DD249921A1 - Verfahren zur herstellung immonilisierter enzyme an silikatischen traegermaterialien - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Enzym-Traeger-Komplexen auf der Basis von silicatischen Materialien. Die Erfindung hat das Ziel, in einem einfachen und praktikablen Verfahren mit geringen finanziellen und apparativen Aufwendungen kostenguenstige Enzym-Traeger-Komplexe herzustellen, die hochwirksam sind und die fuer eine Vielzahl enzymtechnischer Verfahren universell eingesetzt werden koennen. Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Immobilisierung von nativen Enzymen an feste silicatische Traeger zu entwickeln, wobei die resultierenden Enzym-Traeger-Komplexe eine hohe Gesamtaktivitaet haben, eine hohe operationale Stabilitaet aufweisen, eine gegenueber den ueblichen silicatischen Traegern gesteigerte Abriebfestigkeit sowie eine verbesserte hydrolytische Bestaendigkeit besitzen und darueber hinaus durch eine guenstige aeussere Form hydrodynamisch vorteilhafte Eigenschaften zeigen. Die Aufgabe wurde dadurch geloest, dass Enzyme an Formkoerper, wie Granulate beliebiger Gestalt, Platten, Hohlkoerper, Staebe oder Rohre, Hohlfasern sowie Pellets, die aus einer hochgefuellten poroesen thermoplastischen Formmasse hergestellt werden, bestehend aus einem homogenen Gemisch:a) 10...80 Ma.-% eines poroesen silicatischen Fuellstoffes, bevorzugt poroese Glaeser, mit definierter Hohlraumstruktur, wie enge Porengroessenverteilung in einem Bereich von 0,6...1 000 nm, bevorzugt zwischen 20 und 100 nm, Porenvolumen von mindestens 0,15 cm3/g und einer Oberflaeche groesser als 10 m2/g, dessen Oberflaeche gegebenenfalls mit reaktionsfaehigen funktionellen Gruppen in bekannter Weise derivatisiert wird und dessen Poren mit einer extrahierbaren Verbindung, bevorzugt Polyethylenglykol bzw. Polyethylenoxid, gefuellt wurden,b) 20...90 Ma.-% eines thermoplastischen Polymeren,c) 30...50 Ma.-% eines Weichmachers und/oder Loesungsmittelsd) uebliche Zusaetze in ueblichen Konzentrationen,das einer Extraktion in waessrigen oder nicht mit Wasser mischbaren organischen Loesungsmitteln bei Temperaturen unterhalb des Siedepunktes der Extraktionsmittel unterworfen wird, fixiert werden.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Enzym-Träger-Komplexen durch die Fixierung von mikrobiellen, pflanzlichen und tierischen Enzymen an silicatischen Trägermaterialien.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Verfahren zur enzymatischen Stoffwandlung finden in der Lebensmittelindustrie, der pharmazeutischen Industrie, der Chemieindustrie, der Getränkeindustrie sowie der Landwirtschaft und in der Medizin bei der Lösung bzw. Bearbeitung industrieller und wissenschaftlicher Aufgabenstellungen zunehmende Beachtung und Anwendung. Der Einsatz von Enzymen erfolgt überwiegend in nativer Form. Damit ist jedoch die Notwendigkeit der Entfernung des Enzymsaus den umgesetzten Substraten bzw. den erhaltenen Produkten verbunden. Aus dieser Verfahrensweise, die in der Regel eines Inaktivierung des Enzymes beinhaltet, resultiert die einmalige Verwendung des nativen Enzyms. Durch Immobilisierung von nativen Enzymen an inerte Trägermaterialien kann man Enzyme mehrfach nutzen und durch die Reduzierung des spezifischen Enzymverbrauches die Verfahrenskosten senken.

Mit dem Einsatz im mobilierter Enzyme eröffnen sich weitere Möglichkeiten zur Verbesserung der technischen Reaktionsführung bei entsprechenden enzymatisch katalysierten Verfahren, z. B. durch eine kontinuierliche Verfahrensgestaltung, differenzierte Temperaturführung usw.

Die chemische Zusammensetzung, äußere Form und physikalisch-chemische Eigenschaften des jeweiligen Trägermaterials sowie die Wechselwirkung Träger-Enzym und die daraus resultierende veränderte Enzymkinetik limitieren die Möglichkeiten zur Optimierung der technischen Reaktionsführung und sind bestimmend für die technisch-ökonomische Effizienz von Verfahren mit enzymatischer Stoffwandlung.

Als Trägermaterialien oder Matrizes für Enzyme ist eine große Zahl natürlicher, organischer oder anorganischer Materialien engesetzt worden (Gutcho, S. J.: Immobilized Enzymes Preparation and Engineering Techniques. Noyes Data Corporation, Park Ridge, N. Y. 1975).

