DD250337A1 - Verfahren zum nachweis von genetischen defekten - Google Patents
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Abstract
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis von genetischen Defekten in genetischem Material mittels Uebertragung aus einem Elektrophoresegel auf einen Traeger zu entwickeln. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass nach Isolation der DNS, Gelelektrophorese und Denaturierung das Gel auf die Uebertragung mit einem Puffer hoher Ionenstaerke bei einem p H-Wert zwischen 3 und 6, einer Konzentration von 1-9 Mol/l und Verwendung von Alkalimetall- bzw. Ammoniumacetat vorbereitet, als Flaechentraeger ein zur Ausbildung kovalenter Bindungen befaehigter, chemisch reaktive Gruppen aufweisender Traeger verwendet, die Uebertragung durch ein Saugblottingverfahren mittels Druck, Unterdruck, Kapillarkraefte oder durch ein Elektroblottingverfahren erfolgt, der Flaechentraeger ohne weitere Behandlung getrocknet und noch vorhandene, chemisch reaktive Gruppen durch ein Blockierungsmittel bei einem p H-Wert zwischen 6 und 9 blockiert werden. Anwendungsgebiet sind die medizinische Diagnostik und Molekularbiologie.
Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis von genetischen Defekten in menschlicher, genomischer DNS. Anwendungsgebiet sind die medizinische Diagnostik und Molekularbiologie.
Die Diagnose von Erbkrankheiten ist an die Identifizierung bestimmter, die spezielle Krankheit hervorrufender oder eng mit ihnen gekoppelter Abschnitte des menschlichen Gens gebunden. Der Nachweis dieser Abschnitte erfolgt mit radioaktiv oder mit anderen Methoden markierten Sonden, die spezifisch nur mit diesem Abschnitt des Gens hybridisieren und so durch ihre Markierung eine Identifizierung zulassen. Die Gewinnung der Genabschnitte erfolgt aus menschlichem Gewebe, in der Regel Blut oder Fetalgewebe, aus dem die DNS nach bekannten Verfahren isoliert wird. Nach der Isolierung der DNS wird sie mit speziellen Restriktionsenzymen gespalten. Nach der Spaltung werden die DNS-Fragmente durch Gelelektrophorese nach ihrer Molmasse aufgetrennt. Nach der Gelelektrophorese beginnt der eingentliche Nachweis der Genfragmente, und je nach der Durchführung des Nachweisverfahrens kann eine Empfindlichkeit bis zu 1 pg des betreffenden DNS-Fragments erreicht werden. Nach den bisher üblichen Verfahren wird diese Empfindlichkeit jedoch nur in Ausnahmefällen erreicht, so daß bei den z.Zt. verwendeten Standardverfahren auf Basis Nitrocellulose und Nylonmembranen die Empfindlichkeitsgrenze bei etwa 1 pg spezifischer DNS liegt. Es werden verschiedene Verfahren zur Analys und insbesondere zum Nachweis mit gesteigerter Empfindlichkeit vorgeschlagen. Im EP 124124 wird z. B. ein Färbeverfahren durch simultane Fällung von DNS oder RNS und Farbstoff vorgeschlagen. Dadurch werden die Empfindlichkeit, Genauigkeit, Zuordenbarkeit und Geschwindigkeit der Analyse nach den bekannten Techniken erhöht. In EP 154505 wird ein Verfahren zur Diagnose von Gendefekten beschrieben. Es besteht in einer Anordnung zum Nachweis der An- oder Abwesenheit einer vorherbestimmten genetischen Sequenz in einem DNS-Strang. Auf die doppelsträngige DNS wirkt eine Restriktionsendonuclease ein, deren spezifische Wirksamkeit von der Anwesenheit einer bestimmten Basensequenz abhängig ist. Diese Basensequenz soll durch das Schneiden der DNS nachgewiesen werden. Die Hybridisation mit entsprechenden Sonden erfoigtan beiden Enden der Schnittstelle. Durch Trennung von flüssiger und fester Phase und Messung der Stärke der Markierung in jeder Phase wird auf die An- oder Abwesenheit der speziellen Basensequenz geschlossen.
In der Regel ist es notwendig, zum Nachweis der genetischen DNS-Sequenzen eine Reihe von Verfahrensschritten zu durchlaufen. Entscheidende, die Empfindlichkeit und Genauigkeit des Nachweises beeinflussende Schritte sind die Denaturierung der DNS, die Blotting- oder Übertragungungstechnik auf einen festen Träger, die Bindekapazität und Stabilität der Bindung an diesen Träger und schließlich die Behandlung des Trägers. Je geringer die Verluste vom Träger bei den nachfolgenden Schritten und je vollständiger die Hybridisierung der DNS-Fragmente gelingen, desto empfindlicher und sicherer ist die Methodik zur Feststellung des genetischen Defekts in einer Probe.
