DD251078A1 - Verfahren zur herstellung von prothrombinkonzentraten - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Prothrombinkomplexkonzentraten. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Prothrombinkomplexkonzentraten zur Therapie angeborener oder erworbener Mangelzustaende der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X zur Verfuegung zu stellen. Dabei sollen die Ausbeute und der auf Protein bezogene Anreicherungsgrad (spezifische Aktivitaet) der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X erhoeht und die Gefahr thromboembolischer Komplikationen bei der Therapie verringert werden. Das erfindungsgemaesse Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass aus einem zitratfreiem Plasma der Prothrombinkomplex und eine zur Stabilisierung der Praeparate ausreichende Menge Antithrombin III durch Adsorptionschromatographie an tri-Calciumphosphat entfernt und entweder nach Auswaschen des Adsorbens-Protein-Praezipitates oder unmittelbar nach der Adsorption der Prothrombinkomplex und das Antithrombin III in einer 2stufigen Elution freigesetzt und Heparin dem Eluat zugesetzt wird. Das nach der Elution vom tri-Calciumphosphat erhaltene Prothrombinkomplexkonzentrat kann nach der Lyophilisation direkt therapeutisch eingesetzt werden. Das Verfahren kann als Kleinpoolverfahren im geschlossenen System unter Wahrung der Sterilitaet durchgefuehrt werden.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Prothrombinkomplexkonzentraten, die neben den Gerinnungsfaktoren II, VII1IX und X auch Antithrombin III in einer zu deren Stabilisierung ausreichenden Menge enthalten.
Das Risiko thromboembolischer Komplikationen bei der Therapie angeborener oder erworbener Mangelzustände der Faktoren des Prothrombinkomplexes kann durch den Antithrombin-Ill-Gehalt der Prothrombinkomplexkonzentrate verringert werden.
Es ist bekannt, daß die Gerinnungsfaktoren des Prothrombinkomplexes u.a. an anorganischen Adsorbenzien wie Bariumsulfat, tri-Calciumphosphat und Aluminiumhydroxid zumindest teilweise reversibel adsorbiert werden. Der Einsatz der Adsorptionsmittel Bariumsulfat und tri-Calciumphosphat erfordert die Verwendung zitratfreier Konservierungslösungen mit
z. B. Chelaplex III (Dinatriumhydrogenäthylendiamintetraazetat-2-hydrat) als Calcium-bindendes Agens bzw. den Einsatz von Ionenaustausch- oder Heparin-Plasma.
Nach dem von C. Blatrix und J. P. Soulier (Path, et Biol. 7 [1959] 2477) angegebenen und später nur geringfügig modifizierten Verfahren erfolgt die Adsorption der Faktoren des Prothrombinkomplexes an tri-Calciumphosphat (Amend Drug) mit einer Menge von 7,5g/l Aedetatplasma. Die Elution der adsorbierten Gerinnungsfaktoren erfolgt mit 0,18mol/l enthaltender Natriumzitratlösung. Anschließend werden die Eluate durch eine 2stufige Fraktionierung mit Äthanol.gereinigt. Die Ausbeuten betragen nur ca. 25%. Der Reinigungsschritt ist aufwendig und für die Herstellung eines Präparates im Kleinpool verfahren nicht geeignet.
Diese Prothrombinkomplexkonzentrate sowie auch die aus Humanzitratplasma durch Adsorption an DEAE-Zellulose, DEAE-SephadexA-50 (Heystek, I., Brummelhuis, H. G J., Krijnen, H. W.: Contributions to the optimal use of human blood. II. The large scale preparation of prothrombin complex. Vox. Sang. 25 [1973] 113; Suomela, G., MyIIyIa, G., Raska, E.: Preparation and properties of a therapeutic factor IX concentrate. Vox. Sang. 33 [1977] 37-51) enthalten in unterschiedlicher Menge aktivierte Gerinnungsfaktoren.
