DD253433A1 - Verfahren zur massenanzucht von bakterienzellen mit typm-abbauvermoegen fuer phenole - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Massenanzucht von Bakterienzellen, welche die Faehigkeit zum oxidativen Abbau von Phenol und einigen Phenolderivaten ueber den meta-Weg des mikrobiellen Aromatenstoffwechsels (Typ-M-Abbauvermoegen) aufweisen. Sie verfolgt das Ziel, derartige Bakterienzellen in grossen Mengen und in hoher Effektivitaet bereitzustellen. Die diesem Ziel zugrunde liegende Aufgabe wird in der Weise geloest, dass - Phl -Subkulturen (d. h. Subkulturen mit der induzierbaren genetischen Potenz zum Typ-M-Abbau von Phenol) des Mikroorganismus Pseudomonas putida ZIMET 11054 oder einer seiner Varianten diskontinuierlich unter aeroben, sterilen Bedingungen in einer Naehrloesung, die Glukose als Kohlenstoffquelle sowie Natriumsalicylat als Induktor des Phenol abbauenden Enzymsystems enthaelt, kultiviert und-nach vollstaendigem Verbrauch der Kohlenstoffquelle die in der Kultur gewachsenen Bakterienzellen durch Zentrifugationgeerntetwerden.
Description
Hierzu 2 Seiten Zeichnungen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Massenanzucht von Bakterienzellen mit Typ-M-Abbauvermögen für Phenol und einige Phenolderivate, d. h. mit der Fähigkeit zum oxidativen Abbau dieser toxischen aromatischen Verbindungen über den meta-Weg des mikrobiellen Aromatenstoffwechsels.
Potentielle Anwendungsgebiete der Erfindung sind die biologischeDetoxifikation von mit phenolischen Verbindungen belasteten Industrieabwässern sowie die Synthese bestimmter organischer Verbindungen mittels gezielter Biotransformation phenolischer Ausgangsstoffe.
Eine Reihe von Bakterien, darunter Pseudomonas putida Stamm H und andere Stämme der Art Pseudomonas putida, verfügt bekanntermaßen über die genetische Potenz, Phenol und Cresole oxidativ über den meta-Weg des mikrobiellen Aromatenstoffwechsels abzubauen (Typ-M-Abbau) und als Wachstumssubstrat zu nutzen (Bayly et al., Biochem. J., 101, 292-301,1966; Feistund Hegemann, J. Bacteriol., 100,869-877,1969; Ribbons, Arch. Microbiol., 74,103-115,1970; Sala-Trepat et al., Eur. J. Biochem., 28, 347-356,1972; Buswell, J. Bacteriol., 124,1077-1083,1975; Janke et al., Zs. AIIg. Mikrobiol., 21, 295-303, 1981). Der Abbau und die Verwertung von Phenol und dessen Derivaten durch Bakterien unterliegt einer Substrathemmung, d. h. bereits bei geringen Konzentrationen diese toxischen Substrate wird der bakterielle Stoffwechsel maßgeblich gehemmt (Jones et al.,J. gen. Microbiol., 74,139-148,1973; Pawlowsky und Howell, Biotechnol. Bioeng., 15, 889-896,1973; Hill und Robinson, Biotechnol. Bioeng., 17,1599-1615,1975; Janke et al., Zs. AIIg. Mikrobiol., 21, 295-303,1981).
Eine entscheidende Voraussetzung für die Ausprägung des Phänotypes PhI+, d. h. für die Realisierung der genetischen Potenz zum Phenolabbau in den Bakterienzellen, ist die Anwesenheit eines geeigneten (metabolisierbarenh oder nichtmetabolisierbaren) Induktors, welcher die Neusynthese der beteiligten degradativen Enzyme bewirkt. Das Induktionsverhalten von Pseudomonas putida Stamm H und anderen Stämmen der Art Pseudomonas putida ist nun dadurch gekennzeichnet, daß allein das jeweilige phenolische Primärsubstrat (oder ein entsprechend wirksamer nicht-metabolisierbarer Induktor) die Neusynthese aller für seinen oxidativen Abbau über den meta-Weg erforderlichen Enzyme induziert (Feist und Hegeman, 1969 a.a.O.; Sala-Trepat et al., 1972 a.a.O.; Janke et al., 1981 a.a.O.).