Ziel der Erfindung ist es, den Nachweis von Veränderungen im genetischen Material empfindlicher, schneller und damit sicherer zu gestalten.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Nachweis von genetischen Defekten in genetischem Material mittels Übertragung aus einem Elektrophoresegel auf einen Träger zu entwickeln.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß nach Isolation der Desoxyribonucleinsäure (DNS), Gelelektrophorese und Denaturierung das Gel auf die Übertragung mit einem Puffer hoher lonenstärke bei einem pH-Wert zwischen 3 und 6, einer Konzentration von 1-9 Mol/l und Verwendung von Alkalimetall- bzw. Ammoniumacetat vorbereitet, als Flächenträger ein zur Ausbildung kovalenter Bindungen befähigter, chemisch reaktive Gruppen aufweisender Träger verwendet, die Übertragung durch ein Saugblottihgverfahren mittels Druck, Unterdruck, Kapillarkräfte oder durch ein Elektroblottingverfahren erfolgt, wobei
a) bei den Saugblottingverfahren in einem Medium hoher lonenstärke bei einem pH-Wert zwischen 3 und 6, einer Konzentration von 1-9 Mol/l und Verwendung von Alkalimetall- bzw. Ammoniumacetat und
b) bei den Elektroblottingverfahren in einem Medium niedriger lonenstärke bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8, einer Konzentration von 0,001 bis 0,5 Mol/l und gegebenenfalls unter Beteiligung organischer Puffersubstanzen
gearbeitet, der Flächenträger ohne weitere Behandlung getrocknet und noch vorhandene, chemische reaktive Gruppen durch ein Blockierungsmittel bei einem pH-Wert zwischen 6 und 9 blockiert werden.
Das Verfahren zum Nachweis von genetischen Defekten wird in folgenden Schritten durchgeführt:
1. Aus tierischem oder menschlichem Blut wird nach üblichen Verfahren durch Fällung und Extraktion die DNS isoliert.
2. Die DNS wird mit den spezifischen Restriktionsenzymen gespalten, was zu DNS-Fragmenten führt, die den Gendefekt nachweisen oder mit seinem Genort gekoppelt sind.
3. Nach der Spaltung wird die DNS in üblicher Art und Weise durch Gelelektrophorese in Agarosegelen über Nacht nach der Länge der Fragmente aufgetrennt.
4. Nach der Gelelektrophorese wird die DNS im Gel in basischem Medium denaturiert und unter diesen Bedingungen gegebenenfalls in große Fragmente gespalten, die im Durchschnitt V3 bis Vs der ursprünglichen Molmasse der Fragmente aufweisen. Bemerkenswert ist, daß im Anschluß hieran kein separater Schritt zur Depurination, d. h. die Spaltung der DNS in Fragmente mit einer durchschnittlichen Größe von etwa 100 Basenpaaren, durchgeführt wird, um, wie nach anderen bekannten Verfahren üblich, einen schnellen und möglichst vollständigen Transfer zu erzielen.
5. Nach der Erfindung erfolgt die Vorbereitung des Gels auf die Übertragung der DNS-Fragmente auf den Flächenträger durch Neutralisation in einem Puffer hoher lonenstärke und mit einem pH-Wert zwischen 3 und 6 aus einem Alkalimetall- oder Ammoniumacetat, vorzugsweise Kaliumacetat, mit einer Konzentration zwischen 1 und 9 Mol/l, d.h. bis zur maximal möglichen Konzentration des Salzes in Wasser (gesättigte Lösung).
6. Verwendung eines zur Ausbildung kovalenter Bindungen befähigten, chemisch reaktive Gruppen aufweisenden Flächenträgers, z. B. eines Flächenträgers, der durch 2,4,6-Trihalogen-s-triazine, Bromcyan, Epoxide oder Diazotierungen aktiviert wurde, insbesondere von makromolekularen Massen mit chemisch aktiven Füllstoffen, die aus
— einer makromolekularen Verbindung in einer Konzentration von 5-80VoI.-%,
— einer makromolekularen Verbindung mit4,6-Dihalogen-s-triazin-Gruppierungen in einer Konzentration von 1-80 Vol.-%,
— 2,4,6-Trihalogen-s-triazin in einer Konzentration von 0,5-50Vol.-%,
— Metallhalogeniden in einer Konzentration bis zu 20VoI.-%,
— gegebenenfalls puffernde Substanzen bis zu 5VoI.-% und
— gegebenenfalls flüssigem Dispersionsmittel
bestehen und nach DD-WP 220316 und DD-WP 217809 hergestellt wurden.