Die aktivierten Gerinnungsfaktoren u.a. Vila, IXa, Xa, XIa oder Reaktionsprodukte aktivierter Gerinnungsfaktoren sind sehr wahrscheinlich die Ursache gefährlicher Nebenwirkungen, wie arterieller Thrombosen, venöser Thromboembolien oder einer disseminierten intravasalen Gerinnung (DIC).
Zur Charakterisierung der Menge aktivierter Gerinnungsfaktoren kann der Quotient aus der Gerinnungszeit eines nicht kontaktaktivierten Humanplasmas mit und ohne Zusatz von Prothrombinkomplexkonzentrat (NAPTTR) angegeben werden.
Antithrombin III ist ein natürlicher Proteaseinhibitor, der die in den Prothrombinkomplexkonzentraten möglicherweise vorhandenen aktivierten Gerinnungsfaktoren irreversibel neutralisiert, wobei die Geschwindigkeit dieser Reaktion durch Heparin beträchtlich erhöht wird.
Nach J.P.Soulierund M. Steinbuch (Zeitschr. Ges. Inn. Med.20, Suppl. [1965] 311) hat Heparin eine stabilisierende Wirkung auf den Prothrombinkomplex, seine Gegenwart kann jedoch nicht in jedem Falle eine Aktivierung der Gerinnungsfaktoren bis zur Bildung von Thrombin verhindern.
Die Bedeutung des vom International Committee on Thrombosis and Haemostasis(Menache, D,, Roberts, H. R.: Summary report and recommendations of the task force members and consultants. Thromb. et Diath. haemorrh. 33 [1975] 675) empfohlenen Zusatzes von 5^1 ΟΊΕ Heparin/ml Anwendungsvolumen PKK wird deshalb unterschiedlich beurteilt.
Auch wird der Zusammenhang zwischen dem Antithrombin-Ill- und Heparingehalt der Prothrombinkomplexkonzentrate und ihrerThrombogenität nicht einheitlich bewertet.
Von G. C. White et al. (Prothrombon complex concentrates: Potentially thrombogenic materials and clues to the mechanism of thrombosis in vivo. Blood 49 [1977] 159) wird vermutet, daß die Menge des in einigen Konzentraten nachweisbaren Antithrombin III nicht zur Neutralisation der Gesamtmenge aktivierter Gerinnungsfaktoren ausreicht. Ohne die Gegenwart von biologisch aktivem Antithrombin III ist der Einfluß von Heparin auf die in vitro gemessene Thrombogenität von Prothrombinkomplexkonzentraten wenig ausgeprägt oder nicht nachweisbar. Es ist bekannt, daß Prothrombinkomplexkonzentrate in Abhängigkeit von dem angewandten Herstellungsverfahren unterschiedliche Mengen Antithrombin III enthalten können. Die in zunehmenden Umfang aus Humanzitratplasma durch Adsorption des Prothrombinkomplexes an DEAE-Sephadex A-50 oder DEAE-Zellulose hergestellten Prothrombinkomplexkonzentrate enthalten kein Antithrombin III.
Von S.Chandra und M.Wickerhauser (Large scale preparation of a nonthrombogenic prothrombin complex. Thrombosis Research 12 [1978] 571) wird deshalb Antithrombin III bei der Elution des Prothrombinkomplexes zur Verringerung der Thrombogenität zugesetzt.
Bei dem gegenwärtigen Stand derTechnik sind bei dem Hersteller produktionsbegleitende Prüfungen notwendig, die u.a. auch die Menge der in den Konzentraten vorhandenen thrombogen wirkenden Substanzen erfassen sollen. Die Standardisierung und das Festlegen von Grenzwerten für die nicht aktivierte partielle Thromboplastinzeit (NAPTT) und die Thrombinbildungsrate (TG150 nach Sas) ist auf Grund der Heterogenität der mit beiden Untersuchungsverfahren nachgewiesenen Faktoren außerordentlich schwierig.,
VonS.Elödi und K.Varadi (Activation of clotting factors in prothrombin complex concentrates as demonstrated by clotting assays for factors IXa and Xa. Thrombosis Research 12 [1978] 597) ist aufdie ungenügende Stabilität von Prothrombinkomplexkonzentraten nach Auflösen der lyophilisierten Präparate hingewiesen worden.
