DD252389A1 - Verfahren zur herstellung von cis-4-carboxymethylen-but-2-en-4-olid-auf mikrobiologischem wege - Google Patents
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Abstract
Ziel der Erfindung ist die Herstellung des genannten Methylenbutenolides, das als Biochemikalie fuer vergleichende biochemisch-analytische Untersuchungen auf dem Gebiet der Umweltforschung benoetigt wird. Darueber hinaus ist das cis-4-Carboxymethylen-but-2-en-4-olid als Stammverbindung zahlreicher natuerlicher und synthetisierter Wirkstoffe (mit z. T. ausgepraegter antibiotischer Aktivitaet gegen Pilze und Bakterien) von potentiellen Nutzen fuer die Herstellung neuer derartiger Wirkstoffe. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass an Anilin adaptierte Zellen eines Mikroorganismus der Gattung Rhodococcus mit der Faehigkeit zur Verwertung von Anilin unter unsterilen, aeroben Bedingungen in einer Pufferloesung mit 2-Chloranilin als Substrat und einer geeigneten organischen Kohlenstoffverbindung als Energiequelle fuer die Dauer von 8 Stunden bis 12 Stunden inkubiert werden und nach Zentrifugation die genannte Verbindung aus dem zellfreien Ueberstand isoliert und nachfolgend gereinigt wird.
Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von cis-^Carboxymethylen-but^-en-^olid auf mikrobiologischem Wege. Dieses Methylenbutenolid-Derivat ist eine Biochemikalie, die für vergleichende biochemisch-analytische Untersuchungen und enzymatische Teste sowie als authentischer Metabolit und Substrat bei angewandten mikrobiologischen Untersuchungen auf dem Gebiet der Umweltforschung benötigt wird. Des weiteren ist das Methylenbutenolid-Derivat als Stammverbindung zahlreicher natürlicher und synthetisierter Wirkstoffe, welche z.T. starke antibiotische Aktivität gegen Pilze und Bakterien aufweisen und als Fungizide bzw. Pflanzenwuchshemmstoffe Bedeutung erlangten, von potentiellem Nutzen für die Herstellung neuer, derartiger Wirkstoffe.
4-Carboxymethylenbutenolid wurde erstmals 1951 durch Cyclodehydratisierung von Dihydro-ß-ketomuconsäure gewonnen und beschrieben, wobei zur Konfiguration der Verbindung keine Angaben gemacht wurden (Eisner, U. et. al., J.Chem. Soc, 1501, [1951]). Dieses Syntheseverfahren ist nicht sehr attraktiv, da daß Methylenbutenolid-Derivat nur in sehr geringen Ausbeuten erhalten wird.
Auf Grund der zahlreichen Anwendungen und der Bedeutung der Methylenbutenolide als biologisch aktive Naturstoffe sind in einer Reihe von Arbeiten verbesserte Verfahren zur Synthese und Trennung der stereoisomeren 4-Carboxymethylenbutenolide beschrieben worden (Ingham, C. F. etal., Austr. J.Chem., 28,2499 [1975]; Massy-Westropp, R. A. et al., Austr. J. Chem., 33,333 [1980]; Doyle, J. R., Austr. J. Chem., 35,1903 [1982]). Diese Synthesen führen jedoch über eine Reihe von chemischen Reaktionen mit z.T. geringen Ausbeuten, benötigen zudem teure Einsatzstoffe und erfordern eine aufwendige Trennung der gebildeten Stereoisomere, so daß sie derzeit nicht ökonomisch erscheinen. Über Gewinnung, Eigenschaften, Biochemie und Anwendung