Die natürlichen Trägermaterialien (Polysaccharide, Proteine) und auch organische Träger auf der Basis synthetischer Polymere besitzen besonders im Hinblick auf einen technischen Einsatz bedeutende Nachteile. Sie sind mikrobiell leicht angreifbar, schlecht oder gar nicht regenerierbar und ihre hydrodynamischen Eigenschaften in gepackten Reaktoren sind schlecht. Aus diesen Gründen wird bei neueren Entwicklungen oft anorganischen Trägern der Vorzug gegeben.

Aus der großen Zahl der möglichen anorganischen Träger für Enzyme heben sich deutlich die silicatischen Materialien heraus, die in Form von Kieselgelen, Gläsern, porösen Gläsern und SiO₂-Keramiken in bezug auf ihre Trägerfunktion optimiert wurden (Eaton, D. L.: The Physica-Chemical Properties of Siliceous Enzyme Supports and Their Effects on Composite Performace.

Midland Macromolecular Symp. on Silylated Surfaces, Midland, Mich., 1978, S.201).

Während Fällungskieselsäuren und natürlichen Kieselguren der Nachteil einer zu geringen Bindungskapazität für Proteine anhaftet, sind Silica-Xerogele bekanntermaßen nicht abriebfest. Solche Träger für immobilisierte Enzyme können daher nicht zur Durchführung verfahrenstechnischer Aufgaben in Rührreaktoren verwendet werden. Darüber hinaus ist Kieselgel relativ spröde und wenig druckfest, insbesondere dann, wenn die notwendige makroporöse Textur bei der Synthese eingestellt wird, so daß auch die Verwendung in Festbettreaktoren nicht möglich ist. Bekannt ist weiterhin ein Verfahren zur Bindung von Enzymen, wie z. B. Glucoamylase an poröse Keramiken. Diese Keramiken, die überwiegend aus S1O2 bestehen, werden durch thermische Sinterung von silicatischen Ausgangsmaterialien hergestellt. Die Herstellung einer Sinterkeramik mit definierter makroporöser Struktur erfordert einen relativ hohen Aufwand, so daß die Trägerkosten die Ökonomie der Herstellung und Anwendung von Enzym-Träger-Komplexen eingeschränkt wird.

Weiter ist bekannt, daß poröse Gläser und insbesondere makroporäse Gläser zur Bindung von Enzymen in vorteilhafter Weise geeignet sind. Nachteilig wirkt sich bei dem technischen Einsatz entsprechender Enzym-poröses Glas-Komplex die begrenzte hydrolytische Stabilität von SiGvMaterialien in wäßrigen Medien aus. Die Hydrolyse der Träger, d. h., die Ablösung von SiO₂, bedeutet gleichzeitig eine Ablösung der fixierten Enzyme — also Aktivitätsverlust —; der hydrolytische Angriff erfolgt, wie allgemein bekannt ist, besonders bei pH-Werten oberhalb 7 (Weetall, H.H. et. al. in: Weetall, H.H., Suzuki, I. [Herausgeber] Immobilized Enzymes Technology. Plenum Press, New York 1975). Außerdem sind poröse Gläser wegen der verschiedenen Teilprozesse umfassenden aufwendigen Herstellung verhältnismäßig teuer, so daß dadurch der technische Einsatz auf Grenzen stößt.

Insgesamt gesehen bestehen die Nachteile silicatischer, d.h. SiCyhaltiger Träger vor allem in der geringen mechanischen Stabilität, der eingeschränkten hydrolytischen Stabilität sowie der zumeist sehr geringen Partikelgröße.

Nach dem US-PS 4.102.746 und 4.169.014 werden Enzyme an feinverteilte mikroporöse Fällungskieselsäuren, die in einer Polymermatrix verteilt sind, gebunden und in Form von dünnen Scheiben eingesetzt.

Die Porenverteilung der porösen Polymermatrix ist unspezifisch und liegt in einem Porengrößenbereich von 0,01... 100 (im.

Die Porosität bzw. das Porensystem der Polymermembranen oder der thermoplastischen porösen Formmassen wird durch die Zwischenräume der Füllstoffteilchen, durch die Grenzschicht zwischen den Füllstoffteilchen und der Polymermatrix sowie durch die nach der Entfernung von Weichmachern oder Lösungsmitteln entstehenden Hohlräumen in dem entsprechenden Polymeren (US-PS 3.351.495,4.169.014) gebildet.

