DD248143A1 - Verfahren zur herstellung von intermediaerprodukten des sterolabbaus - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 1,4-Androstadien-3,17-dion (ADD) und 4-Androsten-3,17-dion (AD) durch mikrobielle Transformation von Sterolen. Die Erfindung hat das Ziel, diese Intermediaerprodukte des Sterolabbaues nach weitgehend einheitlicher Technologie in hohen Ausbeuten zu gewinnen. Die Erfindung loest die Aufgabe in der Weise, dass die Fermentation mit ausgewaehlten Mikroorganismenstaemmen, vorzugsweise mit Staemmen aus der Gattung Mycobacterium, unter gleichzeitiger Anwesenheit von neuen, speziellen Adsorbern, die Copolymerisate aus Acrylsaeureester, Ethylvinylbenzen sowie Divinylbenzen sind, und von neuen, speziellen Tensiden aus der Gruppe der Polyethylenoxid (PEO)-Polypropylenoxid (PPO)-Blockcopolymeren bzw. aus der Gruppe der PEO-PPO-Addukte des N,N-Tetra-(-oxypropylpropyol)-N-(2-oxypropyl)-diethylentriamins durchgefuehrt wird. Hierbei werden in kurzen Fermentationszeiten Produkte in hohen Ausbeuten bei gleichzeitig wesentlich verbesserter Reinheit erhalten.
Description
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Es ist bekannt, daß Sterole, wie z. B. Cholesterol, Sitosterol, Stigmasterol, Campesterol und Ergosterol durch Mikroorganismen aus zahlreichen Gattungen, wie z. B. Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Nocardia, Pseudomonas, Protaminobacter, Serratia, Streptomyces und insbesondere Mycobacterium neben anderen Stoffen über die Intermediärprodukte 4-Androstadien-3,17-dion (im folgenden kurz AD genannt) und 1,4-Androstadien-3,l7-dion (im folgenden kurz ADD genannt) abgebaut werden können. Diese Produkte werden im Fermentationsmedium nur dann angereichert, wenn keine 9<*-Hydroxylierung erfolgt bzw. wenn sowohl 1 (2)-Dehydrierung als auch 9a-Hydroxylierung лісгп stattfinden können. Dies wird unter anderem dadurch erreicht, daß Mikroorganismus-Mutantenstämme mit Defekten in den genannten enzymatischen Leistungen zur Fermentation verwendet werden (siehe z.B. die Patentschriften JP 7973191 oder JP 80148083). Die ersten unter Verwendung von Enzymdefektmutanten arbeitenden Verfahren zur Herstellung von AD (siehe Patentschrift US 3759791) mit Mycobacterium spec. NRRL B-38051' bzw. von ADD (siehe Patentschrift US 3684857) mit Mycobacterium spec. NRRLB-36831' ausSterolen offenbaren bei Einsatz von 1 g Sitosterol/I sowie einer Fermentationszeit von 186 Stunden bis 216 Stunden Ausbeuten von 43% der Theorie AD bzw. 40% der Theorie ADD, bezogen auf den Anteil des bei der Fermentation umgewandelten Sitosterols. In der Patentschrift EP 8214 werden 30 g Sitosterol/I während einer Fermentationszeit von nunmehr 336 Stunden bei Einsatz des Stammes Mycobacterium fortuitum CBS 313,79 zu einer nicht genannten Menge AD mit geringem Anteil ADD transformiert. Mit Mycobacterium fortuitum NRRL B-8153 bzw. Mycobacterium phlei NRRL B-8154 (siehe' Patentschrift US4243645) wird aus 30g Sitosterol/I eine ebenfalls nicht genannte Menge von AD/ADD-Gemisch erhalten. Den bisher bekannten Verfahren haftet also der Mangel an, daß die Effektivität, bedingt durch niedrigen Steroleinsatz und/oder lange Fermentationszeiten bei gleichzeitig niedrigen Ausbeuten, zu gering ist.
Auch verschiedene Zusätze wie Glyceride (siehe Patentschrift JP 54138192) oder Eigelb (siehe Patentschrift JP 8608794) zum Fermentationsmedium führten bisher nicht zu einer wesentlichen Verbesserung der Effektivität der Verfahren. So werden beispielsweise unter Zusatz von 10g/l Trockeneigelb zum Fermentationsmedium mit Mycobacterium vaccae NRRLB-3683 in 168 Stunden Fermentationszeit 15g Cholesterol mit einer Ausbeute von 27Gew.-% an ADD umgesetzt. Ein weiterer gemeinsamer Nachteil der genannten und anderer aus der Literatur bekannter Verfahren (man vergleiche etwa Patentschrift JP 80111796) ist in der Notwendigkeit der Abtrennung der Fermentationsprodukte von nicht umgesetzten Sitosterol zu sehen, da bei einer Extraktion der Fermentationsbrühe sowohl Substrat als auch Produkte im Extrakt enthalten sind. Eine erste Lösung zur Überwindung dieser Schwierigkeit fanden M.Aoki et al. (siehe Patentschrift JP 7757161, Kokai), die unpolare Adsorber vom XAD-Typ nach Beendigung der Fermentation zusetzten und damit die gebildeten Produkte selektiv abtrennen konnten. Durch diesen Nachfolgeschritt konnte die Effektivität der eigentlichen Fermentation jedoch nicht positiv beeinflußt werden.
