in der PEG-Phase befindet, während die Mehrzahl 35
der Verunreinigungen in der wäßrigen Phase vorliegen.
-o lh- 336845
Dieses Ergebnis ist überraschend, weil gemäß der allgemeinen Lehre des Standes der Technik in anderen Rohmedien diese operativen Bedingungen eine Fällung von HBsAg hervorrufen sollten. Der erste Erfindungsgegenstand besteht daher aus dem Einsatz von PEG als Lösemittel für das gewünschte, durch Hefezellkulturen erzeugte Protein, während die meisten Verunreinigungen durch ,Fällung aus dem Medium entfernt werden.
In Abhängigkeit von seiner Molmasse ist PEG entweder ein Feststoff oder eine Flüssigkeit; die Grenze zwischen beiden Formen liegt bei einer Molmasse von ungefähr 1500.
Im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens (der auch als Klärschritt bezeichnet werden könnte), können
(PEG) offensichtlich Polyäthylenglykole/verschiedener Molmasse in einer Konzentration verwendet werden, die an die entsprechende Molmasse angepaßt sind.
Zum Beispiel liegt die PEG-Konzentration vorzugsweise bei 6 bis 12 % (w/v), wenn festes PEG (z.B. PEG 6000) eingesetzt wird und im Bereich von 10 bis 35 % (v/v) - bevorzugt im Bereich von 20. bis 30 % (v/v) -wenn flüssiges PEG (z.B. PEG 300 oder 400) eingesetzt wird. Nichtsdestoweniger wird der Einsatz von flüssigem PEG aus technischen Gründen, darunter die Erleichterung der späteren Ultrafiltration, bevorzugt. s
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Proteinen, insbesondere HBsAg oder Alpha-1-Antitrypsin, aus der überstehenden Flüssigkeit von in Gegenwart eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels zerstörten Hefezellen (vorzugsweise eines Polysorbat-tensids) bereitgestellt, wobei die überstehende Flüssigkeit im folgenden als "Rohextrakt" bezeichnet wird. Dieses Verfahren umfaßt einen ersten Schritt, in dem entweder 6 bis
12 % (w/v) festes PEG oder bevorzugt 10-25 % (v/v) flüssiges PEG zum Rohextrakt gegeben werden, der auf pH 6 (+ 0,1) eingestellt ist. Die Grenzen der PEG-Konzentrationen werden hauptsächlich durch den Punkt bestimmt, an dem die Klärung erreicht ist, weil weitere Zugabe von PEG nur schädliche Wirkungen zeigt, d.h. höhere Viskosität des Mediums und die Gefahr der unerwünschten gemeinsamen Fällung von HBsAg oder Alpha-1-Antitrypsin.
im Verfahren nach der Erfindung wird PEG als poly -
meres organisches Lösemittel betrachtet, das unter anderem die Fällung der (Lipo)Proteine, deren isoelektrischer Punkt nahe bei pH 6 liegt und die Lösung der anderen (Lipo)Proteine fördert, d.h. solcher Lipoproteine,
die einen wesentlich verschiedenen isoelektrischen Punkt haben und solcher, die in hohem Maße hydrophob sind.
-* Es wurde beobachtet, daß dieser PEG-Klärschritt ungefähr 75 % der verunreinigenden Proteine, 90 % der Polysaccharide, 94 % der Nucleinsäuren und 45 % der Lipide niederschlägt, während im wesentlichen der ganze HBsAg- oder Alpha-1-Antitrypsingehalt in der überstehenden Flüssigkeit zurückbleibt.
Wie bereits erwähnt, umfaßt die vorliegende Erfindung eine Kombination von Schritten, deren erster ein Klärungsschritt ist, der zu einer teilweise gereinigten und gegebenenfalls etwas opalisierenden Lösung des gewünschten Proteins führt.