Für die unterschiedlichen Einsatzgebiete der porösen thermoplastischen Formmassen, wie z. B. als Batterieseparatoren, semipermeable Membranen und vor allem als Träger für Enzyme, ist es ein Nachteil der porösen Materialien, wenn eine unspezifische Porenverteilung, d.h. über einen großen Porengrößenbereich vorliegt. .

Es ist besonders wichtig, in porösen thermoplastischen Polymeren, die SiO₂-Füllstoffe enthalten, an denen biologisch aktive Materialien wie Enzyme fixiert werden sollen, definierte Hohlraumsysteme mit Makroporen und hohen spezifischen Oberflächen einzusetzten.

Die bisher eingesetzten Fällungskieselsäuren oder SiO2-Hydrogele erfüllen diese Anforderungen nach hohen Oberflächen, großen Porenvolumen und definierten Porengrößen nicht.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, in einem einfachen und praktikablen Verfahren mit geringen finanziellen und apparativen Aufwendungen kostengünstige Enzym-Träger-Komplexe herzustellen, die hochwirksam sind und die für eine Vielzahl enzymtechnischer Verfahren universell eingesetzt werden können und bei ihrer Anwendung in vielfältiger Weise zur Minimierung der Gesamtkosten einschließlich der hergestellten Zwischen- und Endprodukte beitragen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Immobilisierung von nativen Enzymen an feste silicatische Trägermaterialien zu entwickeln, wobei die resultierenden Enzym-Träger-Komplexe eine hohe Gesamtaktivität haben, eine hohe operationale Stabilität aufweisen, eine gegenüber den üblichen silicatischen Trägern gesteigerte Abriebfestigkeit sowie eine verbesserte hydrolytische Beständigkeit besitzen und darüber hinaus durch eine günstige äußere Form hydrodynamisch vorteilhafte Eigenschaften zeigen.

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß Enzyme an Formkörpern, wie Granulate beliebiger Gestalt, Platten, Hohlkörper, Stäbe oder Rohre, Hohlfasern sowie Pellets, die aus einer hochgefüllten porösen thermoplastischen Formmasse hergestellt werden, bestehend aus einem homogenen Gemisch:

a) 1O...80Ma.-% eines porösen silicatischen Füllstoffes, bevorzugt poröse Gläser mit definierter Hohlraumstruktur, wie enge Porengrößenverteilung in einem Bereich von 0,6... 1 OOOnm, bevorzugt zwischen 20 und 100nm, Porenvolumen von mindestens 0,15cm³/g und einer Oberfläche größer als 10m²/g, dessen Oberfläche gegebenenfalls mit reaktionsfähigen, funtionellen Gruppen in bekannter Weise derivatisiert wird und deren Poren mit einer extrahierbaren Verbindung, bevorzugt Polyethylenglykol bzw. Polyethylenoxid, gefüllt wurden,

b) 2O...9OMa.-% eines thermoplastischen Polymeres,

c) 30...50Ma.-% eines Weichmachers und/oder Lösungsmittels

d) übliche Zusätze in üblichen Konzentrationen,

das einer Extraktion in wäßrigen oder nicht mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln bei Temperaturen unterhalb des Siedepunktes der Extraktionsmittel unterworfen wird, fixiert werden.

Unter Formmassen werden ungeformte oder geformte Massen verstanden, die nach bekannten Verfahren unter spanlosem Formen innerhalb bestimmter Temperaturbereiche zu geformten Formteilen verarbeitet werden können.

Im Rahmen der erfindungsgemäßen Lösung stellen hochgefüllte poröse Formmassen homogene Gemische aus thermoplastischen Kunststoffen, silicatischen Füllstoffen, bevorzugt makroporöse Gläser, deren Oberflächen gegebenenfalls mit geeigneten Liganden derivatisiert werden, Weichmachern und/oder Lösungsmitteln und gegebenenfalls üblichen Zusätzen dar, aus denen nach derthermoplastischen Verformung Weichmacher und/oder Lösungsmittel extrahiert werden.

Die Mischungskomponente a) besteht aus einem porösen Si0₂-Füllstoff mit definierter Hohlraumstruktur, bevorzugt kugelförmige poröse Gläser mit einem Teiichengrößenbereich zwischen 0,1 ...500 μιτι.

Poröse Gläser sind in besonderer Weise zur Adsorption, Anreicherung, Trennung und Immobilisierung von biologisch aktiven Verbindungen bzw. Bio-Polymeren (Haller, W. in: Solid Phase Biochemistry — Analytical and Chemical Aspects, W. H. Scouten [Ed.], Wiley, J., New York 1983, S. 535) geeignet.