Die von I.Sauerbaum et al. (I.Europ. Kongr. f. Biotechnol., Interlaken, 1978) beschriebene Fermentation von Sitosterol mit Mycobacterium spec. NRRL B-3683 in Gegenwart von Styren-Divinyl-benzen-Copolymeren (XAD2) als unpolaren Adsorber, in der 10g Sitosterol/I in 96 Stunden zu 80% der Theorie zu einem Gemisch aus ADD und AD umgewandelt werden, ist als die bisher effektivstei-eseng anzusehen. Dabei entsteht AD in einer Raum-Zeit-Ausbeute von etwa 16g/m3 · h, ADD von etwa 41 g/m3 h. Die Berechnung der Raum-Zeit-Ausbeuten erfolgte als (g) gebildetes ADD bzw. AD pro (m3) Fermentationsbrühe und Fermentationsstunde (h) ohne Berücksichtigung der Fermentor-Umrüstzeiten. Diesem Verfahren haften folgende Nachteile an:
— AD entsteht nur als Nebenprodukt. Die Ausbeute an AD kann auch in Gegenwart von XAD 2 nicht über 25 Gew.-%, bezogen auf eingesetztes Sitosterol, gesteigert werden.
— Andererseits beträgt unter der Bedingung, die zu den besten Ausbeuten führt (Zusatz von 7g/! Tween 20 als nichtionisches Tensid Polyethylenglycolsorbitanfettsäureester), der Anteil AD am Produktgerhisch ADD/AD etwa 30% und kann auch durch Verringerung der Tensidkonzentration selbst unter Inkaufnahme einer Abnahme der Gesamtausbeuten nicht unter etwa 20% gesenkt werden.
— Das in der Fermentation entstehende Gemisch ADD/AD in den angegebenen Konzentrationsverhältnissen kann nur durch aufwendige Reinigungsoperationen und damit unter Einschaltung zusätzlicher Verfahrensschritte getrennt werden.
— Die für die besten beschriebenen Ausbeuten erforderliche hohe Konzentration an dem oben genannten nichtionischen Tensid führt schließlich ebenfalls zu einer erschwerten chemischen Aufarbeitung und bedeutet somit eine erhebliche Belastung der Ökonomie des Verfahrens.
Von den gleichen Autoren wurde darüber hinaus der Einsatz von polaren Adsorbern des XAD-Strukturtyps bei der mikrobielten Transformation von Sterolen mit Nocardia spec. M 29 untersucht (siehe Europ. J. Appl. Mikrobiol. 2, 243,1976). Nach ihrer Aussage führt eine derartige Verfahrensmodifikation jedoch direkt zu einer Minderung der Ausbeute an ADD bzw. AD.
Ziel der Erfindung
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung der Intermediärprodukte 1,4-Androstadien-3,17-dion (ADD) durch mikrobielle Transformation von Sterolen.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von ADD und AD aus Sterolen zu beschreiben, in dem nach weitgehend einheitlicher Technologie sowohl ADD/AD-Gemische mit einem ADD-Anteil von
Nach JP 105289 (Kokai) wurden diese Mycobacterium spec. — Stämme später als Mycobacterium vaccae klassifiziert.
mindestens 88 Gew.-% als auch reines AD jeweils bei hohem Steroldurchsatz, kurzen Fermentationszeiten und guten Gesamtausbeuten erhalten werden
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß wie folgt gelöst:
Sterole wie Sitosterol, Cholesterol, Campesterol, Stigmasterol bzw. Ergosterol oder Gemische dieser Sterole werden in Form einer Sterol-Tensid-Präparation eingesetzt, so daß die Konzentration an Sterol 1 g/l bis 50 g/l beträgt, und mit Mikroorganismen, die zur Steroltransformation unter Bildung der Produkte ADD und/oder AD befähigt sind, fermentiert. Die Sterol-Tensid-Präparationen werden entweder nach an sich bekannten Verfahren (Lyophilisierung bzw. Vermählen, beispielsweise in Korundmühlen) oder nach dem in einer früheren Anmeldung beschriebenen Sprühtrocknungsverfahren gewonnen (zu den erfindungsgemäß eingesetzten Tensiden siehe unten auf Seite 6).
Als Mikroorganismen werden Bakterienstämme aus den Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Nocardia, Pseudomonas, Protaminobacter, Serratia, Streptomyces, vorzugsweise jedoch aus der Gattung Mycobacterium eingesetzt.
Es wird fermentiert in Medien, die Kohlenstoffquellen, wie beispielsweise Glycerol, Glucose, Saccharose, Stärke und/oder Melasse usw., und Stickstoffquellen, wie beispielsweise Hefeextrakt, Harnstoff, Ammoniumsalze, Maisquellwasser, Pflanzenmehle und/oder andere komplexe Medienbestandteile (wie z. B. Fleischextrakt, Hydrolysate usw.) sowie Mineralsalze verschiedener Zusammensetzungen enthalten. Die Fermentation erstreckt sich über 24 Stunden bis 192 Stunden und wird bei 200C bis 45°C bei pH-Werten im Bereich von pH 6 bis pH 8 unter aeroben Bedingungen in Rührfermentorenoderin Fermentoren, die nach dem Air-Iift-Prinzip arbeiten, z. B. in Schlaufenreaktoren, durchgeführt. Erfindungsgemäß setzt man dem Fermentationsansatz von Beginn an oder nach einem Zeitintervall bis zu 48 Stunden einen Adsorber vom Typ eines organischen Polymeren, der polare Gruppen, vorzugsweise Acrylsäurederivat-Gruppen, enthält, in einem Mengenverhältnis von 2g/l bis 200g/lzu.