Im zweiten Schritt des Verfahrens nach der Erfindung wird die erhaltene, teilweise gereinigte Lösung entweder mit einem mehrwertigen - insbesondere zweiwertigen - Metallkation, wie etwa in Form einer wäßrigen Lösung von Calcium- oder Manganchlorid, bei einer Endkonzentration von
-ιοί 30 rnMol oder rait Ammoniumsulfat behandelt. Diese Ammoniumsulfatbehandlung wird 'entweder nach Ultrafiltration der opalisierenden Lösung durch Zugabe festen Ämmoniumsulfats bis zu einer Sättigung bei 40-50 % entsprechend den klassischen Aussalzmethoden durchgeführt,wobei ein Niederschlag des gewünschten Proteins entsteht, der in einem Phosphatpuffer aufgenommen werden kann oder durch Zusatz von Ammoniumsulfat zur PEG-enthaltenden überstehenden Flüssigkeit bis zu einer 40-50 &Lgen Sättigung, wobei ein Zweiphasensystem mit dem gewünschten Protein in der PEG-Phase gebildet wird.
Jede dieser Ausführungsformen der zweiten Folge von Reaktionsschritten führt zu einer klaren Lösung des gewünschten, im wesentlichen reinen Proteins, was den Gehalt
an Polysacchariden, Nucleinsäuren, Lipiden und verunreinigenden Proteinen angeltt.
Die so erhaltene Lösung kann dann in der vorstehend angegebenen klassischen dritten Folge von Verfahrensschritten,z.B. gegebenenfalls Ultrafiltration, Gelfiltration und Säulenchromatographie, weiterverarbeitet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt diese dritte Folge von Verfahrensschritten nacheinander eine Ultrafiltration, eine erste GeIfiltration,eine Säulenchromatographie an einem schwach alkalischen Anionenaustauscher mit Diäthylaminoäthyl (DEAE) Gruppen und eine zweite Gelfiltration oder eine Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation. Man erhält eine hochreine, für medizinische Zwecke geeignete HBsAg- oder Alpha-1-Antitrypsinlösung.
Beim Test durch Gelelektrophorese an SDS-Polyacrylamid (SDS = Natriumdodecylsulf at) zeigte sich, daß das Produkt nach der zweiten Gelpermeation eine Reinheit von mehr als 98 % aufweist, wenn die 23 K-Bande zugrundegelegt wird, die charakteristisch für HBsAg aus Hefe ist.
Somit ist der hervorstechendste Vorteil des Verfahrens nach dieser Erfindung die im wesentlichen vollständige Entfernung aller Polysaccharide, Nucleinsäuren, Lipide und der eiweißartigen Substanzen. Ein weiterer Vorteil der Erfindung liegt darin, daß das gewünschte Protein zum Schluß in relativ hoher Ausbeute erhalten wird.
Wenn das erfindungsgemäßs Verfahren auf einen Rohextrakt von HBsAg aus genetisch modifizierten Hefezellen angewendet wird, sist das erhaltene HBsAg an das nichtionische oberflächenaktive Mittel gebunden und bildet damit gemischte Micellen, die einen Durchmesser von ungefähr 17 bis 20 nm haben. Es wurde gefunden, daß das Verhältnis der Menge des nichtionischen oberflächenaktiven Mittels verglichen mit der Menge an Proteinen, den gesamten Lipiden und Polysorbat in einer Polysorbatmischmicelle bei 15 bis 35 % (w/v) liegt, wenn die Bestimmung durch colorimetrische Methoden für Proteine (LOWRY), Gesamtiipida (ZOLLNER) und das nichtionische oberflächenaktive Mittel (HUDDLESTON und ALLRED) durchgeführt wird.
Die gemischten Micellen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren durch Einsatz eines Polysorbats als nichtionisches oberflächenaktives Mittel erhalten werden, sind neue Produkte, die ebenfalls Gegenstand dieser Erfindung sind; sie sind immunogen und können, wie klassisches HBsAg zu einem Impfstoff" verarbeitet werden, wie es für den Impfstoff gegen Hepatitis-B-Virus-Infektion bekannt ist.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele verdeutlich!:.
/nc.
-12-Ausführungsbeispiele
Beispiel 1
Abzentrifugierte Hefezellen (3850 g) eines genetisch modifizierten Hefestamms, der HBsAg exprimiert und die bis auf 30 g Trockenzellgewicht pro Liter Kulturmedium gezüchtet worden sind, werden in 7,12 Liter Na2HPO4~Lösung (7,098 g/Liter) suspendiert.