Poröse Gläser bzw. insbesondere makroporöse Gläser, die durch Silanisierung mit bifunktionellen Organosilanen, wiez. B. y-Aminopropyltriethoxysilan oder -y-Glycidoxypropyltriemethoxysilan^unktionalisiert wurden, bilden den Ausgangspunkt für zahlreiche bichemische Oberflächenreaktionen, die für die Festphasen-Biochemie charakteristisch sind, wie z. B. die Immobilisierung von Enzymen, die Synthese von Peptiden, Polynucleotiden oder Polysacchariden sowie anderen Bio-Polymeren, die der Fixierung oder Abbau- bzw. Aufbaureaktionen unterworfen werden.

Bedingt durch diese spezifischen Eigenschaften, die sie von allen anderen porösen SiO₂-Materialien unterscheiden und durch die Möglichkeit des Einsatzes sphärischer Teilchen, sind poröse Gläser besonders zur Herstellung hochgefüllter poröser thermoplastischer Formmassen geeignet.

Poröse Gläser, die erfindungsgemäß eingesetzt werden, sind Extraktionsprodukte der Alkaliborosilicatgläser, die zur Phasentrennung in einer natriumboratreiche und eine SiO₂-reiche Phase fähig sind, und die mit geeigneten Extraktionsmitteln, wie z. B. Wasser, Säuren, Salzlösungen oder Alkohlen extrahiert werden können, so daß ein poröses SiGyGerüst mit definierter Hohlraumstruktur übrig bleibt.

Die Zusammensetzungsbereiche für Alkaliborosilicatgläser, die zu einer derartigen Phasentrennung geeignet sind, werden durch die in US 2.221.709, 2.106.744 sowie 3.923.688 angegebenen Zusammensetzungen der Ausgangsgläser charakterisiert und umfassen Ausgangsglaszusammensetzungen mit 5O...7OMa.-% SiO₂,15...40Ma.-% B₂0₃und 3... 10Ma.-% Alkalioxid. Die Hohlraumstruktur poröser Gläser, gekennzeichnet durch die Parameter Porengröße und^orengrößenverteilung sowie Oberfläche und Porenvolumen, ist von den Herstellungsparametern poröser Gläser abhängig und in weiten Grenzen variabel. Eine Übersicht der für die erfindungsgemäßen hochgefüllten porösen thermoplastsichen Formmassen einsetzbaren porösen Gläser ist in Janowski, F., Heyer, W.: Poröse Gläser-Herstellung, Charakterisierung und Anwendung, Leipzig, VEB Deutscher Verlag für Grundstoffindustrie, 1982, gegeben.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Lösung besteht in der Verwendung poröser Gläser in Kugelform als Mischungskomponente a).

Die Herstellung sphärischer abriebfester poröser Gläser ist in den DD-WP B01 J/264438, 264439 sowie C03B/259554 beschrieben.

Kugelförmige poröse Gläser weisen gegenüber solchen in Granulatform insbesondere hydrodynamische und wie allgemein "bekannt ist, rheologische Vorteile bei der Herstellung hochgefüllter thermoplastischer Formmassen auf. Es ist daherfür die erfindungsgemäße Lösung kennzeichnend, daß sphärische poröse Gläser mit den allgemein bekannten engen Porengrößenverteilungen im Bereich zwischen 0,6... 1 OOOnm je nach der gewünschten Porengröße als Mischungskomponente a) eingesetzt werden.

Es ist weiter für die erfindungsgemäße Lösung kennzeichnend, daß die eingesetzten porösen Gläser.in funktionalisierter Form, wie z.B. mit Amino-, Epoxy- oder Mercaptogruppen, als Mischungskomponente a) eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäß resultierenden Formkörper auf der Basis hochgefüllter thermoplastischer poröser Formmassen sind dann direkt für die Fixierung biospezifischer Liganden bzw. für festphasenbiochemische Reaktionen einzusetzen. Grundsätzlich.können im Sinne der erfindungsgemäßen Lösung auch andere makroporöse silicatische Materialien, wie Kieselgele, Sinterkermiken oder Gläser, die die Texturanforderungen in den angegebenen Grenzen erfüllen und deren Oberfläche einer Aktivierung durch Derivatisierung zugänglich ist als Füllstoffe für die hochgefüilten porösen thermoplastischen Formmassen verwendet werden.

Eine besondere ökonomische Form der erfindungsgemäßen Lösung ist daher der Einsatz makroporöser Si0₂-Xerogele als Füllstoffkomponente. Dabei ist die Anwendung von Kieselgelen mit Porengrößen oberhalb 20nm und Porenvolumen oberhalb 0,6cm³/g besonders geeignet.