Der Adsorber wird nach beendeter Fermentation durch an sich bekannte Trennmethoden wie Filtration, Zentrifugation oder Separation von der ausfermentierten-Kulturlösung einschließlich Biomasse und gegebenenfalls nicht umgesetztem Sterol abgetrennt. Anschließend wird das am Adsorber befindliche Produktgemisch durch Behandeln mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Methanol, eluiert und das Roheluat durch an sich bekannte Verfahrensschritte, beispielsweise durch Umkristallisation, von Nebenprodukten gereinigt.
Die erfindungsgemäß einzusetzenden Adsorbentien enthalten vorzugsweise Acrylsäureester- oder Acrylsäure- oder Acrylnitril-Monomereneinheiten (siehe detaillierter auf S. 7 dieser Erfindungsbeschreibung); sie können hergestellt werden, indem die entsprechenden Monomeren zusammen mit anderen bifunktionellen Monomeren (wie Styren oder Ethylstyren) mit polyfunktionellen Monomeren (wie Divinylbenzen) unter Bedingungen copolymerisiert werden, die zu einer porösen Struktur des Polymeren führen.
Erfindungsgemäß enthalten die Adsorber also gleichzeitig sowohl aromatische Gruppierungen als auch Acrylsäurederivat-Gruppen. Überraschenderweise sind polare Adsorber dieses Typs in der angegebenen technischen Aufgabe hinsichtlich der Stimulation der Fermentation sowohl in Richtung hoher Gesamtausbeuten als auch in Richtung einer Beeinflussung des erwünschten ADD/AD-Produktverhältnisses den bekannten Adsorbertypen (XAD 1 bis 12), die entweder ausschließlich auf Vinylaromaten-oder ausschließlich auf Acrylsäureesterbasis hergestellt werden, überlegen. Weiter wurde gefunden, daß durch Anwendung von Sterolpräparationen mit Tensiden sowohl aus der Gruppe der Polyethylenoxid-Polypropylenoxid (PEO-PPOJ-Blockcopolymeren mit einem Anteil von 30% bis 70% Polypropylenglycol und mit Molekulargewichten von 1000 bis 3500, im folgenden Tenside der Gruppe A genannt, als auch aus der Gruppe der Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Adduktedes N,N"-Tetra-(oxypropylpropyol)-N'-(2-oxypropyl)-diethylentriamins mit Molekulargewichten des Polypropylenglycols um 1400 bis 2 000, im folgenden Tenside der Gruppe B genannt, in Fermentationen gemeinsam mit den genannten Adsorbern neben einer weiteren Erhöhung der Fermentationsausbeuten auch der Anteil des jeweiligen Nebenproduktes des Produktpaares ADD/AD zurückgedrängt werden kann.
Ein Verfahren zur mikrobiellen Transformation von Sterolen unter Verwendung der hier genannten spezifischen Tenside ist auch Gegenstand einer parallelen Anmeldung. Der erwähnte besondere Vorteil des Verfahrens ist insofern überraschend, als bisher durch Tenside zwar die Gesamtausbeute erhöht, nicht aber eine selektive Wirkung erzeugt werden konnte. Das Verfahren wird vorteilhaft wie folgt ausgeführt: a) Impfkultur
Für die Fermentation zu ADD (mit einer geringen Beimengung von AD) wird vorzugsweise Mycobacterium vaccae NRRL B-3683 oder eine Selektante aus NRRL B-3683 verwendet (eine der Selektanten ist in der Kulturensammlung des ZIMET unter der Registriernummer IMETSK113 hinterlegt worden).
Für die Fermentation zu AD wird vorzugsweise Mycobacterium vaccae NRRL B-3805 oder gleichfalls eine Selektante aus NRRL B-3805 benutzt (eine der Selektanten ist in der Kulturensammlung des ZIMET unter der Registriernummer IMET SK110 hinterlegt worden).
Die Mikroorganismen werden in Medien kultiviert, die als Kohlenstoffquellen Glycerol oder Glucose, als Stickstoffquellen beispielsweise Hefeextrakt, Harnstoff oder Ammoniumsalze sowie Mineralsalze verschiedener Zusammensetzungen enthalten. Der pH-Wert liegt um den Neutralpunkt. Die Bebrütungstemperatur liegt im Bereich von 200C bis 45°C; die Bebrütungsdauer beträgt 12 Stunden bis 77 Stunden.
Mit 2,5% bis 20% der so erhaltenen Submerskultur wird das Fermentationsmedium, das die gleiche oder eine andere Zusammensetzung wie die Impfkultur haben kann, beimpft.
b) Fermentation
Dem Fermentatio'nsmedium wird feuchter Adsorber zweckmäßigerweise bereits vor der Sterilisation zugegeben; eine Zugabe bis zu 48 Stunden nach der Sterolzugabe bewirkt aber noch keinen wesentlichen Effektivitätsverlust. Als Adsorber kommen vorteilhaft Copolymerisate aus Acrylsäureester, Ethylvinylbenzen und Divinylbenzen mit einer Korngröße oberhalb 0,4mm zum Einsatz, im folgenden Adsorber vom Typ I bzw. Il genannt. Dabei ist Adsorber vom Typ I ein poröses Copolymerisat in Form kugeliger Teilchen, das durch radikalisch initiierte Polymerisation eines Gemisches von je etwa 45Gew.-% Ethylvinylbenzen und Divinylbenzen und etwa 10 Gew.-% Acrylsäuremethylesteroder-ethylester in Suspension gewonnen wird und durch eine spezifische Oberfläche von mindestens 250m2/g sowie ein Gesamtporenvolumen von mindestens 0,4cm3/g charakterisiert
wird. Adsorber vom Typ Il ist ein Copolymerisat ähnlicher Zusammensetzung, das aber eine spezifische Oberfläche von mindestens 400m2/g und ein Gesamtporenvolumen von mindestens 1,0cm3/g hat.