Diese Suspension wird mit 142,5 ml 4%iger (w/v) EDTA-Lösung, 38,5 ml Polysorbat 20 und 385 ml Isopropanol, das 2,7 g Phenylmethylsulfonylfluorxd (PMSF) enthält, ergänzt. Der pH-Wert wird mit NaOH (10 % w/v in Wasser) auf 8,1 ( + 0,1) eingestellt. Die Suspension wird in einem Eisbad eingefroren und durch zwei Durchgänge durch einen gekühlten Glasperlenhomogenxsator zerstört. Das Homogenisat (Rohextrakt) wird dann 30 Minuten lang bei 13 000 g zentrifugiert .
PEG 400 (2,5 Liter) wird unter Rühren langsam zum Rohextrakt (7,7 Liter) gegeben, wobei dieser auf einer Temperatur unter 15°C gehalten wird. Der pH-Wert wird dann durch Zugabe von Essigsäure (5 M) auf 6 (+0,1) eingestellt. Das Medium wird 1 Stunde lang bei 4°C gehalten, bevor es 45 Minuten lang bei 7400 bis 11 000 g zentrifugiert wird.
Die überstehende Flüssigkeit wird mit N NaOH auf den pH-Wert 7,0 (+ 0,05) gebracht. Dann werden 300 ml einer M CaCl„-Lösung (d.h. 30 ml pro Liter der überstehenden Flüssigkeit) zugegeben. Der pH-Wert wird mit N NaOH wieder auf 7 (+0,05) eingestellt. Die Lösung wird über Nacht bei 40C gehalten und dann bei 36Q0 g 45 Minuten lang zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird der Ultrafilt'ration mit Hilfe eines Geräts unterworfen, das mit einer Membran versehen ist, deren Ausschlußgrenze bei 100
λ λ r ο /ι Γ
Dalton liegt. Dabei wird eine erste Aufkonzentrierung auf 1/4 (1500 ml) des Anfangsvolumens erreicht. Die Lösung wird dann kontinuierlich mit 12,5 Liter einer 1OmM Trometamol-Lösung gewaschen, die durch Zugabe von N-SaIzsäure auf den pH-Wert 8 (+0,1) gebracht worden ist (dieser Puffer wird im folgenden als Trometamol pH 8 bezeichnet) und mit PMSF (1 mM), Isopropanol (2,5 % v/v) und EDTA (2 mM) (Endkonzentration) ergänzt. Das Retentat wird dann weiter auf 350 ml eingeengt.
Die konzentrierte Lösung wird dann auf eine Säule (0 10 cm χ 100 cm) gebracht, die 7 Liter eines halbfesten Gels aus hydrophilen Vinylpolymeren mit einer Vielzahl von Hydroxylgruppen auf der Matrixoberfläche und einer Partikelgröße von 32 bis 63 um (FractogeüP^TSK HW65(F), nachstehend mit TSK bezeichnet) enthält, das in einem Trometamol/HCl-Puffer (10 mMol, pH-Wert 7 (+ 0,01)), der zusätzlich 5 % (v/v) Äthylenglykol enthält, äquilibriert worden ist.
Ω Die HBsAg enthaltende Fraktion wird auf eine mit 300 ml eines schwach basischen Anionenaustauschers gefüllte Säule (0 5 cm χ 30 cm) gebracht. Bei diesem Austauscher sind Diäthylaminoäthylgruppen an Hydroxylgruppen durch Ätherbin-• düngen an die Matrix gebunden (Fractogel0' TSK DEAE 650 (M)) _5 Der Austauscher wurde in Trometamol pH 8 bei 40C äquilibriert. Gewaschen wird mit Trometamol pH 8 mit einem Gehalt von 0,05 M NaCl, HBsAg wird mit 0,15 M NaCl in Trometamol pH 8 Lösung eluiert.
g0 Das Eluat wird auf eine Säule gebracht, die mit TSK — äquilibriert mit Na2HPO4/NaH2PO4-Puffer (10 mM) mit einem pH-Wert von 6,8 mit einem zusätzlichen Gehalt von NaCl (150 mM)~gefüllt ist, wobei eine Lösung von gemischten Micellen aus HBsAg/Polysorbat erhalten wird.
λ r\ Γ
Der Reinigungsgrad^ der in der jeweiligen Reinigungsstufe erreicht wird, ist in Tabelle I dargestellt.