7. Übertragung der DNS entweder durch Saugblottingverfahren, wie Druckblotting, Vakuumblotting oder Kapillarblotting, oder durch ein Elektroblottingverfahren, wobei
— bei den Saugblottingverfahren in einem Medium hoher lonenstärke bei einem pH-Wert zwischen 3 und 6, einer Konzentration von 1-9 Mol/l und Verwendung von Alkalimetall- bzw. Ammoniumacetat, vorzugsweise Kaliumacetat, und
— bei den Elektroblottingverfahren in einem Medium niedriger lonenstärke bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8, einer Konzentration von 0,001 bis 0,5 Mol/l und in Anwesenheit von 0 bis 0,1 Mol/l organischer Puffersubstanzen, z. B. Triethanolamin, Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan, Triethylamin, Methyldiethanolamin usw.
gearbeitet wird.
8. Nach der Übertragung (Blotting) wird der Träger erfindungsgemäß ohne vorheriges Waschen getrocknet, vorzugsweise an der Luft bei Zimmertemperatur innerhalb von etwa 10 Minuten bis zu 10 Stunden.
9. An den Trocknungsschritt schließt sich erfindungsgemäß ein Blockierungsschritt an, um noch vorhandene Bindungskapazität, z. B. reaktionsfähige Halogenatome des 2,4,6-Trihalogen-s-triazins, umzusetzen. Diese Blockierung erfolgt mit einem Reagens, das mit den verbliebenen reaktionsfähigen Gruppen des Flächenträgers eine chemische Reaktion eingeht. Ein solches Reagens läßt sich z.B. aus einer 1- bis 20%igen wäßrigen Lösung von Ethanolamin und Ethanolaminhydrochlorid, deren pH-Wert durch Salzsäure auf 6 und 9 eingestellt wurde, herstellen.
10. Nach der Blockierung wird die Hybridisation vorbereitet durch einen Waschschritt mit einer Vorhybridisationslösung, der
a) bei Zimmertemperatur mit 50% Formamid, 3 χ SSC, Denhardts Lösung, 0,1 % SDS und beschallter und denaturierter DNS oder
b) im SSC-System bei Temperaturen von 2O0C bis 4O0C durchgeführt wird.
11. Die Vorhybridisation wird etwa 4 Stunden entweder a) in der Lösung 10a) bei 400C oder
. b) in der Lösung 10b) bei 55-650C durchgeführt.
12. Die Hybridisation erfolgt über Nacht in einer der Lösungen 10a) oder 10b), der jedoch eine Sonde mit einer spezifischen Radioaktivität von etwa 108cpm/mg oder eine auf anderem Wege markierte Sonde zugesetzt wird.
13. Nach der Hybridisierung wird mit 2 χ SSC, 0,1 % SDS eine Stunde bei 400C gewaschen.
14. Anschließend wird autoradiographiert durch Exposition über Nacht bei -7O0C oder fluorographiert bzw. nach anderer Methode nachgewiesen.
Als Flächenträger kommen neben den bevorzugten makromolekularen Massen nach DD-WP 217809 auch solche in Frage, die z. B. durch Cyanurchlorid und anschließende Wasserwäsche hergestellt werden oder natürliche und/oder synthetische Polymere, die durch Cyanurchlorid substituiert sind. Bevorzugt werden dann cellulosehaltige Materialien, die 0,01 bis 0,5 Mol 2,4,6-Trihalogen-s-triazin je Anhydroglucoseeinheit gebunden enthalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch mehrere Vorteile gegenüber den bisherigen Techniken aus. Der wesentliche Vorteil ist die kurze Expositionszeit über Nacht (gegebenenfalls schon in 5 Stunden) und das Erreichen einer hohen Empfindlichkeit, die durch die höhere Bindungskapazität der Flächenträger mit kovalent bindenden Gruppen etwa eine Zehnerpotenz über der der bekannten Verfahren liegt. Weiterhin wird die Genauigkeit und damit die methodische Sicherheit in der DNS-Analyse dadurch erhöht, daß die Depurination nicht mehr notwendig ist, d. h. die DNS, die ursprünglich zwischen 50 und 1 Kilobasen lang war, nicht in kleine und kleinste Fragmente von 100 bis 10 Basenpaaren gespalten wird. Durch die Anwendung eines speziellen Trägers, der eine kovalente Bindung ermöglicht und außerdem durch seine Beschaffenheit ein bestimmtes Mikromilieu schafft und darauf abgestimmte, neuartige Reaktionsbedingungen beim Übertragen der DNS vom Gel auf den Träger einschließlich des Trocknungs- und Blockierungsschrittes unter milden Bedingungen wird
1. die DNS nicht beeinflußt und ihre Verteilung nach der Größe und Morphologie nicht verändert und
2. eine große Schärfe der Banden und damit eine wesentlich gesteigerte Empfindlichkeit auf den Autoradiogrammen erzielt.