Ziel der Erfindung ist die Herstellung eines Prothrombinkomplexkonzentrates mit einem ausreichend hohen Gehalt an Antithrombin III, um die Stabilität des Präparates zu gewährleisten und das Risiko thrombogener Nebenwirkungen beim therapeutischen Einsatz der Präparate zu verringern.
Es wird weiterhin angestrebt, daß gegenüber dem Stand derTechnik die Ausbeute an den Gerinnungsfaktoren II, IX, X sowie der auf den Proteingehalt bezogene Grad ihrer Anreicherung (spezifische Aktivität) erhöht wird.
Der dazu notwendige Verfahrensschritt soll gegenüber dem Stand der Technik technisch einfach sein und nicht zu einer Verringerung der Ausbeute und einer Beeinträchtigung der Stabilität führen.
Essoll weiterhin gewährleistet sein, daß das gesamte Verfahren im geschlossenen System unter Wahrung der Sterilität durchgeführt werden kann, um das Hepatitisrisiko auch durch die Beschränkung der Menge des je Charge eingesetzten Ausgangsmaterials (Kleinpoolverfahren) zu verringern.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Prothrombinkomplexkonzentraten mit einer zu deren Stabilisierung ausreichenden Menge Antithrombin III.
Erfindungskennzeichnend ist, daß tri-Calciumphosphat nicht nur bekanntermaßen die Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X (Prothrombinkomplex), sondern auch Antithrombin III aus zitratfreiem Plasma adsorbiert.
Es wurde gefunden, daß verschiedene Handeisformen des tri-Calciumphosphats nicht nur unterschiedliche Adsorptionseigenschaften für die Faktoren des Prothrombinkomplexes besitzen* sondern sich auch hinsichtlich des Adsorptionsvermögens für Antithrombin III beträchtlich unterscheiden.
So wurde gefunden, daß ζ. B. penta-Calciumhydroxidtriphosphat der ungefähren Zusammensetzung Ca5(PO4I3OH als eine Handelsform des tri-Calciumphosphats eine wesentlich größere Adsorptionskapazität sowohl für die Faktoren des Prothrombinkomplexes als auch für Antithrombin M! besitzt aIs eine andere Handelsform, die der ungefähren Zusammensetzung Ca3(PO4J2 entspricht. Es ist deshalb notwendig, bei der Herstellung eines stabilisierten Prothrombinkomplexkonzentrates das einzusetzende tri-Calciumphosphat-Präparat hinsichtlich seines Adsorptionsvermögens für die Faktoren des Prothrombinkomplexes und für Antithrombin IM zu charakterisieren.
Es wurde gefunden, daß die Unterschiede im Adsorptionsvermögen dertri-Calciumphosphat-Präparate mit unterschiedlicher Zusammensetzung mit Unterschieden in dem Grad der Freisetzung des Prothrombinkomplexes und des Antithrombin III bei der Elution verbunden sind.
Es ist deshalb notwendig, bei der Herstellung eines Prothrombinkomplexkonzentrates, das eine zu dessen Stabilisierung ausreichende Menge Antithrombin III enthalten soll, das einzusetzende tri-Calciumphosphat-Präparat hinsichtlich seines Adsorptionsvermögens für die Faktoren des Prothrombinkomplexes und für Antithrombin Nl auszuwählen und dabei auch sicherzustellen, daß bei der Elution des Prothrombinkomplexes auch eine ausreichende Menge Antithrombin III freigesetzt
Es wurde gefunden, daß die Adsorptionskapazität des gleichen tri-Calciumphosphat-Präparates für die Faktoren des Prothrombinkomplexes in der Regel größer als für die Adsorption einer ausreichenden Menge Antithrombin IN ist. Das bedeutet, daß in der Regel eine größere Adsorptionsmittelmenge einzusetzen ist, wenn die Aufgabe gelöst werden soll, einen ausreichend hohen Gehalt des Prothrombinkomplexkonzentrates an Antithrombin Nl sicherzustellen.