Fraktion
Rohextrakt
| VoI | HBsAg | Gesamtgehalt | Lipide |
| (1) | im RIA | Proteine Polysac- Nuclein- | |
| (πια) | charide säuren | (er) | |
| (a) (a) (ma) | |||
7.7 1232
überstehende
PEG-Losung 8.02 11Q0 überstehende
259
114 32500
104
9.5
641 53.7
| 10 CaCl2-Lösung 8 Retentat .350 | 1190 13-20 | 37 26.7 | 3.8 .744 | 512 37.6 | 27.2 3.596 |
| HBsAg Fraktion | |||||
| von TSK 1.06 | 736 | .935 | .014 | 16 | .352 |
| Eluat von | |||||
| 20 TSK-DEAE · .15 | 722 | .428 | .0084 | 2.6 | .275 |
| HBsAg Fraktion | |||||
| von TSK .4 5 | 1117 | .244 | .0094 | 2 | .179 |
RIA: Radioxmmunoassay
In Tabelle II sind die Bestandteile der gemischten Micellen aus drei verschiedenen, nach dem Verfahren mit PoIysorbat 20 erhaltenen Impfstoff-Ansätzen zusammengefaßt.
.Hifi
| T St «Μ | 'abelle II | Polysorbat | 20 Verhält | |
| Proteine | nxsc | |||
| Ansatz | Gesamt- | (pg/rol) | A/B/C | |
| (pg/ral) | lipide | (C) | ||
| (A) | (ug/ml) | 8.5 | 18 | |
| 20 | (B) | 8.4 | 19 | |
| I | 20 | 20 | 15.6 | 31 |
| II | 20 | 16 | ||
| III | 14.5 | |||
PEG 400 (882 ml) wird langsam zu 2,650 Liter des nach Beispiel 1 hergestellten Rohextraktes gegeben. Der pH-Wert wird auf 6 (+0,1) eingestellt. Das Medium wird 1 Stunde lang bei 4°C gehalten und dann bei 7400 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird auf 1000 ml unter Benutzung eines Geräts konzentriert, das mit einer Membran ausgerüstet ist, die eine Ausschlußgrenze bei 100 000 Dalton hat und dann mit dem dreifachen Volumen an 20 mM Trometamol pH 8 gewaschen. Gepulvertes Ammoniumsulfat (277 g) wird dann langsam unter Rübren bei 4°C zum Retentat gegeben. Nach 1 Stunde bei 4°C wird der Niederschlag 15 Minuten lang bei 1000 g zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und das Präzipitat in 400 ml einer Lös'ung von 20 mM Trometamol pH 8, die 1 mM PMSF enthält, aufgenommen. Die Lösung wird mit Hilfe eines Geräts das mit einer Membran ausgerüstet ist, die eine. Ausschlußgrenze von 106 Dalton hat, der Ultrafiltration unterworfen. Das Retentat (500 ml) wird mit dem zweifachen Volumen an Trometamol pH 8 gewaschen und dann auf eine Säule gebracht, die 300 ml TSK-DEAE Gel enthält, das in Trometamol pH 8 äquilibriert wurde. Wenn der Durchfluß der Probe erfolgt ist, wird die Säule mit 0,05 M NaCl in Trometamol pH 8 gewaschen und ein linearer NaCl-Gradient (0,05 M - 0,5 M) auf der Säule er-
o ο C Q L Γ.
zeugt. Die mit 0,15 M NaCl eluierte Fraktion enthält das HBsAg; sie wird in 'einem Gerät, das mit einer Membran
Daltpn ausgerüstet ist, deren Ausschlußgrenze bei 10 OQO/liegt, auf 50 ml eingeengt und auf eine Säule (50 χ 100 cm) gebracht, die mit einem agarhaltigen Gel (im folgenden genannt Sepharose) gefüllt ist, das mit 20 mM Trometamol pH 8 äquilibriert wurde, das zusätzlich 5 % Äthylenglykol enthielt. Dabei wird eine Lösung erhalten, die gemischte Micellen aus HBsAg/Polysorbat enthält.
