DD250331A1 - Verfahren zur herstellung von phaseolotoxin und n'-phosphosulfamylornithin - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Phaseolotoxin und N-Phosphosulfamylornithin mit immobilisierten und permeabilisierten Bakterienzellen. Grundlage der Erfindung ist der Mikroorganismus Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 6/0, der in immobilisiertem und permeabilisiertem Zustand unter submersen Bedingungen in synthetischen und komplexen Medien Phaseolotoxin und N-Phosphosulfamylornithin produziert. Gegenueber dem Hauptpatent (SCHLUTTIG et al., 1986) wird ein Verfahren beschrieben, welches eine Isolierung und Reinigung beider Verbindungen mit wesentlich geringerem Aufwand an Energie, Material und Arbeitszeit ermoeglicht. Das Verfahren kann diskontinuierlich und kontinuierlich betrieben werden. Bei Durchfuehrung des Verfahrens in kontinuierlichem Betrieb kann mit sehr hoher Verduennungsrate gearbeitet werden. Somit kann die Raum-Zeit-Ausbeute des Verfahrens gesteigert werden. Aufgrund der biologischen Aktivitaet koennen Phaseolotoxin und N-Phosphosulfamylornithin als Herbizide, Enzyminhibitoren, als Wachstumsregulatoren und als Algizide eingesetzt werden.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Phaseolotoxin und N'-Phosphosulfamylornithin mit permeabilsierten und immobilisierten Zellen von Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 6/0. Beide Verbindungen hemmen die Ornithin-Carbamylphosphat-Transferase in mikrowellen, pflanzlichen und tierischen Zellen. Demzufolge können diese beiden Verbindungen für medizinische Zwecke als Enzymhemmer, als Herbizide, als Wachstumsregulatoren und als Insektizide eingesetzt werden. Ebenso kann ein Einsatz als Algizid und Cytostatikum erfolgen.
Bisher sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von Phaseolotoxin und N'-Phosphosulfamylornithin bekannt (MITTCHELL, R. E. [1976]), Phytochemistry 15,1941; MITTCHELL, R. E. [1978], Phys. Plant Pathol. 13,37; RUDOLPH et al. [1978], Arch. Microbiol. 119,291; BUBLITZ, F. und VÖLKSCH, B. [1983], Z. AIIg. Mikrobiol. 23,485). Diese Verfahren haben den Nachteil, daß Phaseolotoxin und N'-Phosphosulfamylornithin in geringen Konzentrationen (1-5mg pro Liter) gebildet werden. SCHLUTTIG, A. et al. (1986) beschreiben im Patent „Verfahren zur mikrowellen Herstellung von Phaseolotoxin und N'-Phosphosulfamylornithin" ein Verfahren, welches wesentlich höhere Ausbeuten an beiden Produkten (bis550mg/l) erbringt.
Das Verfahren von SCHLUTTIG et al. (1986) ist auf Grund der hohen Biomassekonzentration mit einem hohen Aufwand an Energie (Abtrennung der Biomasse vom Produkt), Material (auf Grund hoher Nebenproduktkonzentrationen werden für die Produktreinigung große Mengen an Trennmaterial benötigt) und Arbeitszeit (das Verfahren kann nur diskontinuierlich betrieben werden, Trenn- und Aufarbeitungsschritte müssen mehrmals durchgeführt werden) belastet. Dieses führte zu dem Ziel der Erfindung, ein Verfahren, das auf der Basis immobilisierter und permeabilisierter Bakterienzellen arbeitet, somit kontinuierlich arbeiten kann und nur vereinfachte Aufarbeitungs- und Reinigungsverfahren für das Produkt benötigt, zu entwickeln.
Das Ziel der Erfindung ist die mikrobielle Herstellung von Phaseolotoxin und N'-Phosphosulfamylornithin in einem Verfahren, das kontinuierlich betrieben werden kann und eine energie-, material- und zeitsparende Aufarbeitung und Reinigung der Produkte ermöglicht.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Phaseolotoxin und N'-Phosphosulamylornithin zu beschreiben, das nicht die geschilderten Nachteile im Sinne hoher Nebenproduktkonzentrationen und daraus resultierender energie-, material- und zeitintensiven Isolation der Substanzen hat und zudem kontinuierlich bei hohen Durchflußraten betrieben werden kann. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren gelöst, daß das Bakterium Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 6/0 in immobilisiertem und permeabilisiertem Zustand verwendet. Der Bakterienstamm Pseudomonas syringae pv phaseolicola 6/0 ist in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR für die Hinterlegung von Mikroorganismen bei der Vornahme von Erfindungsanmeldungen unter der Nummer ZIMET 11107 hinterlegt worden.
Der Stamm Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 6/0 wird submers in einer synthetischen Nährlösung bis zu einer Dichte von 0,7 g Biomasse pro Liter bei einerTemperatur unter 220C und einem pH-Wert von 6,8 kultiviert. Bei Verwendung nichtsynthetischer Medien kann der pH-Wert zwischen 6,5 und 7,5 liegen. Das verwendete synthetische Medium hat folgende Zusammensetzung: 5,5g Na2HPO4, 2,6g KH2PO4,1,0g Na2SO4,- 10mg FeSO4 7H20,10mg MnSO4 · 7H20,100mg MgSO4,10g Glycerol, 2,5g NH4CI und 1 g Casaminoacids pro 1 Liter destillierten Wassers.
Die Kultivierung erfolgt in 500ml Standrundkolben mit 100ml Kulturlösung auf einem Rundschüttler mit einer Frequenz von 250 Umdrehungen pro Minute.