Es wurde gefunden, daß tri-Calci um phosphat in der Handelsform als penta-Calciumhydroxidtriphosphat in einer Menge von 3,8 bis 5,0g/Liter Aedetatplasma die Faktoren des Prothrombinkomplexes nahezu vollständig adsorbiert und eine Freisetzung in hoher Ausbeute bereits bei niedrigen Konzentrationen an Natriumzitrat erfolgt.
Es wurde gefunden, daß bei Einsatz von 5g Ca5(PO4I3OHJe Liter Aedetatplasma bis zu 10% des im Ausgangsmaterial vorhandenen Antithrombin Nl adsorbiert werden.
Es wurde festgestellt, daß ca. 60% des adsorbierten Antithrombin Nl bei der Elution zusammen mit den Faktoren des Prothrombinkomplexes freigesetzt werden.
Es wurde gefunden, daß die so hergestellten Prothrombinkomplexkonzentrate 14 bis 22 Einheiten Antithrombin III je Transfusionseinheit (TE) des Prothrombinkomplexkonzentrates enthalten, wobei 1 Einheit Antithrombin 111 der AT-Ill-Aktivität von 1 ml frischem Zitratmischplasma entspricht.
Es wurde gefunden, daß durch eine Erhöhung der Menge eingesetzten penta-Calciumhydroxidtriphosphat auf 12g je Liter Aedetatplasma ohne Beeinträchtigung der Ausbeute an den Faktoren II, VII, IX und X Prothrombinkomplexkonzentrate hergestellt werden können, die 50 bis 70 Einheiten Antithrombin Nl je TE enthalten.
Es wurde gefunden, daß die Menge der bei der Isolierung des Prothrombinkomplexes entstehenden aktivierten Gerinnungsfaktoren abhängig ist von der Art und Qualität des eingesetzten Ausgangsmaterials und den verfahrenstechnischen Parametern.
Es wurde gefunden, daß bei gleichen Adsorptionsmittelmengen, die aus dem alkoholhaltigen Aedetatplasmaüberstand hergestellten Prothrombinkomplexkonzentrate im Mittel 8 Einheiten Antithrombin III je TE mehr enthalten als Vergleichspräparate, bei denen Aedetatplasma ohne vorangegangene Alkoholfällung eingesetzt wurde.
Es wurde gefunden, daß die Bestimmung des in den Prothrombinkomplexkonzentraten vorhandenen Antithrombin Nl vorzugsweise durch eine Aktivitätsbestimmung z. B. mittels chromogener Substrate und nicht durch eine immunologische Bestimmung der Antithrombin-Ill-Konzentration erfolgen sollte, weil bei den immunologischen Bestimmungsmethoden auch die Komplexe der aktivierten Gerinnungsfaktoren mit dem Antithrombin Nl in das Ergebnis eingehen.
Bei der Herstellung der Prothrombinkomplexkonzentrate ist deshalb sicherzustellen, daß Antithrombin IN in ausreichender Menge als biologisch aktives Antithrombin Nl vorhanden ist.
Es wurde bestätigt, daß durch einen Zusatz von 5 bis 10IE Heparin/ml Prothrombinkomplexkonzentrat nach Abtrennung des Prothrombinkomplexes die Menge der nachweisbaren aktivierten Gerinnungsfaktoren verringert werden kann.
Es wurde jedoch gefunden, daß diese Wirkung eines Heparinzusatzes nur eintritt, wenn die Präparate biologisch aktives Antithrombin III in einer ausreichenden Menge enthalten.
Es wurde gefunden, daß als Ausgangsmaterial Aedetatplasma, der alkoholhaltige Aedetatplasmaüberstand nach Abtrennung der Fraktion Cohn I, Heparinplasma und lonenaustauschplasma eingesetzt werden können.