Die Reinheitsgrade, die auf jeder Stufe erreicht werden, sind in Tabelle III angegeben.
| Tabelle | VoI | HBsAg imRIA | III | Polysac charide | Nuclein säuren | |
| (mc) | (σ) | (ma) | ||||
| Fraktion' | (ml) | 188 160 150 | 36.9 3.321 .181 | 9250 536 175 | ||
| 2650 2530 1000 | 80.8 | Gesamtgehalt | .0248 | 160 | ||
| 400 | 72.4 44 | Proteine | .029 0.073 | 88 3 | ||
| Rohextrakt überstehende PEG-Lö'sung - Retentat 10 | 1000 560 | 23 | (σ) | .0003 | .05 | |
| AMS-Pellets | 200 | 114.721 22.755 7.468 | ||||
| Retentat 10 Eluat von 25 TSK-DEAE | 1.248 | |||||
| HBsAg-Fraktion Seoharose 4B-CL | .529 .157 | |||||
| .030 |
RIA : Radioimmunoassay
Beispiel 3
HBsAg-Rohextrakt (2 Liter) wird mit PEG 400 nach der Methode von Beispiel 1 geklärt. 450 g pulverisiertes Ammoniumsulfat (AMS) wird unter Rühren dazugegeben, bis die Endkonzentration bei einer Sättigung von 45 % AMS erreicht ist. Nach Auflösung des AMS wird die Lösung 3 Stunden lang
bei 40C gehalten und die beiden getrennten Phasen, die sich am Ende dieser Zeitspanne bilden, werden in einem Scheidetrichter getrennt. Man erhält eine klare (gelbe) obere Phase (PEG 400-Phase) und eine klare untere Phase (wäßrige Phase). Jede Phase macht ungefähr±50 % des Ursprungsvolumens aus. Die wäßrige Phase wird verworfen und die Oberphase mit Hilfe eines Geräts nach der Methode ultrafiltriert, die für die überstehende CaCl2-Lösung in Beispiel 1 beschrieben ist. Das Reinigungsverfahren wird sodann weiter so durchgeführt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Es wird eine Lösung von gemischten Micellen aus HBsAg/Polysorbat erhalten.
Die Reinigungsgrade, die auf jeder Stufe erreicht werden, sind in Tabelle IV angegeben.
Fraktion
VoI
Rohextrakt überstehende PEG-Lösung PEG-Phase
2000 2000 1000 50
Retentat HBsAg Fraktion TSK 123 Eluat TSK-DEAE 25 HBsAa Fraktion. TSK 60 RIA : Radioimmunoassay
Gesamtgehalt
| HBsAg | Proteine | Polysac | Nuclein |
| im RIA | charide | säuren | |
| (rna) | (Q) | (Q) | (ma) |
99 92 98 98 52 54 35
55
13.2 2.8 1.5 .288 .0377 .0207
22
5.68 1.536
.14 .0077 .0011 .00154
5588
243 98
6.66
2.84 .44 .39
Beispiel 4
HBsAg Rohextrakt (2 Liter) wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit PEG 400 geklärt. 450_g gepulvertes Ammoniumsulfat (AMS) wird unter Rühren dazugegeben, bis die Endkonzentration bei der AMS-Sättigung von 45 % erreicht
-uoi;.
ist. Nach der Lösung des AMS wird die Lösung 3 Stunden lang bei 40C gehalten. Am Ende dieser Zeitspanne werden zwei getrennte Phasen erhalten, die in einem Scheidetrichter getrennt werden (eine klare (gelbe) Oberphase (PEG 400-Phase) und eine klare Unterphase (wäßrige Phase)). Jede Phase macht ungefähri50 % des Ursprungsvolumens aus. Die wäßrige Phase wird verworfen und ein 1-Liter-Aliquot der PEG-Phase (Oberphase) wird mit 10 mM Trometamol pH 8 aufs Zweifache verdünnt und auf eine Säule gegeben, die 300 ml TSK-DEAE Gel, äquilibriert in Trometamol pH 8, bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 100 ml/Std., enthält. Das Gel wird mit Trometamol pH 8 gewaschen, das 0,05 M NaCl enthält und das HBsAg wird dann unter Anwendung eines NaCl Gradienten (0,05 - 0,5 M NaCl in Trometamol pH 8) eluiert. Eine HBsAg Fraktion wird mit 0,15 M NaCl eluiert· Nach Aufkonzentrieren in einem Gerät, das mit einer Membran mit einer Ausschlußgrenze bei 10 000 Dalton ausgerüstet ist, wird das Retentat auf eine Säule (5 χ 100 cm) gebracht, die Sepharose 4B-C1, äquilibriert mit Trometamol pH 8 mit 5 % (v/v) Äthylenglykol, enthält. Es wird eine Fraktion von zusammengesetzten HBsAg-PoIysorbat-Micellen erhalten.