Die erforderliche Adsorbermenge liegt zwischen 2g bis 200g/l. Die genannte Menge ist sowohl von der Kapazität und der Adsorptionsgeschwindigkeit des ausgewählten Adsorbers als auch von der eingesetzten Sterolkonzentration und der damit zu erwartenden Produktmenge abhängig. Beispielsweise hat sich für die Fermentation von 10g/l Sitosterol die Zugabe von 80g/l Adsorber vom Typ Il als vorteilhaft erwiesen (Fall der Steroltransformation zu ADD).
Die Sterolpräparation wird als feinverteilte Suspension gemeinsam mit einem Tensid aus Gruppe A oder aus Gruppe B als Gesamtmenge (1 g/l bis 50g/l) oder portionsweise sofort oder bis zu 48 Stunden danach oder auch kontinuierlich nach dem Beimpfen zugegeben. Eine Sterilisation der Gesamtmenge mit dem Medium ist gleichfalls möglich.
Die Fermentation kann in geeigneten Gefäßen als Schüttelkultur, in Fermentoren, die mechanisch gerührt und belüftet werden, oder in Fermentoren, die nach dem Air-Iift-Prinzip arbeiten, stattfinden. Sowohl ADD als auch AD werden am Adsorber angereichert.
Zur Herstellung von ADD kommt hierbei vorteilhaft Adsorber vom Typ Il in Gegenwart eines Tensids aus der Gruppe B zum Einsatz. So wurden Raum-Zeit-Ausbeuten von bis zu 74g ADD/m3 h neben 7,3g AD/m3 · h und 7,5g 1,4-022-AIkOhOlZm3 · h erzielt.
Zur AD-Herstellung wird vorteilhaft mit Adsorber vom Typ I in Gegenwart eines Tensids aus der Gruppe A fermentiert. In dieser Adsorber-Tensid-Kombination wurden so Raum-Zeit-Ausbeuten bis zu 68g reines AD/m3 h erreicht.
Die Prozeßkontrolle erfolgt durch bekannte analytische Verfahren, z. B. sowohl durch HPLC-, GC-, DC-Bestimmung der durch Butylacetat aus dem Fermentationsmedium extrahierten Sterole als auch durch GC-, HPLC- oder DC-Bestimmung der vom Adsorber eluierten Produkte. Hierzu wird eine Probe aus dem Fermentationsansatz entnommen, der Adsorber gegebenenfalls durch Sieben abgetrennt, mit Wasser von anhaftenden Bakterien und Mediumbestandteilen gewaschen und nutschenfeucht ausgewogen. Eine definierte Menge wird mit 80- bis 100%igem wäßrigem Methanol eluiert. Durch HPLC-, GC- oder DC-Trennung, gekoppelt mit UV-Messung, kann das Produktgemisch, das vorwiegend aus ADD und/oder AD sowie den entsprechenden C22-Alkoholen (21 -Hydroxy^O-methyW-pregnen-S-on und/oder 21 -Hydroxy^O-methyl-i^-pregnadien-3-on) als Nebenprodukten besteht, quantitativ analysiert werden.
c) Chemische Aufarbeitung
Bei Fermentationen zur Herstellung von AD wird der vom Fermentationsmedium abgetrennte und gewaschene Adsorber vorzugsweise in eine Säule überführt und mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise mit 80%igem Methanol, eluiert. Nach Einengen des Eluates im Vakuum bei 300C bis 400C auf ca. 10% fällt das Rohprodukt aus und kann nach Abkühlen auf ca. +50C abfiltriert und getrocknet werden. Nach einmaliger Umkristallisation aus Methanol wird AD mit einem Reinheitsgrad von ca. 95% erhalten. Die nur in geringer Menge gebildeten Nebenprodukte ADD und C22-Alkohole verbleiben in der Mutterlauge.
Bei Fermentationen mit vorwiegender Bildung von ADD wird in analoger Weise das Rohprodukt gewonnen. Aus dem · Rohprodukt wird durch Umkristallisation das ADD/AD-Gemisch mit einem ADD-Anteil von etwa 90% gewonnen. Sowohl Adsorber vom Typ I als auch Adsorber vom Typ Il können ohne Einbuße an Ausbeute und Qualität der Produkte und ohne Beeinträchtigung des Prozesses wiederverwendet werden
Die erfindungsgemäße Lösung hat folgende Vorteile:
Nach dem angegebenen Verfahren entsteht bei der Fermentation mit Mycobacterium vaccae NRRL B-3805 in hoher Ausbeute das gewünschte Produkt AD, welches quantitativ an den eingesetzten Adsorber vom Typ I gebunden wird. Durch einfache Elution des Adsorbers und Kristallisation des AD wird dieses dann in reiner Form erhalten. Während nach der besten bisher bekannten Lösung AD in einer Raum-Zeit-Ausbeute von etwa 16g/m3 · h im Gemisch mit ADD entsteht, also noch durch aufwendige Reinigungsoperationen, die mit Ausbeuteverlusten verbunden sind, abgetrennt werden muß, können erfindungsgemäß Raum-Zeit-Ausbeuten bis zu 68g reines AD/m3 · h erzielt werden (s. Ausführungsbeispiel 3). Hier zeichnet sich das Verfahren gegenüber dem Stand der Technik vor allem durch eine wesentliche Steigerung der Effektivität und eine Verbesserung der Technologie aus.