Dabei ist sicherzustellen, daß die beobachtete Abhängigkeit der Antithrombin-Ill-Adsorption von der Zusammensetzung des Ausgangsmaterials durch den Einsatz ausreichender Mengen tri-Calciumphosphat berücksichtigt wird.
Es wurde gefunden, daß die Adsorption der Faktoren des Prothrombinkomplexes und des Antithrombin Nl vorteilhaft bei einem pH-Wert der Adsorptionsmittel-Plasma-Suspension von 7,2 bis 8,2 erfolgt.
Es wurde gefunden, daß die Freisetzung der Faktoren des Prothrombinkomplexes vom tri-Calciumphosphat mit einer 0,05mol/i Natriumzitrat enthaltenden Lösung zu einer geringeren Freisetzung von unerwünschten Begleitproteinen führt, als eine nach dem Stand der Technik eingesetzte Natriumzitratkonzentration von 0,*3mol/l.
Es wurde gefunden, daß durch Auswaschen des tri-Calciumphosphats nach der nahezu vollständigen Adsorption der Faktoren des Prothrombinkomplexes und der teilweisen Adsorption des Antithrombin Nl mit einer zitratfreien Waschflüssigkeit unerwünschte Begleitproteine entfernt werden können, ohne daß ein nennenswerter Verlust an den Faktoren des Prothrombinkomplexes und an adsorbiertem Antithrombin IN beobachtet wird und ohne daß eine die Stabilität des Prothrombinkomplexkonzentrates negativ beeinflussende Wirkung festgestellt wird.
Es wurde jedoch auch gefunden, daß ein Auswaschen der Adsorbens-Protein-Präzipitate vor der Elution des Prothrombinkomplexes und des Antithrombin III kein obligatorischer Verfahrensschritt ist, da die spezifische Aktivität der Faktoren II, VII, IX und X, ausgedrückt in Einheiten/mg Protein bei Adsorptionsmittel meng en von 5 g tri-Calciumphosphat je Liter Aedetatplasma zwischen 0,5 und 0,75 liegt, wenn die Elution mit einer 0,05mol/l Natriumzitrat enthaltenden Lösung durchgeführt wird.
Durch ein Auswaschen der Adsorbens-Protein-Präzipitate kann die spezifische Aktivität auf 1,2 bis 2,0 in Abhängigkeit von der eingesetzten Adsorptionsmittelmenge erhöht werden.
Es wurde gefunden, daß für das Auswaschen hypo-, iso- oder hypertonische Tris/Natriumchlorid-Puffer eingesetzt werden können.
Es wurde gefunden, daß es zweckmäßig sein kann, der Waschflüssigkeit Chelapiex III (Dinatriumhydrogenäthylendiamintetraazetat-2-hydrat) in einer Menge zwischen 0,001 und 0,003mol/l zuzusetzen.
Es wurde gefunden, daß der als Waschflüssigkeit eingesetzte Tris/NaCl-Puffer (Tris = 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol) einen pH-Wert von 7,2 bis 9,0 haben kann.
Es wurde gefunden, daß die Waschflüssigkeit bei einem pH-Wert von 7,15 zweckmäßigerweise 0,05mol/l Tris, 0,15mol/l Natriumchlorid sowie 0,001 mol/l Chelapiex III enthält.
Es wurde gefunden, daß es zweckmäßig sein kann, die Adsorbens-Protein-Präzipitate ein-oder zweimal mit einer Menge Waschflüssigkeit auszuwaschen, die 10 bis 30%, bezogen auf eingesetztes Plasmavolumen, beträgt.
Es wurde gefunden, daß die gemeinsame Freisetzung der Faktoren des Prothrombinkomplexes und des Antithrombin III zweckmäßigerweise mit einer 0,05mol/l enthaltenden Natriumzitratlösung erfolgt.