Die Reinheitsgrade auf jeder Stufe sind in Tabelle V angegeben.
| VoI | Tabelle | V | roteine | Polysac | Nuclein-. | |
| charide | sauren | |||||
| Fraktion | ία) | ία) | (πια) | |||
| (ral) | Gesamtgehalt | 60. 600 | 19.000 · | 4860 | ||
| 2100 | HBsAg P | 3.100 | 1.436 | 80 | ||
| 1200 | im RIA | .750 | .0048 | 05 | ||
| Rohextrakt | 460 | (ma) | ||||
| PEG-Phase | 200 | .120 | .0014 | 0.3 | ||
| Eluat TSK-DEAE | 150 | 210 | ||||
| HBsAg Fraktion | 134 | |||||
| SeDharose 4B-CL | ||||||
| 110 |
RIA : Radio immunoassay
HBsAg Rohextrakt (500'ml) wird durch langsame Zugabe einer Lösung von 50 g PEG 6000 in 160 ml Wasser unter Rühren bei 4"C geklärt. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 5 M Essigsäure auf 6,1 eingestellt. Nach 1 Stunde Stehen bei 4°C wird der Extrakt 15 Minuten lang bei 7000 g zentrifugiert. 157 g gepulvertes Ammoniumsulfat werden dann unter Rühren zur überstehenden Flüssigkeit gegeben, bis die Endkonzentration von 50 % Ammoniumsulfat-Sättigung erreicht ist.
Nach der Auflösung wird die Lösung 3 Stunden lang bei 40C gehalten. Nach dieser Zeitspanne werden zwei getrennte Phasen erhalten, die in einem Scheidetrichter getrennt werden. Die Oberphase (PEG-Phase, die das HBsAg enthält) wird mit Trometamol pH 8 aufs zweifache verdünnt und dann auf eine Säule gegeben, die 300 ml TSK-DEAE Gel enthält, die mit Trometamol pH 8 bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 100 ml/Std. äquilibriert worden ist. Das Gel wird mit Trometamol pH 8 gewaschen, das 0,05 M NaCl enthält und HBsAg wird mit Trometamol
und pH 8 eluiert, das 0,15 M NaCl enthält,/mit Hilfe eines Geräts,das mit einer Membran mit einer Ausschlußgrenze bei 10 000 Dalton ausgerüstet ist, aufkonzentriert. Das Retentat wird dann auf eine 2 Liter-Säule (5 χ 100 cm) gegeben, die mit TSK (F) gefüllt ist, das mit Trometamol pH 8 aufgeschlämmt worden ist, das 10 % (v/v) Athylenglykol enthält. Es wird eine Lösung von gemischten HBsAg/Polysorbat-Micellen erhalten.
Die Reinigungsgrade auf jeder Stufe werden in Tabelle VI angegeben.
Fraktion
VoI
Gesamtgehalt
HBsAg Proteine Polysac- Nuclein-
___ . , säuren
im RIA charide
| (ml) | (ma) | (σ) | (a) | (ma) | |
| Rohextrakt überstehende PEG- Flüssigkeit PEG-Phase | 500 490 270 | 123 100 110 | 22.600 4.153 1.820 | 6.400 .509 .2096 | 1200 24 5.3 |
| Eluat TSK-DEAE | 150 | 66 | .258 | .028 | .4 |
| HBsAa Fraktion"TSK | 60 | 63 | .065 | .00048 | .084 |
RIA : Radioimmunoassay
Beispiel 6 PEG 4QO (13 ml) wird langsam zu einem Alpha-1-Antitrypsin-Rohextrakt (120 ml) gegeben, der aus einer Kultur genetisch modifizierter Hefen stammt. Der pH-Wert wird mit 5 M Essigsäure auf 6,1 eingestellt. Nach 1 Stunde Stehen bei 40C wird das Medium bei 5000 g 15 Minuten lang zentrifugiert. Eine 1 M CaCl_-Lösung wird langsam zugegeben, bis die Endkonzentration 40 mM erreicht ist. Der pH-Wert wird mit 1 M NaOH auf 7 eingestellt und das Medium wird nach Stehenlassen bei 4°C über Nacht bei 7000 g 15 Minuten lang zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird aufs Zweifache mit 50 mM Trometamol verdünnt, durch Zugabe von 0,1 N Salzsäure auf den pH-Wert 8,7 eingestellt und auf eine Säule gebracht, die TSK-DEAE (20 ml) enthält, das mit 50 mM Trometamol pH 8,7, das wie oben beschrieben hergestellt worden ist und mit einem Zusatz von 5 mM Mercaptoäthanol versehen worden ist, äquilibriert worden ist. Die Säule wird mit Trometamol pH 8,7 gewaschen, das wie oben angegeben zusammengesetzt ist, aber zusätzlich 10 mM NaCl enthält. Ein NaCl-Gradient wird angelegt (10 mM - 250 mM) und das Alpha-1-Antitrypsin wird, bei einer NaCl-Konzentration von