Vor Beginn der Immobilisierung werden die Bakterienzellen abzentrifugiert, in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7 resuspendiert und in gekühltem Zustand (40C) bis zur Immobilisierung aufbewahrt. Immobilisierung in Agar Agar: Je 10 ml der Zellsuspension mit entsprechend eingestellter Zelldichte werden mit 50 ml 0,1 M Phosphatpufferlösung pH 7 mit 2% Agar Agar im Eisbäd vermischt. Nach Erstarren des Agarblocks wird dieser zerkleinert, indem er durch ein Sieb mit einer Porengröße von etwa 1mm gedrückt wird. Die dabei entstehenden Partikel haben ein Volumen von etwa 1 mm3.
Die mit dieser Methode immobilisierten Bakterienzellen werden nach dem Waschen mit 1OmM Phosphatpuffer pH 7 in das synthetische Medium gebracht. Das Verhältnis der Volumina des Immobilisierungsgutes zum synthetischen Medium beträgt 1:4. Dem synthetischen Medium sind Zwecke der Permeabilisierung der Bakterienzellen 5-1OmM EDTA zugesetzt. Die Herstellung von Phaseolotoxin und N'-Phosphosulfamylornithin erfolgt durch Inkubation dieses Gemisches bei einer Temperatur zwischen 18 und 22°C über einen Zeitraum von mindestens 24 Stunden bei einem Sauerstoffpartialdruck im Gemisch von mindestens 90%.
Die Herstellung der beiden Produkte kann diskontinuierlich und kontinuierlich erfolgen. Bei kontinuierlichen Betrieb wird das synthetische Medium kontinuierlich mit bestimmter Durchflußrate erneuert und gleichzeitig teilweise verbrauchtes und mit den Produkten angereichertes Medium entfernt.
Nach Beendigung der Inkubation wird die immobilisierte Biomasse durch Absieben oder Dekantieren von der Kulturlösung getrennt und nach BUBLITZ und VÖLKSCH (1983) Phaseolotoxin aus der Kulturflüssigkeit isoliert. N--Phosphosulfamylornithin wird aus Phaseolotoxin durch Behandlung mit Leucinaminopeptidase gewonnen.
Ausführungsbeispiel
An einem Ausführungsbeispiel soll das Verfahren näher erläutert werden.
Das Bakterium Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 6/0 wird submers in einer synthetischen Nährlösung bis zu einer Dichte von 0,7g Biomasse pro Liter bei einer Temperatur unter 22°C und einem pH-Wert von 6,8 kultiviert. Die Kultivierung erfolgt in 500 ml Standrundkolben mit 100 ml Kulturflüssigkeit auf einem Rundschüttler mit einer Frequenz von 250 Umdrehungen pro Minute.
Das verwendete synthetische Medium hat folgende Zusammensetzung: 5,5g Na2HPO4,2,6g KH2PO4,1,0g Na2SO4,10mg FeSO4- 7H20,10mg MnSO4 · 7H20,10g Glycerol, 1g Casaminoacids und 2,5g NH4CI pro 1 Liter destillierten Wassers. Zur Immobilisierung der Zellen in Agar Agar werden die Bakterienzellen von mindestens 1 Liter Kulturvolumen abzentrifugiert, in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7 resuspendiert und 10 ml dieser Zellsuspension mit einer Dichte von 4g Biomasse pro Liter in 50 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 7 mit 2% Agar Agar im Eisbad vermischt. Nach dem Erstarren des Agarblocks wird dieser zerkleinert, indem er durch ein Sieb mit einer Porengröße von etwa 1 mm gedrückt wird. Die dabei entstehenden Partikel haben ein Volumen von etwa 1 mm3.
Die so immobilisierten Zellen werden in das synthetische Medium, das 5-1OmM EDTA enthält, gebracht, wobei das Verhältnis des Volumens der Immobilisierungspartikel zum Inkubationsvolumen 1:4 beträgt.
Die Inkubation erfolgt in einem Reaktor mit Sauerstoffversorgung, Temperaturregelung und Möglichkeiten der intensiven Durchmischung. Der Sauerstoffpartialdruck im Inkubationsansatz muß mindestens 90% betragen. Unter diesen Bedingungen wird nach 24 Stunden eine Ausbeute von 30-40 mg Phaseolotoxin pro Gramm Biomasse erreicht.
Nach Beendigung der Inkubation wird die immobilisierte und permeabilisierte Biomasse durch Absieben der Dekantieren vom synthetischen Medium abgetrennt.
Aus dem synthetischen Medium wird das Phaseolotoxin nach BUBLITZ und VÖLKSCH (1983) isoliert.
Phaseolotoxin kann durch Umsetzung mit Leucinaminopeptidase in N'-Phosphosulfamylornithin umgesetzt werden.
Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung von Phaseolotoxin und N-Phosphosulfamylomithin mit dem Bakterienstamm Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 6/0 unter submersen Bedingungen in einem synthetischen Medium bei einem pH-Wert von 7, einerTemperatur von weniger als 220C und einem Sauerstoffpartialdruck von 90%, gekennzeichnet dadurch, daß die Zellen von Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 6/0 in immobilisiertem und permeabilisiertem Zustand verwendet werden.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Bakterienzellen in Agar Agar immobilisiert werden.
3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration des Agar Agar 1-3% beträgt.
4. Verfahren nach Punkt 1, 2 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Permeabilisierung der Zellen durch Zugabe von EDTA zum synthetischen Medium in Inkubationsansatz erfolgt.
5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration des EDTA im synthetischenMedium 5-1OmM beträgt.
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1986
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