Es wurde gefunden, daß es zweckmäßig sein kann, die Freisetzung mit einer Elutionsflüssigkeit durchzuführen, die 0,01 mol/l Tris und 0,05mol/l Natriumzitrat enthält und deren pH-Wert 7,2 beträgt.
Es wurde gefunden, daß es zweckmäßig ist, die Elution 2stufig mit einer Menge Elutionsflüssigkeit durchzuführen, die 6,8 bis 7,5%, bezogen auf die Menge Ausgangsmaterial, beträgt.
Es wurde gefunden, daß die Adsorption, das Auswaschen des Protein-Adsorbats und die Elution des Prothrombinkomplexes sowie des Antithrombin III bei Temperaturen zwischen -5°C und 37°C durchgeführt werden können, vorzugsweise wird bei Temperaturen zwischen -20C und 25°C gearbeitet.
Zur Senkung des Hepatitisrisikos wird gewährleistet, daß die Menge je Charge eingesetzten Ausgangsmaterials auf einen vertretbaren Umfang, vorzugsweise auf einen 2-Spenderpool mit 400 bis 450 ml Plasma oder einen 18-Spenderpool mit ca. 41 Plasma beschränkt bleibt.
Das Hepatitisrisiko kann weiterhin durch intensives Auswaschen des Adsorptionsmittels verringert werden.
Gleichermaßen wird gewährleistet, daß bei Beschränkung der Chargengröße auf 450 ml bzw. ca. 41 Ausgangsmaterial das gesamte Verfahren im geschlossenen System bei Wahrung der Sterilität durchgeführt wird und deshalb eine Sterilfiltration durch eine Sterilitätsprüfung des Prothrombinkomplexkonzentrates ersetzt werden kann.
Ausführungsbeispiel
Das Aedetatplasma wird innerhalb von 4 Stunden von den Erythrozyten durch Zentrifugation abgetrennt. Zur Stabilisierung des Blutes kann ein Stabilisator folgender Zusammensetzung verwendet werden:
Natriumaedetat (Chelapiex III)
(Dinatriumhydrogenäthylendiamintetraazetat-2-hydrat) 6,0 g
Natriumchlorid 3,5 g
Glucose 21,5 g
Wasserzur Injektion ad 1000 ml
Für 400 ml Blut sind 50 ml Stabilisator notwendig. Das nach Abtrennen des Plasmas erhaltene Erythrozytenkonzentrat wird retransfundiert, wenn die Blutentnahme durch Plasmapherese erfolgt, oder in einer geeigneten Konservierungslösung unter den üblichen Bedingungen der Flüssigkonservierung von Erythrozyten aufbewahrt.
Heparinblut
400 ml Bl ut wird in 50 ml einer 0,15 mol/l Natriumchlorid enthaltenden Lösung stabilisiert, der 2 500IE Heparin zu gesetzt wurden.
Nach Abtrennung des Plasmas werden die Erythrozyten mit einer zur Flüssigkonservierung geeigneten Konservierungslösung versetzt, sofern keine Retransfusion im Falle der Blutentnahme durch Plasmapherese erfolgt.
Der alkoholhaltige Aedetatplasmaüberstand wird nach Abtrennung der Fraktion Cohn I durch Fällung mit Äthanol erhalten. Der Plasmaüberstand enthalte bis 10Vol.-%Äthanol.
400 ml Aedetatplasma, Heparinplasma oder lonenaustauschplasma werden im geschlossenen System unter aseptischen Bedingungen zu einer Suspension von 1,5 bis 3,0g, vorzugsweise 2,0g tri-Calciumphosphat (Ca5(PO4)3OH-penta-Calciumhydroxidtriphosphat), in 10ml 0,15mol/i Natriumchlorid enthaltender Lösung in einer 500-ml-Blutkonservenflasche gegeben.
Während der Adsorption (25min bei Raumtemperatur) wird der Flascheninhait auf geeigneten Schüttelgerä'ten gründlich gemischt, wobei eine Schaumbildung weitgehend auszuschließen ist.