Bei verfahrensgemäßer Fermentation mit Mycobacterium vaccae NRRL B-3683 unter Verwendung eines Adsorbers vom Typ Il entsteht das Siewün^schte^Prod^uktADD mit einem Anteil von etwa 90% am Gemisch der Endprodukte ADD/AD ebenfalls in hohen Ausbeuten. Während nach dem Stand der Technik (beste Lösung) ADD in einer Raum-Zeit-Ausbeute von etwa 41 g/ m3 · h im Gemisch mit etwa 16g AD/m3 · h entsteht, können erfindungsgemäß Raum-Zeit-Ausbeuten von bis zu 74g ADD/ 3 ' ^ unc' ^»5g 1,4-C22-Alkohol/m3 · h erzielt werden (vergl. Ausführungsbeispiel 8).
Hier zeichnet sich das Verfahren gegenüber bekannten Lösungen insbesondere durch eine erhöhte Effektivität bei gleichzeitiger wesentlicher Verbesserung der Reinheit des erzielten ADD aus.
a) Impfkultur
Mycobacterium vaccae NRRL B-3805 wird auf Schrägagar folgender Zusammensetzung 48 Stunden bis 96 Stunden bei 28°C kultiviert: 20g Glycerol, 5g Bacto-Pepton,3g Fleischextrakt, 15g Agar-Agar, Aqua dest. ad 1 000ml; pH7,0.
Mit den angeschwemmten Zellen je eines Röhrchens werden 500ml-Stehrundkolben mit je 50 ml Nährstoff lösung folgender Zusammensetzung beimpft: 10g Glycerol, 10g Hefeextrakt,0,5g KH2PO4,0,5g K2HPO4,1,5g (NH4J2HPO4,0,2g MgSO4 · 7H2O, 0,01 g FeSO4 7H20,0,002g ZnSO4 7H2O, Aqua dest. ad 1 000ml; pH7,0.
Nach48stündigem Schütteln bei 28°C wird diese Submerskultur bei einem Impfverhältnis 1:10 zur Beimpfung weiterer Vermehrungsstufen bzw. der Fermentationsstufe verwendet.
b) Fermentation
Sechzig 500 ml-Stehrundkolben werden mit 50 ml Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung beschickt und sterilisiert: 5g Glucose, 10g Hefeextrakt, 1 g K2HPO4, 0,3g CaCO3,1,5g (NH4J2HPO4,0,2g MgSO4- 7H2O, 0,01g FeSO4- 7H2O, 0,002g ZnSO4 -7H20,60g nutschenfeuchter Adsorber vom Typ I, Aqua dest. ad 1000 ml; pH 7,0.
Nach der Beimpfung mit 10% der vorher beschriebenen Impfkultur erfolgt die Zugabe von 6,5 g Sitosterol/I mitO,5g/ITensid der Gruppe A und 1 g/l Silicon-Entschäumer Antaphron NM 40. Nach 96stündigem Schütteln bei 280C wird die Fermentation durch Abtrennen und Waschen des Adsorbers mit Wasser beendet. Der Adsorber wird mit 80%igem Methanol eluiert, das Eluat im Vakuum bei 30cC bis 400C eingeengt.
Dabei wurden 10g kristallines Rohprodukt gewonnen, dessen Zusammensetzung aus nachstehender Tabelle zu entnehmen ist. Durch Umkristallisation aus Methanol wurden 7,5g gaschromatographisch und dünnschichtchromatographisch reines AD erhalten. Im vorliegenden Beispiel wurden folgende Ausbeuten erzielt:
| Einsatz | AD | AD | Produkte | Bemerkungen | C22-Alkohol | Meßwerte |
| 19,5 g | g | % | ADD | g | Meßwerte | |
| Sitosterol | 9,71 | 100 | g | 1,23 | ||
| Eluatd I) | 8,71 | 89,7 | 0,72 | 0,7 | Meßwerte | |
| Rohprodukt | 0,51 | |||||
| (10g) | 0,87 | 0,42 | gravimetr. | |||
| 1. Mutterlauge | 0,12 | Wert | ||||
| (2,6 g) | 7,5 | 77,2 | 0 | Meßwerte | ||
| Kristallisat | 0 | |||||
| (7,5 g) | 1,15 | 0,57* | ||||
| 2. Mutterlauge | 0,52 | 0,12** | ||||
| (2,5 g) | ||||||
* гі-НусІгоху-гО-теігіуІ-Д-ргедпеп-З-оп (Д-Сгг ** 2l-Hydroxy-20-methyl-1,4-pregnadien-3-on (
Aus vorstehender Tabelle geht hervor, daß bei einem Einsatz von 6,5g Sitosterol/I 72% der Theorie an AD-Rohprodukt und 54% der Theorie gaschromatographisch reines AD erhalten wurde. Das entspricht einer berechneten Raum-Zeit-Ausbeute an gaschromatographisch reinem AD von 25g AD/m3 · h.