Die erfindungsgemäß erzielten Fortschritte im Nachweis bestimmter DNS-Fragmente stellen somit eine neue Qualität dar, die in einer schnelleren und sichereren Diagnose von genetischem Material resultiert, was insbesondere bei pränataler Diagnose von großer Bedeutung ist.
Es wird in den in der Beschreibung angegebenen Schritten vorgegangen und für diese Schritte die genauen Bedingungen für den Nachweis eines mit dem Genort für die Duchenne'sche Muskeldystrophie gekoppelten DNS-Fragmentmusters gegeben. 1. Blut und Citratlösung werden mit dem gleichen Volumen Plasmaersatz (Gelafusal) versetzt, 30-45 Minuten sedimentieren lassen, der Überstand abgehoben, mit dem gleichen Volumen physiologischer Kochsalzlösung versetzt, zentrifugiert, der Überstand abgegossen, mit dem gleichen Volumen Kochsalzlösung versetzt und der Vorgang wiederholt, die so erhaltenen Erythrozyten mit Chloroform und Octanol 10 Minuten bei Zimmertemperatur geschüttelt, zentrifugiert, die Lösung abgehoben, mit Chloroform extrahiert, der Chloroformextrakt abgehoben, die DNS aus der Lösung mit iso-Propanol gefällt und mit dem Glasstab aufgenommen und schließlich in 1 χ SSC-Puffer gelöst und mit Alkohol reprezepitiert und erneut in 0,1 χ SSC aufgenommen.
2. Spaltung mit Pstl in Fragmente von etwa 30 bis 5 kb
3. Gelelektrophorese in 0,6%Agarose-Gel, mit TE-Puffer, pH-Wert = 7,7 bei 20 V und Zimmertemperatur über Nacht
4. Denaturierung in 0,5m NaOH/1,5m NaCI-Lösung
5. Vorbereitung auf das Blotting, indem das Gel in einen Puffer gelegt wird (ausreichend Flüssigkeit), der aus 3 m Kaliumacetat bestand und durch Essigsäure auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt wurde
6.Träger nach DD-WP 220316 durch Umsetzung von Cellulosepapier mit Natronlauge und Aktivierung mit Cyanurchlorid in organischen Lösungsmitteln (9μ.ΜοΙ Cyanurchlorid/cm2; 40μΜοΙ NaCI/cm2)
7. Übertragung (Blotting) mittels Southern-Transfer über Nacht in Puffer aus 3 m Kaliumacetat, der durch Essigsäure auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt wurde (Zimmertemperatur)
8. Trocknen 1 Stunde bei Zimmertemperatur an der Luft
9. Blockierung mit 10% Ethanolamin in Wasser; die Lösung wurde mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt (1 Stunde bei Zimmertemperatur)
10. Waschen mit Vorhybridisationslösung : 3 χ SSC und Denhartis Lösung, dazu beschallte und denaturierte DNS (2 χ 10 Minuten, Zimmertemperatur)
11. Vorhybridisation in dergleichen Lösung 4Stunden bei 60-650C
12. Hybridisation über Nacht mit einer X-chromosomalen molekularen Sonde (754) mit einer spezifischen Aktivität von 3 x 108cpm/mg in Formamidlösung (50% Formamid, 3 χ SSC, Denhardts Lösung, 0,1 % SDS) bei 4O0C