der Methylenbutenolide liegen Übersichtsarbeiten vor (Dean, F. M.: Naturally Occurring Oxygen Ring Compounds, Butterworths, 1963; Rao, Y.S., Chem. Rev., 76,625 [1976]; Pattenden, G., in: Progr. Chem. Org. Nat. Prod., 35,133 [1978]). Ein Verfahren zur Herstellung von cis-4-Carboxymethylen-but-2-en-4-olid auf mikrobiologischem Wege ist bisher nicht bekannt. Bekannt ist hingegen, daß beim mikrobiologischen Abbau von verschiedenen Halogenaromaten als Bestandteile von Pestiziden bzw. Herbiziden (4-Chlorphenoxyessigsäure-Evans, W. C. et al., Biochem. J., 122,509 [1971]; 4-Chlor-2-methylphenoxyessigsäure-Gaunt, J. K. et al., Biochem. J., 122,533 [1971]; 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-Evans, W. C. et al., Biochem. J., 122,543 [1971];
4-Fluorbenzoesäure-Schreiber, A. et als., Appl. environr Microbiöl., 39,58 [1980]; 3-Chloranilin-Janke, D. et al., Zs. AIIg. Mikrobiol., 24,583.[1984]) u.a. 4-Carboxymethylenbutenolide gebildet werden. Da jedoch bei den aufgeführten mikrobiellen Abbauprozessen die Akkumulation der intermediär gebildeten Butenolid-Metabolite nicht sehr ausgeprägt ist, kommen sie für eine Verfahrensentwicklung zur Butenolidgewinnung aus ökonomischen Gründen nicht in Betracht.
Die Erfindung hat die einfache und billige Herstellung von cis-4-Carboxymethylen-but-2-en-4-olid zum Ziel.
Der Erfindung liegt die Aufgabe ;zugrunde,ein mikrobiologisches Verfahren zu beschreiben, nach dem cis-4-Carboxymethylenbut-2-en-4-olid in guten Ausbeuten aus leicht zugänglichen Einsatzstoffen hergestellt werden kann.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß ein Anilin-verwertender Mikroorganismus der Gattung Rhodococcus zunächst in einer Anzuchtstufe unter aeroben Bedingungen submers in Gegenwart von Anilin fermentiert undnachfolgend in einer Konversionsstufe das Substrat 2-Chloranilin durch die so an Anilin adaptierten Mikrobenzellen zu cis-4-Carboxymethylenbut-2-en-4-olid umgesetzt wird.
Eingesetzt wurden der Mikroorganismus Rhodococcus sp. An 117, hinterlegt in der ZIMET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW der DDR, DDR — 6900 Jena, Beutenbergstr. 11, unter der Registriernummer ZIMET 11178 und der Mikroorganismus Rhodococcus sp. An 213, hinterlegt unter der Registriernummer 11182.
Ausgehend von Konserven des jeweiligen Rhodococcusstammes, die (nach Prauser, H., 1984. In: Kocur, M. und Da Silva, E., Proceedings of the 4. Int. Conf. on Culture Collections, Seite 109-115) über flüssigem Stickstoff erhalten werden, wird ein flüssiges, vorher sterilisiertes Nährmedium beimpft und in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 25°C und 320C, vorzugsweise 280C, über einen Zeitraum von 15 Stunden bis 25 Stunden, vorzugsweise 18 Stunden, bei einer Acidität vo'n pH 6,0 bis pH 7,5, vorzugsweise pH 6,9, kultiviert. Das Nährmedium besteht aus Anilin als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle (in einer Konzentration von 0,6g/l bis 1,0g/l) sowie aus anorganischen Salzen.
Die angezüchteten, an Anilin adaptierten Zellen werden abzentrifugiert, mit einer Pufferlösung, pH6,0 bis pH 7,5, vorzugsweise pH 6,9, gewaschen, danach in einer unsterilen Pufferlösung (pH 6,0 bis pH 7,5, vorzugsweise pH 6,9) resuspendiert und bei einer Temperatur zwischen 25°C und 320C, vorzugsweise 28°C, über einen Zeitraum von 8 Stunden bis 12 Stunden, vorzugsweise 10 Stunden, in Gegenwart von 2-Chloranilin als Substrat und einer anderen organischen Kohlenstoffverbindung, vorzugsweise Glukose, als Energiequelle bei mäßiger mechanischer Rührung inkubiert. Bei Beendigung der Konversionsstufe ist ein vollständiger Umsatz des Substrates zu verzeichnen.