20 Rundenkolben mit 50 ml Füllung wurden für die Fermentation entsprechend Beispiel 1 beschickt. Es wird Adsorber vom Typ Il in gleicher Konzentration verwendet. Nach 96stündiger Fermentation bei 28°C auf dem Rundschwingtisch wird entsprechend Beispiel 1 der Fermentationsansatz abgebrochen und aufgearbeitet. Bei einem Einsatz von 6,5g Sitosterol/I wurden 3,6g AD-Rohprodukt und 0,4g Nebenprodukte (ADD + C22-AIkOhOIe) erhalten. Das entspricht einer berechneten Raum-Zeit-Ausbeute von 37,5g AD-Rohprodukt/m3 · h.
20 Rundkolben werden entsprechend Beispiel 1 für die Fermentation beschickt; folgende Veränderungen gegenüber Beispiel 1 werden vorgenommen: Adsorber vom Typ I wird in einer Konzentration von 100g/l angewendet. Außerdem werden 7,25g Sitosterol/I sofort nach dem Beimpfen der Fermentationskultur zugegeben, weitere 7,25g Sitosterol/I 24 Stunden später. Nach 96 Stunden Fermentation und Aufarbeitung entsprechend Beispiel 1 wurden 6,5g AD/1,0,5g ADD/I und 1,5 gC22-Alkohol/l erhalten. Das entspricht einer berechneten Raum-Zeit-Ausbeute von 67,7 g AD (gaschromatographisch rein)/m3 h.
Ein Kleinfermentor vom Typ Chemap 30 mit Turbinenrührer wird mit 20I Fermentationslösung entsprechend Beispiel 1 ohne Adsorber beschickt. Für die Beimpfung (1:10) wird eine weitere Submerskuitur in 2-l-lmpfflaschen mit 400ml Füllung angelegt. Nach der Beimpfung werden 150g Sitosterol-Präparation mitTensid der Gruppe A zugegeben. Die Sitosterol-Tensidpräparation ist nach dem in unserer Anmeldung WP CO7J/2408957 beschriebenen Verfahren hergestellt worden. Die Belüftung erfolgt mit 11 Luft/l Fermentationslösung und Minute. Die Drehzahl des Rührwerkes beträgt während der ersten 6 Stunden 600 U/min, anschließend nach Zugabe von 1,2 kg Adsorber vom Typ I bis zu 120 Stunden 150 U/min. Nach der Aufarbeitung entsprechend Beispiel 1 wurden 49,6g Rohprodukt und 13,2g Nebenprodukte (ADD + C22-Alkohol) erhalten. Das entspricht einer Raum-Zeit-Ausbeute von 20,8g AD (Rohprodukt)/m3 · h.
Ausgehend von 300ml einer 2 Tage alten Impfkultur entsprechend Beispiel 1 wird ein Air-Iift-Fermentor mit 3I Fermentationsmedium entsprechend Beispiel 1 (einschließlich Adsorbereinsatz) beimpft. Die Lufteintragsrate beträgt in den ersten 52 Stunden 101/min und wird dann bis zum Ende der Fermentation auf 12,51/min eingestellt. Nach 90 Stunden bei 28°C sind die eingesetzten 18,3g Sitosterol in folgende Produkte umgewandelt worden: 7,08g AD, 1,29g ADD, 1,35g 4-C22-Alkohol, 1,02 g 1,4-C22-Alkohol. Das entspricht einer Raum-Zeit-Ausbeute von 26,2 g AD (gaschromatographisch rein)/ m3-h.
Ein Air-Iift-Fermentor mit 31 Medium (einschließlich Adsorber) entsprechend Beispiel 1, wobei die Glucosekonzentration von 5g/l auf 2,5 g/l herabgesetzt und statt Hefeextrakt 1 g/l Harnstoff eingesetzt wurde, wird entsprechend Beispiel 4 mit 300ml einer Impfkultur gemäß Beispiel 1 beimpft. Nach 96 Stunden sind folgende Produkte aus 18,3g Sitosterol/l gebildet worden: 6,39g AD, 1,35g ADD, 1,59g 4-C22-Alkohol, 0,33g 1,4-C22-Alkohol. Das entspricht einer Raum-Zeit-Ausbeute von 22,2g AD (gaschromatographisch rein)/m3 · h.
Mycobacterium vaccae NRRL B-3683 wird auf Schrägagar folgender Zusammensetzung 48 Stunden bis 96 Stunden bei 28°C kultiviert: 20g Glycerol, 5g Bacto-Pepton, 3g Fleischextrakt, 15g Agar-Agar ad 1 000ml Aqua dest.; pH7,0. Mit den entsprechenden Zellen je eines Röhrchens werden 500ml-Stehrundkolben mit je 50ml Nährlösung folgender Zusammensetzung beimpft: 10g Glycerol, 10g Hefeextrakt, 0,5g KH2PO4,0,5g K2HPO4,1,5g (NH4)2HPO4,0,2g MgSO4 · 7H2O, 0,01g FeSO4- 7H2O, 0,002g ZnSO4 · 7H2O Aqua dest ad 1000ml; pH7,0.