13. Waschen mit 2 x SSC, 0,1 % SDS eine Stunde bei 4O0C
14. Autoradiographie bei-7O0C über Nacht und Entwicklung Empfindlichkeit: 0,1 pg.
Claims (8)
1. Verfahren zum Nachweis von genetischen Defekten durch Untersuchung genetischen Materials nach an sich bekannter Technik durch Isolation der Desoxyribonucleinsäure (DNS) aus Blut oder Fetalgewebe, Spaltung der DNS, Gelelektrophorese, Denaturierung, Übertragung auf einen Flächenträger, Blockierung, Hybridisation und Nachweis, gekennzeichnet dadurch, daß
a) das Gel auf die Übertragung mit einem Puffer hoher lonenstärke bei einem pH-Wert zwischen 3 und 6, einer Konzentration von 1-9 Mol/l und Verwendung von Alkalimetall- bzw. Ammoniumacetat vorbereitet wird,
b) als Flächenträger ein zur Ausbildung kovalenter Bindungen befähigter, chemisch reaktive Gruppen aufweisender Träger verwendet wird,
c) die Übertragung durch ein Saugblottingverfahren mittels Druck, Unterdruck, Kapillarkräfte oder durch ein Elektroblottingverfahren erfolgt, wobei
aa) bei den Saugblottingverfahren in einem Medium hoher lonenstärke bei einem pH-Wert zwischen 3 und 6, einer Konzentration von 1-9 Mol/l und Verwendung von Alkalimetallbzw. Ammoniumacetat und
bb) bei den Elektroblottingverfahren in einem Medium niedriger lonenstärke bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8, einer Konzentration von 0,001 bis 0,5 Mol/l und gegebenenfalls unter Beteiligung organischer Puffersubstanzen
gearbeitetwird,
d) der Flächenträgerohne weitere Behandlung getrocknetwird und
e) noch vorhandene, chemisch reaktive Gruppen durch ein Blockierungsmittel bei einem pH-Wert zwischen 6 und 9 blockiert werden.
— 2,4,6-Trihalogen-s-triazin in einer Konzentration von 0,5-50 Vol.-%,
— Metallhalögeniden in einer Konzentration bis zu 20VoI.-%,
— gegebenenfalls puffernden Substanzen bis zu 5VoI.-% und
— gegebenenfalls flüssigem Dispersionsmittel
verwendet wird.
verwendet wird.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Flächenträger mit chemisch reaktiven Gruppen solche verwendet werden, die durch 2,4,6-Trihalogen-s-triazine, Bromcyan, Epoxide oder Diazotierungen aktiviert wurden.
3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß als Flächenträger mit chemisch reaktiven Gruppen makromolekulare Massen mit chemisch aktiven Füllstoffen aus
— einer makromolekularen Verbindung in einer Konzentration von 5-80Vol.-%,
— einer makromolekularen Verbindung mit 4,6-Dihalogen-s-triazin-Gruppierungen in einer Konzentration von 1-80VoI.-%,
4. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß als Flächenträger mit chemisch reaktiven Gruppen ein im wesentlichen aus Cellulose bestehendes Papier, das durch 0,01 bis 0,5 Mol 2,4,6-Trihalogen-s-triazin je Anhydroglucoseeinheit der Cellulose substituiert ist, verwendet wird.
5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Vorbereitung der Übertragung und die Übertragung nach einem Saugblottingverfahren in einem Puffer aus Kaliumacetat bei einem pH-Wert von 3 bis 6 und bei einer Konzentration von 1 bis 9 Mol/l erfolgen.
6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Trocknung des Flächenträgers nach der Übertragung bei Zimmertemperatur an der Luft innerhalb von 10 Minuten bis 10 Stunden erfolgt.
7. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Blockierung mit einem Reagens durchgeführt wird, das mit den verbliebenen reaktionsfähigen Gruppen des Flächenträgers eine chemische Reaktion eingeht.
8. Verfahren nach Punkt 1 und 7, gekennzeichnet dadurch, daß die Blockierung in einem Reagens aus Ethanolamin, Ethanolaminhydrochlorid und Wasser einer Konzentration zwischen 1 und20Gew.-%, bezogen auf Ethanolamin bei einem pH-Wert zwischen 6 und 9 durchgeführt wird.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD28921486A DD250337A1 (de) | 1986-04-16 | 1986-04-16 | Verfahren zum nachweis von genetischen defekten |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD28921486A DD250337A1 (de) | 1986-04-16 | 1986-04-16 | Verfahren zum nachweis von genetischen defekten |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD250337A1 true DD250337A1 (de) | 1987-10-08 |
Family
ID=5578265
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD28921486A DD250337A1 (de) | 1986-04-16 | 1986-04-16 | Verfahren zum nachweis von genetischen defekten |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD250337A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0407141A1 (de) * | 1989-07-07 | 1991-01-09 | Stratagene | Vorrichtung und Verfahren zum Übertragen von Makromolekülen |
-
1986
- 1986-04-16 DD DD28921486A patent/DD250337A1/de not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| EP0407141A1 (de) * | 1989-07-07 | 1991-01-09 | Stratagene | Vorrichtung und Verfahren zum Übertragen von Makromolekülen |
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