Bisher wurden in Laboruntersuchungen unter Verwendung von Stämmen der Art Pseudomonas putida folgende Verfahren für die Anzucht von Bakterienzellen mit Typ-M-Abbauvermögen für phenolische Verbindungen angewandt: — diskontinuierliche Kultivierung der Zellen mit Phenol (100-300g/l) bzw. mit einem der Cresol-Isomere (100 bis 300 mg/l) als einziger Kohlenstoffquelle (Sala-Trepat et al., 1972 a.a.O.; Janke et al., 1981 a.a.O.); Entscheidende Nachteile dieses Verfahrens sind das Auftreten von lag-Phasen bis zu 10 Stunden im Wachstumsverlauf
sowie eine durch die jeweilige, toxische Kohlenstoff quelle bedingte Substrathemmung des ZeI I Wachstums. Die zwangsläufig gering zu wählende Substratausgangskonzentration erlaubt zudem nur eine sehr geringe Raum-Zeit-Ausbeute an Typ-M-abbauaktiven Bakterienzellen.
— kontinuierliche Kultivierung der Zellen im Chemostaten mit Phenol als einziger Kohlenstoffquelle (Pawlowsky und Howell, 1973 a.a.O.; Hill und Robinson, 1975 a.a.O.; Janke et al., 1981 a.a.O.);
Dieses Verfahren bietet— nach einmaligem Erreichen eines Fließgleichgewichtszustandes (steady-state) — zwar die Möglichkeit einer kontinuierlichen Produktion von Bakterienzellen mit Typ-M-Abbauvermögen für Phenole, jedoch können hohe Raum-Zeit-Ausbeuten an derartigen Bakterienzellen nur bei Verwendung großvolumiger Chemostat-Apparaturen, hoher Konzentrationen des toxischen Substrates im Chemostat-Zulauf sowie von Durchflußraten nahe Dc (Auswaschungsrate) erzielt werden. Dies erfordert einen hohen apparativen Aufwand und eine ständige Prozeßkontrolle.
— diskontinuierliche Kultivierung der Zellen mit Natriumsuccinat (2,7g/l) bzw. Natriumacetat (2,7 g/l) als Hauptkohlenstoffquelle in Gegenwart von Phenol (235mg/l) als Induktor des phenolabbauenden Enzymsystems (Feist und Hegeman, 1969 a.a.O.);
Dieses Verfahren basiert auf dem Einsatz von Hauptkohlenstoffquellen (Natriumsuccinat bzw. -acetat), deren Bereitstellung in größeren Mengen einen hohen ökonomischen Aufwand erfordert. Das als Induktor eingesetzte Phenol unterliegt zudem einem Totalabbau durch die wachsende Zellkultur und steht somit nur für eine begrenzte Zeitdauer als Induktor zur Verfügung. Um einer „Ausverdünnung" der induzierten, für den Typ-M-Abbau erforderlichen Enzyme nach Verbrauch des Phenols vorzubeugen, ist eine aufwendige Prozeßkontrolle erforderlich.
— diskontinuierliche Kultivierung der Zellen mit Natriumacetat (2,7 g/l) bzw. Natriumsuccinat (2,7 g/l) als Kohlenstoffquelle in Gegenwart von Benzylalkohol (270mg/l) bzw. 2,6-Dimethylphenol (220mg/l) als nicht-metabolisierbarem Induktor des phenolabbauenden Enzymsystems (Feist und Hegeman, 1969 a.a.O.);
Dieses Verfahren gewährleistet zwar die zeitlich unbegrenzte Präsenz des (nicht-metabolisierbaren) Induktors in der wachsenden Zellkultur, erfordert aber gleichfalls den Einsatz von Kohlenstoffquellen, deren Bereitstellung in größeren Mengen mit einem hohen ökonomischen Aufwand verbunden ist. Die Typ-M-Abbauaktivität von Zellen, die in Gegenwart von 2,6-Dimethylphenol kultiviert wurden, beträgt zudem nur ca. 10% im Vergleich zu mit Phenol als einziger Kohlenstoffquelle vorkultivierten Zellen.