124 mM eluiert, getrennt von einer Protein-Fraktion,die bei 80 mM NaCl eluiert wird. Die Alpha-1-Antitrypsin-Fraktion wird mit Hilfe eines Geräts aufkonzentriert, das mit einer Membran mit einer Äusschlußgrenze bei 10 000 DaI-ton ausgerüstet ist und auf eine Säule gebracht, die mit Sephadex 150 gefüllt ist,' das in 50 mM Trometamol pH 8,7, das wie oben beschrieben hergestellt worden ist, äqulibriert worden ist. Es wird eine Lösung des gereinigten Alpha-1-Antitrypsins erhalten
10
Die Reinigungsgrade, die in jeder Stufe erreicht werden, sind in Tabelle VII angegeben.
1^ , Gesamtgehalt
Fraktion VoI *
AAT Proteine Polysacim ELISA charide ml) (ma) (σ) (α)
| Rohextrakt | 120 | 180 | 4.018 | .538 |
| überstehende PEG-Lösung | 100 | 212 | 1.300 | .290 |
| überstehende CaCl_-Lösung | 100 | 194 | .660 | .110 |
| Eluat TSK-DEAE | 520 | 180 | - .210 | .0052 |
AAT : Alpha-1-Antitrypsin '
Das Verfahren ist so, wie in Beispiel 1 beschrieben, aber statt der 300 ml M CaCl2-Lösung, die dort angegeben werden, werden 300 ml einer M MnCl2-Lösung eingesetzt. Die Eigenschaften des Endprodukts sind denen ähnlich, die für das Endprodukt nach Beispiel 1 erhalten werden.
Beispiel 8
Das Verfahren entspricht dem Verfahren nach Beispiel 1. Statt der 38,5 ml Polysorbat 20, die dort angegeben werden, werden 20 ml Triton X-100 eingesetzt. Die Eigen-
schaften des Endprodukts ähneln denen des Produkts, das nach Beispiel 1 erhalten wird.
Das Verfahren entspricht der in Beispiel 1 angegebenen Vorgehensweise. Statt der dort beschriebenen 38,5 ml Polysorbat 20 werden aber 38,5 ml Polysorbat 80 eingesetzt. Die Eigenschaften des Endprodukts sind ähnlich denen, die für das Produkt nach Beispiel 1 erhalten werden.
Beispiel 10
Die Lösung zusammengesetzter HBsAg-Micellen, die nach Durchführung des Verfahrens von Beispiel 1 erhalten werden, wird durch Zugabe von NaCl zu einer Endkonzentration von 0,9 % (w/v)von Phosphatpuffer (Na2HPO4ZNaH2PO4) bis zu einer Endkonzentration von 20 mM und von Aluminiumhydroxidgel bis zu einer Endkonzentration von 0,15 % (w/v) an Al(OH)3 auf eine Proteinkonzentration von 1.0 ug/ml eingestellt. Der endgültige pH-Wert beträgt 6,9.
Das Präparat wird sterilisiert und in 2 ml Glasampullen gefüllt, von denen jede eine 1 ml Einheitsdosis des Impf-
Stoffs enthält. " '
Einheitsdosen des Impfstoffs nach Beispiel 10 wurden intramuskulär durch zwei aufeinanderfolgende Injektionen im
aü Abstand von einem Monat an zwei Reihen seronegativer Personen verabreicht. Diese Injektionen dienen zur Vorimtnunisierung. Beispielsweise kann zwei Monate nach der ersten Impfung eine Auffrischungsimpfung erfolgen. Es wurden positive Antikörperreaktionen ein bzw. zwei Monate nach der ersten Impfung beobachtet.