Die Isolierung des gebildeten cis-4-Carboxymethylen-but-2-en-4-olides wird in der Weise durchgeführt, daß die Substanz nach Abzentrifugieren der Zellen aus dem Überstand nach Ansäuern bei einer Acidität von pH 1,8 bis pH 2,8, vorzugsweise pH 2,4, mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Ether, extrahiert wird. Nach Trocknen und Eindampfen der vereinigten Extrakte wird ein Rohprodukt erhalten, aus dem das Methylenbutenolid durch Chromatographie und Umkristallisation als reine Verbindung erhalten wird.
Hierbei resultiert eine Ausbeute an cis-4-Carboxymethylen-but-2-en-4-olid von 35% bis 45% der Theorie.
Eigenschaften des cis-4-Carboxymethylen-but-2-en-olides
Farblose, mikrokristalline Substanz aus Methylenchlorid.
Fp: 167T; Summenformel: C6H4O4; M: 140;
Massenspektrum m/z: M+gef.: 140,0130; ber.: 140,0110;
Fragmentierung: m/z 123 (M+-OH); 112 (M+-CO); 95 (M+-COOH); 84 (M+-2C0); 69 (M+-COOH-C2H2).
IR-Spektrum (KBr): 1780,1680,1630,1 550cm"1
UV-Spektrum Umax): 277nm (H2O; smol —15264)
1H-NMR-Spektrum: Die Daten der 'H-NMR-Analyse sind in Tab. 1 zusammengefaßt. Sie sind charakteristisch für das cis-4-Carboxy-methylen-but-2-en-4-olid (Formel, Abb. 1).
Cis^-Carboxymethylen-but^-en^-olid kann als authentischer Metabolit angesehen werden, der als Vergleichssubstanz für biochemisch-analytische Untersuchungen und enzymatische Teste sowie als Substrat bei mikrobiologischen Untersuchungen auf dem Gebiet der Umweltforschung verwendet werden kann. Als Stammverbindung zahlreicher natürlicher und synthetisierter Wirkstoffe mit z. T. stark antibiotischer Wirkung gegen Pilze und Bakterien ist das Methylenbutenolid von potentieller Bedeutung für die Herstellung neuer derartiger Wirkstoffe (Fungizide, Pflanzenwuchshemmstoffe).
Die Vorteile eines mikrobiologischen Verfahrens zur Herstellung von cis-4-Carboxymethylen-but-2-en-4-olid liegen darin, daß
— die Konversion des Substrates stereospezifisch verläuft und das cis-4-Carboxymethylen-but-2-en-4-olid in relativ guten Ausbeuten erhalten wird,
— nur leicht zugängliche und billige Einsatzstoffe benötigt werden,
— die Konversion des Substrates unsteril erfolgen kann und
— die Isolierung des gebildeten Methylenbutenolidesaus dem zellfreien Überstand, der neben geringen Mengen an organischen Nebenprodukten nur organische Salze enthält, sehr einfach durchzuführen ist.
Die Erfindung wird durch nachfolgende Ausführungsbeispiele näher erläutert, jedoch nicht eingeschränkt.
1. Zwölf 500 ml Steilbrustflaschen werden mit je 100 ml des folgenden Anzucht-Mediums gefüllt: Anilin 0,70 g
- Dinatriumhydrogenphosphat x 12H2O 6,00g
Kaliumdihydrogenphosphat ' 1,00g
Magnesiumsulfat χ 7 H2O 0,20 g
Calciumchlorid 0,10g
Eisensulfat χ 7 H2O 2,50 mg
Borsäure 0,50 mg
Kaliumiodid 0,10 mg
Mangansulfat x 4 H2O 0,40 mg
Zinksulfat-x 7 H2O 0,40 mg
Natriummolybdat χ 2 H2O 0,20 mg
Kupfersulfat χ 5H2O 0,10 mg
in Aqua destillata, 1 Liter.