Ziel der Erfindung ist die effektive Massenanzucht von Bakterienzellen mit Typ-M-Abbauvermögen für Phenol und Phenolderivate.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches mikrobiologisches Verfahren zu beschreiben, das die Massenanzucht von Bakterienzellen mit Typ-M-Abbauvermögen für Phenol und Phenolderivate mit hoher Raum-Zeit-Ausbeute bei Verwendung leicht zugänglicher und kostengünstiger Einsatzstoffe ermöglicht
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe in ihren Grundzügen wie folgt gelöst:
Phl+-Subkulturen des Mikroorganismus' Pseudomonas putida Stamm H oder einer seiner Varianten (z. B. Pseudomonas putida PG306) werden diskontinuierlich unter aeroben, sterilen Bedingungen in einer Nährlösung kultiviert, welche Glukose als gut verwertbare Kohlenstoffquelle und Natriumsalicylat als nicht-metabolisierbaren Induktor des phenolabbauenden Enzymsystems enthält. Die eingesetzten Mikroorganismen Pseudomonas putida Stamm H sowie seine Variante PG 306, deren Typ-M-Abbauvermögen für Phenol und einige Phenolderivate in der beiliegenden Übersicht (Tabelle) näher charakterisiert ist, sind in der ZIMET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR, Beutenbergstr. 11, Jena, 6900, unter den Registriernummern ZIMET 11054 bzw. ZIMET 11179 hinterlegt worden.
Die Kultivierung der Phl+-Subkulturen von Stamm H Pseudomonas putida oder seiner Variante Stamm PG 306 wird in Glasfermentern verschiedenen Inhalts oder in V2A-Stahltanks durchgeführt und erfolgt bei pH-Werten der Nährlösung im Bereich von 6,0 bis 8,0, bei einer Kultivierungstemperatur von 250C bis 320C, wobei der Induktor Natriumsalicylat in einer Konzentration von 100mg/1 bis 250mg/1 vorliegt. Nach vollständigem Verbrauch der eingesetzten Kohlenstoffquelle, d.h. nach Beendigung der Zunahme der optischen Dichte der Zellkultur, werden die Typ-M-abbauaktiven Bakterienzellen mittels Zentrifugation „geerntet" und ohne weitere Konservierungsmaßnahmen innerhalb von 10 Stünden in an sich bekannter Weise entweder in mit phenolischen Verbindungen belastete Industrieabwässer eingetragen oder für die Synthese bestimmter organischer Verbindungen (z. B. zweifach hydroxylierte aromatische Verbindungen wie Brenzkatechine) durch gezielte Biotransformation phenolischer Ausgangsstoffe verwendet
Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens ist durch folgende Kultivierungsparameter gekennzeichnet:
— diskontinuierliche Kultivierung von Pseudomonas putida Stamm H oder seine Variante PG 306 unter sterilen, aeroben Bedingungen
— pH-Wert der Nährlösung: 6,5 bis 7,6
— Kultivierungstemperatur: 280C bis 3O0C
— Kohlenstoffquelle: Glukose in einer Ausgangskonzentration von 2,0g/l bis 5,0g/l
— Natriumsalicylat-Ausgangskonzentration: 150mg/l bis 220mg/l (die jeweilige Induktormenge wird der Nährlösung zu Beginn der Kultivierung unter sterilen Bedingungen zugesetzt)
— Kultivierungsdauer: 10 Stunden bis 20 Stunden
Auskunft über die verfahrensgemäß erreichbaren Ausbeuten an Typ-M-abbauaktiver Zellmasse von Stamm H Pseudomonas putida bzw. Stamm PG 306 unter den Bedingungen der bevorzugten Ausführung geben die bei liegenden Abbildungen 1 und 2. Die Vorteile des beschriebenen Verfahrens zur Massenanzucht von Bakterienzellen mit Typ-M-Abbauvermögen für Phenole liegen darin begründet, daß
— leicht zugängliche, ökonomisch unaufwendig bereitstellbare Einsatzstoffe (Glukose, Natriumsalicylat) verwendet werden
— auf Grund einer kurzen lag-Phase von ca. 2 Stunden und eines exponentiellen (nicht-gehemmten) Zellwachstums mit einer Verdoppelungszeit von ca. 2 Stunden hohe Raum-Zeit-Ausbeuten an Typ-M-abbauaktiven Bakterienzellen erreicht werden, wobei durch Verwendung des nicht-toxischen, nicht-metabolisierbaren Induktors Natriumsalicylat die für Phenol und Cresole typische Hemmung des bakteriellen Zellwachstums umgangen wird
— praktisch keine Prozeßkontrolle erforderlich ist.