Bei dem Einsatz von 450ml Aedetatplasmaüberstand nach Abtrennung der Cohn-I-Fraktion wird die Adsorption bei -2°C begonnen und bei Raumtemperatur fortgesetzt.
Nach Abtrennen destri-Calciumphosphats durch Zentrifugation (25min,
2000U/min, 0 bis -2°C) wird das Präzipitat entweder mit 50ml einer Pufferlösung (0,05mol/l Tris, 0,15mol/l Natriumchlorid, 0,001 mol/l Chelaplex Hl, pH 7,15) ein- oder zweimal gewaschen oder der Prothrombin komplex und das Antithrombin III werden unmittelbar in einer2stufigen Elution mit einer 0,05 mol/l Natriumzitrat enthaltenden Lösung freigesetzt, wobei bei der LElution 20,0 ml und bei der 2. Elution 10,0 ml eingesetzt werden. Die Dauer der Elution beträgt 25 min bei Raumtemperatur, wobei auf eine gründliche, eine Schaumbildung vermeidende Suspendierung des tri-Calciumphosphats zu achten ist.
Das nach Zentrifugation erhaltene Eluatwird mit 100IE Heparin/Transfusionseinheit nach Abschluß der LElution versetzt und anschließend bei -40°C tiefgefroren und abschließend lyophilisiert, wobei während der Eisphase eine Temperatur von -1O0C nicht überschritten wird. Im Anwendungsvolumen von 20ml (1 Transfusionseinheit) sind jeweils 200 bis 250 Einheiten Faktor II, 200 bis 250 Einheiten Faktor X, 200 bis 250 Einheiten Faktor IX und 220 bis 280 Einheiten Faktor VII enthalten. Im Mittel werden Ausbeuten von 65 bis 70% erreicht.
Die spezifische Aktivität der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X (angegeben in Einheiten Gerinnungsfaktor/mg Protein) beträgt 0,50 bis 0,75, wenn das Protein-Adsorbat nicht ausgewaschen wird. Durch Auswaschen des Protein-Adsorbats kann die spezifische Aktivität auf 1,2 bis 2,0 Einheiten Gerinnungsfaktor/mg Protein erhöht werden.
Werden wie im Ausführungsbeispiel angegeben zwischen 1,5 und 3,0g tri-Calciumphosphat eingesetzt, dann enthalten die Prothrombinkomplexkonzentrate zwischen 7 und 20mg Antithrombin III/TE bzw. zwischen 5 und 30 Einheiten biologisch aktives AT III/TE. Prothrombinkomplexkonzentrate, die mit der vorzugsweise eingesetzten Menge von 2,0g tri-Calciumphosphat hergestellt werden, enthalten im Mittel 22 Einheiten Antithrombin III, wenn zur Herstellung der Äthanol enthaltende Aedetatplasmaüberstand eingesetzt wird und 14 Einheiten Antithrombin III/TE, wenn Aedetatplasma ohne vorangegangene Alkoholfällung der Cohn-I-Fraktion eingesetzt wurde.
Der Quotient (NAPTTR) der nicht aktivierten partiellen Thromboplastinzeit nach Kingdon mit und ohne Zusatz einer 1:10 Verdünnung des Prothrombinkomplexkonzentrates, dem 100IE Heparin/TE nach Abschluß der LElution zugesetzt wurden, beträgt im Mittel 0,82 ± 0,08, die TGtso nach Sas beträgt mehr als 800min. In keinem der Präparate konnte Thrombin mit Fibrinogen als Substrat nachgewiesen werden.
Die Aktivität des Antithrombin III wurde amidolytisch mit Chromozym TH (Fa. Boehringer Mannheim) mit der kinetischen Methode bei 25°C nach den Angaben des Herstellers bestimmt.