Die Mischungskomponente b) besteht aus thermoplastischen Kunststoffen, bevorzugt aus Polyolefinen oder Polyvinylchlorid bzw. den entsprechenden Copolymeren oder auch Polymermischungen.

Die Mischungskomponente c) besteht aus einem Weichmacher und/oder Lösungsmittel; wobei diese Komponenten entweder in wäßrigen oder in organischen Lösungsmitteln löslich sein müssen, damit die Extrahierbarkeit aus der Formmasse gewährleistet ist.

Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Lösung besteht darin, Polyethylenglykolebzw. Polyethylenoxide als Weichmacher einzusetzen. Dabei kann ein Teil des Weichmachers zur Füllung des Porenvolumens des Füllstoffes bzw. der porösen Gläser verwendet werden, um das Eindringen der thermoplastischen Polymeren während der Verformumg zu verhindern bzw. funktioneile Oberflächengruppen zu schonen. Dazu werden zweckmäßigerweise niedermolekulare Polyethylenglykole (Molmassen zwischen 300... 800), die flüssig sind, eingesetzt. Der andere Teil des Weichmachers besteht aus festem Polyethylenoxid mit Molmassen oberhalb 1 000, bevorzugt 4000.

Neben dem bevorzugten Polyethylenglykol als Weichmacher bzw. wäßrig extrahierbarer Komponente, können als wasserlösliche Weichmacher auch Ethylenglykol, Polypropylenglykol, Glycerin und seine Ester, Alkylphosphate sowie Polyvinylalkohol oder Polyacrylsäure eingesetzt werden.

Für eine Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, die nicht mit Wasser mischbar sind, eignet sich der Einsatz von Weichmachern auf der Basis der Ester organischer Säuren, wie z. B. Phthalate, Sebacate, Adipate oder Stearate sowie Wachse, Paraffine, Kohlenwasserstoffe, Öle oder niedermolekulare Polymere.

Die Mischungskomponente d) enthält bzw. kann gegebenenfalls enthalten übliche Zusätze für thermoplastische Formmassen, wie Verarbeitungshilfsmittel, Polymerstabilisatoren, Farbstoffe, Flammschutzmittel, bakteriostatische oder bakteriozide Mittel und gegebenenfalls Treibmittel, in üblichen Konzentrationen.

Die Herstellung einer homogenen Mischung der einzelnen Komponenten erfolgt in bekannter Weise nach bekannten Techniken. Desgleichen erfolgt die thermoplastische Verformung bzw. Verarbeitung der Mischungen der Komponenten nach bekannten Prozessen durch Extrusion, Calandrieren, Spritzgießen oder Pressen.

Anschließend werden die erhaltenen hochgefüllten Formmassen einer Extraktion mit Wasser im Falle der Verwendung wasserlöslicher Weichmacher oder in organischen Lösungsmitteln im Falle der Verwendung nicht in Wassser löslicher Weichmacher, wobei chlorsubstituierte Kohlenwasserstoffe bevorzugt werden, unterworfen.

-4- 24a SZl

Die Extraktion mit Wasser erfolgt zweckmäßigerweise bei 293... 343 K zwischen 1 ...20 Stunden, während die Extraktion mit organischen Lösungsmitteln unterhalb des Siedepunktes derselben, bevorzugt unterhalb 323K, zwischen 0,5 und 10 Stunden erfolgt.

Die erfindungsgemäß hergestellten hochgefüllten porösen Formkörper können, wenn nicht bereits derivatisierte Füllstoffe eingesetzt wurden, mit den bekannten Agenzien, wie Organosilanen, aktiviert werden, so daß eine direkte oder indirekte Kopplung mit Enzymen nach bekannten Verfahren erfolgen kann.

Eine besonders bevorzugte Variante für die Enzymkopplung ist die kovalente Bindung mit Glutardialdehyd über die mit-y-Aminopropyltriethoxysilanen derivatisierten porösen Formkörper.

Es ist für die erfindungsgemäße Lösung kennzeichnend, daß die Formkörper aus der hochgefüllten porösen thermoplastischen.

Formmasse wie reine disperse SiO₂-Materialien bei der Derivatisierung der Oberfläche oder der kovalenten Enzymbindung behandelt werden können.

An die erfindungsgemäß vorbereiteten Formkörper auf der Basis einer hochgefüllten porösen thermoplastischen Formmasse kann man ein breites Enzymspektrum aus der Gruppe der Hydrolasen, Lipasen, Racemasen u.a. fixieren. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders für die Kopplung industriell wichtiger Enzyme, wie Glucosidasen, Proteasen und Isomerasen geeignet.