Ein 2,5-Liter-Sulfierkolben enthält 1 Liter einer Nährlösung, die sich aus folgenden Komponenten zusammensetzt: 1.
| Komponente: | 2,5 g |
| D-Glukose | 0,20 g |
| Natriumsalicylat | |
| in Aqua destillata, 250 ml | |
| Komponente: | 0,5 g |
| Dinatriumhydrogenphosphat χ 12 H2O | 0,14g |
| Kaliumdihydrogenphosphat | |
| in Aqua destillata, 250 ml | |
| Komponente: | 0,5 g |
| Ammoniumnitrat | 0,2 g |
| Magnesiumsulfat χ 7 H2O | 0,1g |
| Kalziumnitrat | 2,5 mg |
| Eisensulfat χ 7H2O | 0,5 mg |
| Borsäure | 0,4 mg |
| Mangansulfat χ 4 H2O | 0,4 mg |
| Zinksulfat x 7 H2O | 0,2 mg |
| Natriummolybdat χ 2 H2O | 0,1 mg |
| Kaliumiodid | |
| in Aqua destillata, 500 ml | |
Die 3 Komponenten werden getrennt 25 Minuten bei 120°C sterilisiert und nach Erkalten unter sterilen Bedingungen vereinigt. Der pH-Wert der kompletten Nährlösung beträgt 7,5.
Die fertige Nährlösung wird mit einer konzentrierten Zellsuspension beimpft, welche durch Abschwemmen einer auf Nähragar gezüchteten 24 Stunden alten Emerskultur (Phl+-Phänotyp) des Stammes Pseudomonas putida H mit sterilem Leitungswasser hergestellt wird. Die Animpfdichte der Kultur wird so gewählt, daß sie einer Ausgangsbiomasse-Konzentration von 0,045 mg Zelltrockenmasse/ml entspricht. Anschließend erfolgt die Kultivierung des beimpften Ansatzes im Sulfierkolben bei einer Temperatur von 3O0C über einen Zeitraum von 15 Stunden bei mechanischer Rührung.
Nach vollständigem Verbrauch der Glukose, d.h. nach Beendigung der Zunahme der optischen Dichte der Zellkultur, werden die Typ-M-abbauaktivierten Bakterienzellen mittels 40minütigerZentrifugation bei 3000U/Min. in einer Zentrifuge des Typs K70 (Fa. Janetzki, DDR) geerntet. Die mit Hilfe der Methode von Kaminskietal. [Zs. AIIg. Mikrobiol., 23, 235-246,1983]) ermittelte Biomasse-Endkonzentration in der Kultur entsprach einer Gesamtausbeute an Typ-M-abbauaktivierter Zelltrockenmasse von 1,355g.
Phl+-Zellen des Stammes PG 306 werden, wie im Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, über einen Zeitraum von 15 Stunden kultiviert und nach vollständigem Verbrauch der Glukose mittels Zentrifugation geerntet. Die ermittelte Biomasse-Endkonzentration in der Kultur entsprach einer Gesamtausbeute an Typ-M-abbauaktivierter Zelltrockenmasse von 1,402 Gramm
Übersicht:
Angaben zur Charakterisierung des Typ-M-Abbauvermögens von verfahrensgemäß kultivierten Zellen der Stämme ZIMET 11054 und ZIMET 11179 für Phenol und einige Phenolderivate.