Sterilisierung: 30 Minuten 120°C; pH6,9 nach Sterilisierung.
Jede Steilbrustflasche wird mit einer Suspension von Mycelfragmenten beimpft, welche mit steriler, isotonischer Kochsalzlösung von einer im Reagenzglas auf folgendem Anzucht-Nährboden gezüchteten 1 bis 3 Tage alten Kultur des Stammes Rhodococcus sp. An 117 hergestellt wird: ~~~
Bacto-Pepton 10,00 g
Hefeextrakt 5,00 g
Casamino acids 5,00 g
Beef-Extrakt 2,00 g
Malz-Extrakt 5,00 g
Glycerin 2,00 g
Magnesiumsulfat χ 7 H2O 1,00 g
Tween80 0,05 g
in Aqua destillata, 1 Liter.
Sterilisierung: 30 Minuten bei 1200C; nach der Sterilisierung liegt die Acidität zwischen pH 6,5 und pH7,0. Die beimpften Anzucht-Kulturen werden 18 Stunden bei 28°C auf einem Schütteltisch mit einer Frequenz von 180 U/Min, bebrütet, vereinigt und die gewaschenen, an Anilin adaptierten Zellen mittels Zentrifugation (Zentrifuge: K70,40 Minuten, 3000 U/Min.) abgetrennt. Die geernteten und mit 0,1 M Phosphatpuffer-Lösung (pH 6,9) gewaschenen Zellen werden bei einer Biomassekonzentration von 0,6 mg Zelltrockenmasse/ml in einem 2-Liter-Gefäß inkubiert, das 1 Liter des folgenden Mediums enthält:
Glukose 0,20 g
2-Chloranilin 0,14 g
in 0,1 M Phosphatpuffer, 1 Liter (pH 6,9).
Während der Konversion, die bei mäßiger mechanischer Rührung ausgeführt wird, liegt die Temperatur bei 280C. Nach lOstündiger Konversion wird ein vollständiger Umsatz des Substrates 2-Chloranilin erreicht.
1 Liter Kulturflüssigkeit, die man so erhält, wird zentrifugiert (K70,40 Minuten, 3000 U/Min.); der zellfreie Überstand wird abgetrennt und nach Ansäuern auf pH 2,4 mit verdünnter Salzsäure 3mal mit je 300 ml Ether extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden über Natriumsulfat (Wasserfrei) getrocknet und im Vakuumrotationsverdampfer bis zurTrockne eingeengt. Der Rückstand wird zunächst auf üblichem Wege säulenchromatographisch gereinigt und dann aus Methylenchlorid umkristallisiert
Ausbeute: 60 mg, d.h. 43% der Theorie an cis^-Carboxy-methylen-buW-en^-olid
2. Man verfährt wie im Beispiel 1, mit dem Unterschied, daß die von 12 Liter Anzucht-Kulturlösung geernteten Zellen in einem 32-Liter-Glasfermenter, der 10 Liter des folgenden Mediums enthält, inkubiert werden:
Glukose 0,20 g
2-Chloranilin 0,16 g
in 0,1 Phosphatpuffer (pH 6,9).
3. Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß als Mikroorganismus Rhodococcussp. An 213 eingesetzt wird. Die erreichbare Ausbeute liegt in der im Beispiel 1 angegebenen Größenordnung.