Nach36stündigem Schütteln bei 280C wird diese erste Submerskultur bei einem Impfverhältnis von 1:10 zur Beimpfung einer zweiten Submerskultur verwendet, die wie die erste Submerskultur geführt wird. Nach Vereinigung von 5 Stehrundkolben der zweiten Submerskultur wird ein Laborfermentor mit 2,51 Nutzvolumen im Verhältnis 1:10 beimpft. Die Fermentationslösung hat folgende Zusammensetzung: 5g Glucose, 0,125g Harnstoff, 2g KH2PO4, 8g K2HPO4,3g (NH4I2SO4, 0,2g MgSO4 · 7 H20,0,01 g FeSO4 · 7H2O, 0,002g ZnSO4 · 7H2O, Aqua dest. ad 1 000ml; pH 7,0.
Der Fermentationsansatz enthält zusätzlich 80g/l nutschenfeuchten Adsorber vom Typ I. Nach der Beimpfung wird eine sterile Sitosterol-Tensid-Präparation (Tensid der Gruppe B) mit einem Gehalt an 25g Sitosterol zugegeben. Bei einer Belüftung von 0,331 Luft/l Fermentationslösung und Minute und einer Rührerdrehzahl von 450 U/min werden nach 96stündiger Fermentation 12,1 g ADO, 1,6g AD und 1,9g 1,4-C22-Alkohol erhalten. Das entspricht einer Ausbeute von 80% der Theorie ADD/AD mit einem ADD-Anteil von 88,3% sowie 9,7% der Theorie 1,4-C22-Alkohol. Daraus ergibt sich eine Raum-Zeit-Ausbeute von 50,4g ADD/m3 h.
Die Anzucht von Mycobacterium vaccae NRRL B-3683 sowie die Herstellung einer Impfkultur erfolgt analog zu Beispiel 7.
Zwei 500-ml-Stehrundkolben werden mit je 50 ml Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung beschickt und sterilisiert: 5g Saccharose, 7,5g Hefeextrakt, 3g (NH4I2SO4,1 g KH2PO4,4g K2HPO4, 0,2g MgSO4 · 7H20,0,01 g FeSO4 7 H2O,
ZnSO4 · 7H20,120g nutschenfeuchter Adsorber vom Typ I, Aqua dest. ad 1000 ml; pH 7,0.
Nach Beimpfung mit 10% der vorher beschriebenen Impfkultur erfolgt die Zugabe einer sterilen Sitosterol-Tensid-Präparation (Tensid der Gruppe B) bis zur Konzentration von 14g/l Sitosterol. Nach 96stündigem Schütteln bei 28°C wird die Fermentation durch Abtrennen und Waschen des Adsorbers mit Wasser beendet. Der Adsorber wird mit Methanol eluiert.
Gaschromatographisch wurde die Bildung von 0,71 g ADD, 0,14g AD und 0,1 g C22-Alkoholen nachgewiesen; das entspricht einer Ausbeute von 74,5% der Theorie ADD neben 14,5% der Theorie AD und 8,8% der Theorie C22-Alkohole. Daraus errechnet sich eine Raum-Zeit-Ausbeute von 74g ADD/m3 · h.
Bei Einsatz von 50 g Sitosterol sowie 350g Adsorber vom Typ I werden unter den in Beispiel 7 beschriebenen Bedingungen, unter anderem bei Einsatz eines Tensidsri&r&ruppe B, nach 94 Fermentationsstunden 13,8g ADD, 1,85g AD und 0,7g 1,4-C22-Alkohol erhalten; das entspricht 46% der Theorie ADD/AD-Gemisch mit einem ADD-Anteil von 88%. Bei Verlängerung der Fermentationszeit auf 100 Stunden entstehen 17,g ADD, 2,2g Ad und 1,4g 1,4-C22-Alkohol; das sind 58% der Theorie ADD:AD-Gemisch mit einem ADD-Anteil von 89%.
Unter den in Beispiel 9 genannten Bedingungen werden 75% des Sitosterols unmittelbar nach der Beimpfung und 25% des Sitosterols nach 76 Fermentationsstunden dem Fermentationsansatz zugegeben. Nach 94 Stunden Fermentation werden 17,5g ADD, 1,7g AD und 1,8g 1,4-C22-AIkOhOl, das sind 57% der Theorie ADD/AD mit einem AD-Anteil von 10,3%, gefunden. Das entspricht einer Raum-Zeit-Ausbeute von 74g ADD/m3 · h.
Eine Verlängerung der Fermentation führt nach 192 Stunden zur Bildung von 23,2 g ADD, 2,2 g AD und 1,7 g 1,4-C22-Alkohol; das sind 74% der Theorie ADD/AD-Gemisch mit einem AD-Anteil von 8,7%. Das entspricht einer Raum-Zeit-Ausbeute von 48,4g ADD/m3 h.