Die für die Aktivitätsbestimmung verwendete Methode basiert auf der polarographischen Messung des Sauerstoff-Verbrauches durch „ruhende" Zellsuspensionen, welcher durch den oxidativen Umsatz der eingesetzten phenolischen Substrate bedingt ist (Jankeet al., Zs. AIIg. Mikrobiol., 24, 305-316,1984). Die Ausgangskonzentration der eingesetzten Testsubstrate in den Versuchsansätzen betrug jeweils 0,3,u.Mole/ml.
Testsubstrat Sauerstoff-Verbrauch
ZIMET11054 ZIMET11179
Qo2-Werteal/in % Qo2-Wertea)/in %
Phenol
o-Cresol
m-Cresol
p-Cresol
2,4-Dimethylphenol 3,5-Dimethylphenol 2,3-Dimethylphenol 4-Chlorphenol
| 118bl | 100 |
| 170 | 144 |
| 110 | 93 |
| 105 | 89 |
| 51 | 43 |
| 25 | 21 |
| 72 | 61 |
| 59 | 50 |
| 108 | 100 |
| 148 | 137 |
| 97 | 90 |
| 96 | 89 |
| 49 | 45 |
| 22 | 20 |
| 66 | 61 |
| 54 | 50 |
Testsubstrat Sauerstoff-Verbrauch
ZIMET11054 ZIMET11179
Qo2-Werteal/in % Qo2-Wertea)/iη %
4-Nitrophenol 3-Aminophenol 2-Methoxyphenol
a) ausgedrückt in/il O2 pro Stunde pro mg Zelltrockenmasse
bl dieser Wert entspricht nach Janke et al. (1981 a. a. 0.) einem Umsa.tz von 1,18μΜοΙβη bzw. 0,11 mg Phenol pro Stunde pro mg Zelltrockenmasse
| 14 | 12 |
| 40 | 34 |
| 28 | 24 |
| 13 | 12 |
| 38 | 35 |
| 27 | 25 |
Claims (6)
1. Verfahren zur Massenanzucht von Bakterienzellen mitTyp-M-Abbauvermögen für Phenol und Phenolderivate, gekennzeichnet durch die diskontinuierliche Kultivierung von Phl+-Subkulturen des Stammes Pseudomonas putida unter aeroben, sterilen Bedingungen in einer mineralischen Nährlösung, welche Glukose und Natriumsalicylat enthält und Ernte der in der Kultur gewachsenen Bakterienzellen mittels Zentrifugation nach vollständigem Verbrauch der Glukose.
2. Verfahren nach Pkt. 1, gekennzeichnet durch die Verwendung des Stammes 4 von Pseudomonas putida oder seiner Variante Pseudomonas putida PG 306.
3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet durch den Einsatz von Natriumsalicylat in einer Ausgangskonzentration von 100 mg/l bis 250 mg/l und von Glukose in einer Ausgangskonzentration von2g/lbis10g/l.
4. Verfahren nach Pkt. 3, gekennzeichnet durch den Einsatz von 150 mg/l bis 220 mg/l Natriumsalicylat und 2,0g/l bis 5,0g/l Glukose.
5. Verfahren nach Pkt. 1 und 2, gekennzeichnet durch die Kultivierung bei einer Temperatur von 250C bis32°Cund bei pH-Werten im Bereich von pH6,0 bis pH8,0.
6. Verfahren nach Pkt. 5, gekennzeichnet durch die Kultivierung bei 280C bis 3O0C und pH 6,5 bis pH 7,6.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD29529986A DD253433A1 (de) | 1986-10-16 | 1986-10-16 | Verfahren zur massenanzucht von bakterienzellen mit typm-abbauvermoegen fuer phenole |
Applications Claiming Priority (1)
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| DD29529986A DD253433A1 (de) | 1986-10-16 | 1986-10-16 | Verfahren zur massenanzucht von bakterienzellen mit typm-abbauvermoegen fuer phenole |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD253433A1 true DD253433A1 (de) | 1988-01-20 |
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ID=5583098
Family Applications (1)
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|---|---|
| DD (1) | DD253433A1 (de) |
-
1986
- 1986-10-16 DD DD29529986A patent/DD253433A1/de not_active IP Right Cessation
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