1H-NMR-Daten von cis^-Carboxymethylen-but^-en^-olid (in DMSO-de und CDCI3) und die des entsprechenden Methylestersal (Werte in Klammern)
| DMSO-d6 | CDCI3 | 6,53 (6,48) 8,37 (8,40) 5,96(5,93) b) | 5,6 1,9 0,6 | |
| chemische Verschiebungen (ppm) | Kopplungskonstanten (Hz) | |||
| H-2 H-3 H-5 COOH | 6,83 • 8,34 6,00 13,05 | 5,6 1,9 0,9 | ||
| J 2,3 J2,5 J3,5 |
a) Literaturwerte nach A. Schreiber et al., Appl. en viron. Microbiol., 39,58 (1980)
b) Signal in CDCI3 nicht erhalten
Die Protonen resonanzspektren wurden mit einem 100-MHz-FT-Spektrometer der Firma Tesla aufgenommen. Die angegebenen chemischen Verschiebungen sind auf Tetramethylsiian (TMS) als inneren Standard bezogen.
COOH
.H
Abb.1
-4 a36- 371714
Claims (7)
1. Verfahren zur Herstellung von cis^-Carboxymethylen-but^^-olid auf mikrobiologischem Wege, gekennzeichnet durch die Anzucht eines anilinverwertenden Mikroorganismus der Gattung Rhodococcus unter aeroben Bedingungen submers mit Anilin als einziger Kohlenstoff-, Stickstoff- und Energiequelle, der nachfolgenden mikrobiellen Konversion des Substrates 2-Chloranilin zu cis-4-Carboxymethylen-but-2-en-4-olid und der abschließenden Isolierung und Reinigung des Konversionsproduktes in an sich bekannter Weise.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet durch die Verwendung des Mikroorganismus Rhodococcus sp. An 117.
3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet durch die Verwendung Mikroorganismus Rhodococcus sp. An 213.
4. Verfahren nach Punkt 1 und 2 oder 3, gekennzeichnet durch
— die Anzucht der.Mikroorganismen für die Fermentation in einem flüssigen Nährmedium, das als Kohlenstoff-, Stickstoff-und Energiequelle Anilin in einer Konzentration von 0,6g/l bis 1,0g/l sowie Mineralsalze enthält, bei einer Temperatur von 25°C bis 320C während eines Zeitraumes von 15 bis 25 Stunden bei einer Acidität von pH 6,0 bis pH 7,5
—· eine nachfolgende Konversionsstufe in derdieAnilin-adaptierten Zellen abzentrifugiert werden, in einer Pufferlösung, die neben 2-Chloranilin als Substrat eine andere organische Kohlenstoffverbindung als Energiequelle enthält, bei Temperatur- und Aciditätswerten in den voranstehend genannten Bereichen für 8 bis 12 Stunden inkubiert werden und
— aus dem mittels Zentrifugation enthaltenen zellfreien Überstand nach Ansäuern bei einer Acidität von pH 1,8 bis pH 2,8 mit einem organischen, mit Wasser nicht oder nur wenig mischbaren Lösungsmittel ein Rohprodukt extrahiert wird, aus welchem nach Einengung bis zur Trockne sowie Chromatographie und Umkristallisation reines cis^-Carboxymethylen-but^-en-4-olid gewonnen wird.
5. Verfahren nach Punkt 1 und 4, gekennzeichnet durch die Einstellung der Acidität auf pH 6,9 und der Temperatur auf 28°C sowohl in der Anzucht- als auch in der Konversionsstufe.
6. Verfahren nach Punkt 1 und 4, gekennzeichnet durch die Verwendung von Glukose als Energiequelle bei der Konversion des Substrates.
7. Verfahren nach Punkt 1 und 4, gekennzeichnet durch die Extraktion mit Ether als Lösungsmittel bei einem pH-Wert von 2,4.
Hierzu 1 Seite Zeichnung
Priority Applications (1)
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| DD29411486A DD252389A1 (de) | 1986-09-04 | 1986-09-04 | Verfahren zur herstellung von cis-4-carboxymethylen-but-2-en-4-olid-auf mikrobiologischem wege |
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