Auf der Grundlage der erfindungsgemäßen Lösung können mit den hochgefüllten porösen thermoplastischen Form körpern, die im wesentlichen aus silicatischen Trägern bzw. Füllstoffen, wie porösen Gläsern oder makroporösen SiGvXerogelen mit definierten Hohlraumsystemen bestehen, immobilisierte Enzyme hergestellt werden, deren Eisatzform verfahrenstechnischen Parametern optimal angepaßt werden kann.

Mit der Entwicklung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine neue Technik zur Herstellu ng und Applikation immobilisierter Enzyme geschaffen. Durch die erfindungsgemäßen Formkörper werden die Vorzüge silicatischer Träger für Enzyme wirksam, während gleichzeitig durch die thermoplastische polymere Matrix die Nachteile von SiGvMaterialien, wie limitierte hydrolytische Stabilität und geringe Abriebfestigkeit, aufgehoben bzw. signifikant eingeschränkt werden.

Diese Eigenschaften verleihen dem neuen Verbundträger universelle Eigenschaften. Da der neue Träger in beliebiger Gestalt und Ausführungsform herstellbar und da er nicht hydrodynamisch limitiert ist, kann er in verschiedensterweise eingesetzt werden.

Die Herstellung der Formkörper als Enzymträger ist realtiv einfach und kann nach bekannten technischen Verfahren erfolgen. Die Rohstoffe bzw. Ausgangsmaterialien sind preiswert verfügbar.

Von besonderer ökonomischer Bedeutung ist, daß der erschöpfte Enzym-Verbundträger, hergestellt nach einer erfindungsgemäßen Ausführungsform, regeneriert werden kann, d.h., er ist in mehreren Regenerations- und Einsatzzyklen zu nutzen. Damit lassen sich die Trägerkosten bei Verfahren, die den Einsatz immobilisierter Enzyme beinhalten, drastisch senken.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

33g eines lufttrockenen, sphärischen porösen Glases mit einem Teilchendurchmesser von 0,1 ...0,3 mm, hergestellt gemäß WP B01J/269438 mit einem Porendurchmesser von 50nm, einem Porenvolumen von 0,5cm³/g und einer Oberfläche von 80m²/g, werden mit 200 ml einer 10%igen wäßrigen Lösung von -Aminopropyltriethoxysilan, deren pH-Wert auf 3,5 eingestellt wurde, 6 Stunden unter Rühren auf 323 K erhitzt, danach abfiltriert und mehrmals mit Wasser und anschließend mit 50 ml Aceton gewaschen. Nachfolgend wird das erhaltene derivatisierte poröse Glas 2,5 Stunden bei 393K im Trockenschrank getrocknet. Danach werden zu dem Aminopropylglas 11g Polyethylenglykol 800 gegeben. Nach dem Aufsaugen des flüssigen Glykols wird in einem Mischer das mit Polyethylenglykol belandene poröse Glas mit 12g Polyethylenpulver (PE-HD : MFI₄₆3_Ki6kp = 19g/ 10min) sowie 10g weiterem Polyethylenoxid 4000 zu einer homogenen Mischung verarbeitet.

Die hergestellte Mischung wird dann in einem BRABENDER-Plastographen bei 433 K mit 30 U/min für 10 Minuten compoundiert. Das compoundierte Material wird anschließend bei 433K in Wasser extrahiert. Die anschließendeTrocknung erfolgt bei 373K. Als Resultat werden poröse Platten erhalten, die zu 73% aus porösem Glas bestehen. Die mit Hilfe eines Quecksilberporosimeters ermittelte Poren verteil u ng der porösen Platten weist bei 50 η mein scha rf es Maximum aus, während im Bereich von 0,1... 100/xm eine breite unspezifische Porenverteilung auftritt.

Die Beladungsdichte mit Aminopropy!gruppen wurde nach der Chloridtitrationsmethode — nach CCY. LEE und G. M. LONDON: Anal. Biochem. 94 (1979) S.60...64 — mit 80/xmol/g bestimmt.

Das erhaltene poröse Material kann in dieser Form aufbewahrt werden oder zur kovalenten Bindung von biologisch aktiven Materialien, wie z. B. Enzyme, eingesetzt werden.

Beispiel 2

1 kg Kieselgel mit der Teilchengröße 0,1 ...0,4 mm und einem Porendurchmesser von 20 nm, einer Oberfläche von 260m²/g sowie einem Porenvolumen von 0,8cm³/g werden mit 0,360kg Polyelthylenpulver (PE-HD : MFUe3K.5kp = 19g/10min) und 0,750kg Polyethylenglykol 4000 in einem 101 Intensivmischer 5 Minuten bei einer Drehzahl von 2300U/min gemischt. Das erhaltene Mischgut wird anschließend auf einem Einschneckenextruder (020 mm; L/D = 20) bei Zylindertemperatur von 408...413 K über eine 3 mm Runddüse zur Strängen extrudiert, die auf einem Transportband einem Schneidgranulator zugeführt werden. Das erhaltene Zylindergranualt hat eine Abmessung von 3 χ 3mm.