Immunologisch bestimmt wurde das Antithrombin III mit M-Partigenplatten der Fa. Behring, Marburg, nach den Angaben des Herstellers. Die Aktivität der Gerinnungsfaktoren wurde mit entsprechenden Testbestecks der Firmen Behring, Marburg, bzw. Boehringer, Mannheim, nach den Angaben der Hersteller bestimmt.
Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung eines Prothrombinkomplexkonzentrates, das mindestens jeweils
200 Einheiten der Gerinnungsfaktoren II, VlI, IX und X, 5 bis 30 Einheiten Antithrombin Wund JOQ JE Heparin je Transfusionseinheit enthält, aus zitratfreiem stabilisiertem Humanplasma durch Adsorptionschromatographie unter Verwendung von tri-Calciumphosphat als Adsorptionsmittel, gekennzeichnet dadurch, daß eine Konzentration von 3,75 bis 7,50g tri-Calciumphosphat pro 1 Hu manplasma verwendet wird, der pH-Wert der Calciumphosphat-Plasma-Suspension 7,2 bis 8,2 beträgt, das Adsorbens-Protein-Präzipitat entweder unmittelbar zur Elution eingesetzt oder zuvor mit 10 bis 30%, bezogen auf Ausgangsvolumen, einer Waschflüssigkeit, bestehend aus 0,05mol/l Tris, 0,15mol/l Natriumchlorid und 0,001 mol/l Chelaplex III bei -20C bis 250C und einem pH-Wert von 7,1 bis 9,0 behandelt wird und anschließend der Prothrombinkomplex und das Antithrombin III durch zweistufige Elution mit 6,8 bis 7,5%, auf eingesetztes Plasmavolumen bezogen, einer Lösung bestehend aus 0,05mol/l Natriumzitrat und 0,01 mol/I Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 freigesetzt wird.
2. Verfahren nach Pkt. 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Ausgangsmaterial Aedetatplasma, Heparinplasma, lonenaustauschplasma oder der Äthanol enthaltende Aedetatplasmaüberstand der Cohn-I-Fraktion eingesetzt werden.
3. Verfahren nach Pkt. 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß zur Freisetzung eine nichtgepufferte 0,05mol/l Natriumzitratlösung in einer Menge von 6,8 bis 7,5%, auf eingesetztes Plasmavolumen bezogen, verwendet wird.
4. Verfahren nach Pkt. 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß alle Verfahrensstufen im geschlossenen System unter aseptischen Bedingungen bei Wahrung der Sterilität durchgeführt werden können.
5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß das Hepatitisrisiko durch die Beschränkung des für eine Charge eingesetzten Ausgangsmaterials auf ein 2-Spenderplasma bzw. einen 18-Spenderpool verringert werden kann.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD29259286A DD251078A1 (de) | 1986-07-17 | 1986-07-17 | Verfahren zur herstellung von prothrombinkonzentraten |
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| DD29259286A DD251078A1 (de) | 1986-07-17 | 1986-07-17 | Verfahren zur herstellung von prothrombinkonzentraten |
Publications (1)
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| DD29259286A DD251078A1 (de) | 1986-07-17 | 1986-07-17 | Verfahren zur herstellung von prothrombinkonzentraten |
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|---|---|
| DD (1) | DD251078A1 (de) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0700682A3 (de) * | 1994-08-26 | 1996-05-29 | Behringwerke Ag | Arzneimittel, enthaltend Prothrombin zur Antagonisierung von Blut-Anticoagulanzien |
| WO2005034990A1 (ja) * | 2003-10-09 | 2005-04-21 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | アンチトロンビンｉｉｉ含有止血用組成物 |
-
1986
- 1986-07-17 DD DD29259286A patent/DD251078A1/de not_active IP Right Cessation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0700682A3 (de) * | 1994-08-26 | 1996-05-29 | Behringwerke Ag | Arzneimittel, enthaltend Prothrombin zur Antagonisierung von Blut-Anticoagulanzien |
| WO2005034990A1 (ja) * | 2003-10-09 | 2005-04-21 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | アンチトロンビンｉｉｉ含有止血用組成物 |
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