Λ Λ
In der ersten Versuchsreihe (32 seronegative Personen) war ein Monat nach der ersten Impfung die Serokonversions-Rate 20/32, d.h. 62,5 % mit einem geometrischen Mittel des Titers (GMT) von 9,95 Tausendstel internationalen Einheiten (MIU). Ein Monat nach der zweiten Impfung lag die Serokonversionsrate bei 31/32, d.h. 96,9^ mit einem GMT von 36 MIU.
In der zweiten Versuchsreihe (46 seronegative Personen) lag die Serokonversionsrate einen Monat nach der ersten Verabreichung bei 31/46, d.h. 6 7,4 %, wobei der GMT 13/6 MIU betrug.
Die Aufzeichnung klinischer Anzeichen und Symptome zeigte keine Temperaturerhöhung und keine merkbare lokale Gewebsreaktion bei den Geimpften.
O /, Qfi.
Claims (14)
- Erfindungsanspruch1. Verfahren zur Gewinnung und Reinigung eines zellgebundenen Proteins aus der überstehenden Flüssigkeit genetisch modifizierter Hefezellen, die nach der Erzeugung des Proteins in Gegenwart eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels zerstört worden sind, gekennzeichnet dadurch, daß der pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit auf 6 (+0,1) eingestellt wird, entweder flüssiges oder festes Polyathylenglykol bis zur Klärung der überstehenden Flüssigkeit zugegeben wird und die geklärte überstehende Flüssigkeit entweder mit einem zweiwertigen Metallkation oder, gegebenenfalls nach Ultrafiltration, mit Ammoniumsulfat zur Abtrennung des Proteins behandelt wird.
- 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das flüssige Polyathylenglykol in einer solchen Menge zugegeben wird, daß die Endkonzentration im Bereich zwischen 10 und 35 % (v/v) liegt.
- 3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß festes Polyathylenglykol in einer solchen Menge zugegeben wird, daß eine Endkonzentration im Bereich zwischen 6 und 12 % (w/v) erreicht wird.
- 4. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß das Protein das Hepatitis-B-Oberflächenantigen ist.
- 5. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch," daß das Protein Alpha-1 -Antitrypsin ist.33684G
- 6. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß die geklärte, überstehende Flüssigkeit mit einem zweiwertigen Metallkation behandelt wird.5-7. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß das zweiwertige Metallkation ein Calcium- oder Mangan-Kation ist.
- 8. Verfahren nach einem der Punkte 6 und 7, gekennzeich-" ' net dadurch, daß es zusätzlich die Abtrennung des Niederschlags, Ultrafiltration der Lösung, Gelpermeations-Chromatographie des Retentats, Ionenaustausch-Chromatographie der proteinhaltigen Fraktion und; gegebenenfalls, eine zweite Gelpermeations-Chromatographie oder Zentrifugieren in einem Cäsiumchlorid-Gradienten enthält.
- 9. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß die geklärte, überstehende Lösung mit Ammoniumsulfat bis zu einem Gehalt von 40 bis 50 % versetzt und das gereinigte Protein aus der Polyäthylenglykolphase isoliert wird.
- 10. Verfahren nach Punkt 9, gekennzeichnet dadurch, daß die Polyäthylenglykol-Phase gegebenenfalls einer weiteren ,Ultrafiltration, gefolgt von einer Gelpermeations-Chromatographie und Ionenaustausch-Chromatographie unterworfen wird.
- 11. Verfahren nach Punkt 9, gekennzeichnet dadurch, daß die Polyäthylenglykol-Phase gegebenenfalls einer weiteren Ultrafiltration, gefolgt von'einer Ionenaustausch-Chromatographie und Gelpermeations-Chromatographie, unterworfen wird.
- 12. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß die geklärte überstehende Lösung der Ultrafiltration unterworfen wird und das Retentat mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 40 bis 50 % behandelt wird, wobei dasλ /. nc.Protein ausfällt, das in einer geeigneten Pufferlösung aufgenommen wird.
- 13. Verfahren nach Punkt 12, gekennzeichnet dadurch,daß es zusätzlich eine Ultrafiltration, Gelpermeations-Chro-. matographie und Ionenaustausch-Chromatographie umfaßt..
- 14. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß das nichtionische oberflächenaktive Mittel ein Polysorbat ist. ""
- 15. Verfahren nach Punkt 14, gekennzeichnet dadurch, daß das Polysorbat Polysorbat 20 ist.
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