Ein Teil des erhaltenen Granulats wird auf einem Extruder vom Typ UP 30 (030 mm; L/D = 14) bei Temperaturen von 403... 413 K über eine Ringdüse zu Rohren mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Wanddicke von 2 mm verarbeitet. Mit diesen Parametern werden glatte, gut kalibierte mattglänzende Rohre erhalten. Ein anderer Teil des Granulats wird auf einer Spritzgießmaschine vom Typ Monomat bei Temperaturen von 413...433Kzu Platten der Größe 150 χ 150 χ 1 mm verspritzt. Die hergestellten Formkörper, die aus Granulat, Rohren und Platten bestehen, werden mit Wasser bei 343K im Verlauf von 25 Stunden extrahiert und anschließend bei 363 K getrocknet.

Die Derivatisierung mit -Aminopropyltriethoxysilan der hergestellten hochporösen Formkörper kann in bekannter Weise mit einer 10%igen Lösung des Si I a ns in Wasser bei einem pH-Wert zwischen 2 und 5 bei 323...373Kdurch eine mehrstündige entsprechende Behandlung erfolgen

Die nach Beispiel 1 ermittelte Aminopropylgruppen-Kapazität beträgt 94/xmol/g.

Beispiel 3

Wie in Beispiel 2 beschriebe^werden 1,2 kg eines porösen Glases nach Beispiel 1 mit 0,436kg PE-HD-Pulver (MFl = 2 g/min) und 1,018 kg Polyethylenglykol 4000 in einem 10-1-1 ntensivmischer gemischt.

Die Mischung wird anschließend auf einem Doppelschneckenextruder vom Typ ZSK30 (030 mm; L/D = 25) bei Temperaturen von 408...418K zu Strängen extrudiert und wie in Beispiel 2 beschrieben granuliert.

Aus dem erhaltenen Zylindergranulat werden auf einer Spritzgießmaschine vom Typ Monomat bei Temperaturen von 423...443K Platten der Größe 150 χ 150 χ 1 mm gespritzt.

Granulat und Platten werden gemäß Beispiel 2 zu porösen Formkörpern durch eine Heißwasserbehandlung extrahiert.

Die Aktivierung bzw. Derivatisierung mit-Aminopropylsilan kann gemäß Beispiel 1 und 2 durchgeführt werden. !

Die gemäß Beispiel 1 und 2 ermittelte Aminopropylgruppen-Kapazität beträgt 110/xmol/g. :

Beispiel 4

100g eines nach Beispiel 1 ...3 erhaltenen aminogruppenhaltigen Formkörpers oder eines Granulates werden mit 250cm³ einer 3%igen Glutardialdhydlösung in 0,15 molaren Phosphatpuffer, pH6,5, versetzt und 5 Stunden bei 308Kgehalten.

Dabei wird das Gemisch gerührt, wobei die Formkörper oder das Granulat eine rötliche Farbe annehmen.

Nach der Reaktion wird überschüssiger Glutardialdehyd mit 0,05 molarem Phosphatpuffer, pH 6,5, ausgewaschen.

Die Formkörper oder das Granulat werden nun mit 125cm³ einer gepufferten (0,2 molarer Phosphatpuffer, pH 6,5) Lösung von Glucoamylase (Aspergillus n.), deren Proteingehalt 3 mg/cm³ beträgt, versetzt.

Das Gemisch wird 4 Stunden bei 308K gerührt. Nach der Bindung des Enzyms an die Formkörper oder das Granulat wird überschüssiges Protein mit Puffer ausgewaschen und der hergestellte Enzym-Träger-Komplex in Pufferlösung (0,05 molarer Phosphatpuffer, pH 6,5) auf bewahrt.

Beispiel 5

Zur Charakerisierung der Aktivität eines nach Beispiel 4 hergestellten Enzym-Träger-Komplexes auf der Basis des gemäß Beispiel 2 erhaltenen Granulates (Teilchengröße 2...5 mm) und Glucoamylase (Aspergillus niger) werden 5 ml (2,5g) mit 115cm³ eines 30%igen Maisstärkehydrolysates (säureverflüssigt, DE-Wert30%, Dichte 1,13) in einem 500cm³ Dreihalskolben bei 323K intensiv gerührt.