Claims (8)
- V. Verfahren zur Herstellung von Intermediärprodukten des Sterolabbaues, so von 1,4-Androstadien-3,17-dion und 4-Androsten-3,17-dion, unter Einsatz von Sterolen wie Sitosterol, Cholesterol, Campesterol, Stigmasterol und Ergosterol oder von Sterolgemischen, gekennzeichnet dadurch, daß ein Sterol oder ein Sterolgemisch in Form einer Präparation mit Tensiden entweder aus der Gruppe der Polyethylenoxid (PEO)-Polypropylenoxid (PPO)-Blockcopolymeren oder aus der Gruppe der PEO-PPO-Addukte des N,N"-Tetra(-oxypropylpropyol)-N'-(2-oxyproyl)-diethylentriaminsin Konzentrationen an Sterol von 1 g/l bis50g/l eingesetzt und mit einem aus den Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, Pseudomonas, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces gewählten, zur Gewinnung von 1,4-Androstadien-3,17-dion (ADD) und 4-Androsten-3,17-dion (AD) befähigten Mikroorganismus in Kulturmedien, die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthalten, bei Temperaturen in dem Bereich von 200C bis 45°C für eine Dauer von 24 Stunden bis 192 Stunden bei pH-Werten von pH 6 bis pH 8 unter Bedingungen fermentiert wird, wobei dem Fermentationsansatz von Beginn an oder nach einem Intervall bis zu 48 Stunden ein Adsorber vom Typ eines organischen Polymeren, der neben aromatischen Gruppen polare Gruppen, vorzugsweise Acrylsäurederivat-Gruppen, enthält, in einem Mengenverhältnis von 2g/l bis 200g/l zugesetzt, dieser nach Beendigung der Fermentation von der Fermentationslösung abgetrennt, das Produktgemisch dann durch Behandeln des Adsorbers mit organischen Lösungsmitteln eluiert und durch an sich bekannte Verfahrensschritte gereinigt wird.
- 2: Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der eingesetzte Mikroorganismus aus der Gattung Mycobacterium gewählt wird.
- 3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß der eingesetzte Mikroorganismus aus der Art Mycobacterium vaccae gewählt wird.
- 4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß zur Herstellung von AD Mycobacterium vaccae NRRL B-3805 bzw. zur Herstellung von ADD Mycobacterium vaccae NRRL B-3683 gewählt wird.
- 5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß für die Sterol-Tensid-Präparation vorzugsweise Tenside aus der Gruppe der PEO-PPO-Blockcopolymeren mit einem Polypropylenglycol-Anteil von 30% bis 70% und mit Molekulargewichten von 1000 bis 3500 (Tenside der Gruppe A) oder aus der Gruppe der PEO-PPO-Addukte des N,N"-Tetra-(oxypropy!propyol)-N'-(2-oxypropyl)-diethylentriamins mit Molekulargewichten des Polypropylenglycols von 1400 bis 2000 (Tenside der Gruppe B) zum Einsatz gelangen.
- 6. Verfahren nach Punkt 1 und Punkt 5, gekennzeichnet dadurch, daß das Sterol in Form einer Präparation mit dem Tensid entweder mit dem Kulturmedium zusammen autoklaviert oder zum Zeitpunkt der Beimpfung der Hauptkultur oder portionsweise im Zeitraum bis zu 48 Stunden oder kontinuierlich nach Beimpfung der Hauptkultur steril zugegeben wird.
- 7. Verfahren nach Punkt 1,5 und 6, gekennzeichnet dadurch, daß vorzugsweise Adsorber vom Typ der Acrylsäurederivate, insbesondere Acrylsäureester-, Acrylsäure- oder Acrylnitril-Gruppen enthaltenden Copolymerisate aus Ethylvinylbenzen und Divinylbenzen eingesetzt werden (Adsorber der Typen I bzw. II).
- 8. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Fermentation in Rührfermentoren oder in Fermentoren, die nach dem Air-Iift-Prinzip arbeiten, z. B. in Schlaufenreaktoren, durchgeführt wird.Anwendungsgebiet der ErfindungDie Erfindung betrifft eine Verfahren zur Herstellung von 1,4-Androstadien-3,17-dion und 4-Androsten-3,17-dion durch mikrobielle Transformation von Sterolen. Beide Verbindungen, als Intermediärverbindungen des Sterolabbaues bekannt, sind Schlüsselprodukte für die Herstellung von Steroidwirkstoffen. Durch bekannte Synthesen können die Produkte sowohl in die pharmazeutisch wertvollen Derivate der Androstan- und Pregnan- als auch der Estranreihe mit einem großen Anwendungsbereich überführt werden. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit vorzugsweise in der pharmazeutischen Industrie.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD26643384A DD248143B1 (de) | 1984-08-20 | 1984-08-20 | Verfahren zur herstellung von produktionsgemischen mit 1,4-androstadien-3,17-dion sowie 4-androsten-3,17-dion |
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| DD26643384A DD248143B1 (de) | 1984-08-20 | 1984-08-20 | Verfahren zur herstellung von produktionsgemischen mit 1,4-androstadien-3,17-dion sowie 4-androsten-3,17-dion |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD248143A1 true DD248143A1 (de) | 1987-07-29 |
| DD248143B1 DD248143B1 (de) | 1991-01-03 |
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ID=5559764
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD248143B1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999049075A1 (en) * | 1998-03-26 | 1999-09-30 | Forbes Medi-Tech Inc. | Process for the microbial conversion of phytosterols to androstenedione and androstadienedione |
-
1984
- 1984-08-20 DD DD26643384A patent/DD248143B1/de not_active IP Right Cessation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999049075A1 (en) * | 1998-03-26 | 1999-09-30 | Forbes Medi-Tech Inc. | Process for the microbial conversion of phytosterols to androstenedione and androstadienedione |
Also Published As
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|---|---|
| DD248143B1 (de) | 1991-01-03 |
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