Jeweils nach einer Stunde wird eine kleine Probe zur DE-Wert-Bestimmung (Glucoseoxidase/Peroxidase) entnommen. Folgende DEzWerte wurden gemessen:

Zeit in Stunden	DE-Wertin%
0	35
1	62
2	74
3	82
5	90
6	94
8	95

Nach 10 Stunden wurde das Substrat vom Enzym-Träger-Komplex abgetrennt und durch frisches Substrat ersetzt. Die gefundenen DE-Werte in Abhängigkeit von der Zeit wurden mehrmals reproduziert.

Beispiel 6

Zum Nachweis der verbesserten hydrolytischen Stabilität der erfindungsgemäßen Träger auf der Basis silicatischer poröser Füllstoffe wurden jeweils Formkörper, hergestellt nach Beispiel i, jedoch ohne vorherige Derivatisierung des Füllstoffes mit -Aminopropyltriethoxysilan, mit einem Gewicht von 3,0g an einem Rührer befestigt und bei 298K in einem Volumen von 2I Wasser, dessen pH-Wert auf 4 bzw. 9 mit HCI bzw. NaOH eingestellt wurde, für 77 Stunden gerührt. Die pH-kontrollierten Wasservolumina wurden jeweils nach 6 Stunden erneuert.

Danach wurden die Formkörper-Platten (Dicke 1 mm) bei 373 K für 2 Stunden getrocknet und der Gewichtsverlust wurde gravimetrisch ermittelt.

Zum Vergleich wurde dieselbe Prozedur mit einem makroporösen kugelförmigen Glas (Oberfläche 35m²/g, Porendurchmesser 50 nm) — dem silicatischen Füllstoff, der zur Herstellung der Formkörper nach Beispiel 1 eingesetzt wurde, wiederholt. Dabei befanden sich 1,5g poröses Glas in einem am Rührer befestigten Nylonnetz. Die Teilchengröße betrug 1 ...0,2 mm. Die Gewichtsdifferenz wurde ebenfalls nach einer Rührzeit von 44 Stunden ermittelt.

Nachfolgend sind die ermittelten Gewichtsdifferenzen, die auf eine Ablösung von SiO₂ zurückzuführen sind, angegeben:

Träger Gewichtsverlust in mg/g Träger

pH = 4 pH = 9

PorösesGlas 23 75

Trägernach

Beispiel 1 (Platte) 9 - 16

Die Gewichtsdifferenz der Träger nach Beispiel 1 wurden auf die reine silicatische Komponente (Füllgrad 73%) bezogen. Die geringe Ablöserate der erfindugnsgemäßen Träger, insbesondere im alkalischen Milieu, ist signifikant.

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung immobilisierter Enzyme an silicatischen Trägermaterialien, gekennzeichnet dadurch, daß Enzyme an Formkörper, wie Granulate beliebiger Gestalt, Platten, Hohlkörper, Stäbe oder Rohre, Hohlfasern sowie Pellets, die aus einer hochgefüllten porösen thermoplastischen Formmasse hergestellt werden, bestehend aus einem homogenen Gemisch:

a) 1O...8OMa.-% eines porösen silicatischen Füllstoffes bevorzugt poröse Gläser, mit definierter Hohlraumstruktur wie enge Porengrößenverteilung in einem Bereich von 0,6... 1 OOOnm, bevorzugt zwischen 20 und 100nm, Porenvolumen von mindestens 0,15cm³/g und einer Oberfläche größer als 10m²/g, dessen Oberfläche gegebenenfalls mit reaktionsfähigen funktionellen Gruppen in bekannter Weise derivatisiert wird und dessen Poren mit einer extrahierbaren Verbindung, bevorzugt Polyethylenglykol bzw. Polyethylenoxid, gefüllt werden.

b) 20...90Ma.-% eines thermoplastischen Polymeren

c) 30...50Ma.-% eines Weichmachers und/oder Lösungsmittels

d) übliche Zusätze in üblichen Konzentrationen

das einer Extraktion in wäßrigerodernichtmitWassermischbaren organischen Lösungsmitteln bei Temperaturen unterhalb des Siedepunktes der Extraktionsmittel unterworfen wird, fixiert werden.

2. Verfahren nach Punkt 1., gekennzeichnet dadurch, daß die porösen silicatischen Füllstoffe der Mischungskomponente

a) sphärische poröse Gläser mit Teilchengrößen von 10...300 μπα sind.

3. Verfahren nach Punkt 1., gekennzeichnet dadurch, daß die porösen silicatischen Füllstoffe der Mischungskomponente

a) SiO₂-Xerogele mit Teilchengrößen von 10...300 μΐη sind.