DD254030A1

DD254030A1 - Verfahren und mittel zur bestimmung von enzymaktivitaeten

Info

Publication number: DD254030A1
Application number: DD29675686A
Authority: DD
Inventors: Hans-Dieter Hunger
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1986-11-27
Filing date: 1986-11-27
Publication date: 1988-02-10

Abstract

Anwendungsgebiet sind Gentechnik, Molekularbiologie, Biotechnologie und Medizin. Zellysate oder Zellextrakte werden mit einem Flaechentraeger aus natuerlichen und/oder synthetischen Polymeren mit deprotonisierbaren Gruppen in Gegenwart von 32P-g-ATP und gegebenenfalls ATP in Kontakt gebracht. Das phosphorylierte Antibiotikum wird durch Autoradiographie oder eine andere Nachweistechnik sichtbar gemacht.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf Verfahren und dazu notwendige Mittel zur Bestimmung der Enzymaktivitäten. Anwendungsgebiet sind die Gentechnik, Molekularbiologie, Biotechnologie und Medizin.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Es sind bereits eine Reihe von Methoden zum Nachweis und zur Analyse der Expression klonierter Gene entwickelt worden. Durch die Koloniehybridisierung können Clone schnell im Hinblick auf spezifische DNS-Sequenzen untersucht werden. In Immunoassays wiederum sind die Clone, die spezifische Antigene produzieren-, nachweisbar; Mit Hilfe der Rekombinanten-Technik können in Zellen (z.B. Bakterien) Genabschnitte oder Gene für bestimmte Proteine eingebracht werden. Zur Selektion von Rekombinanten werden u.a. Resistenzgene gegen Antibiotika benutzt. Die Resistenz gegen Antibiotika beruht dabei meist auf der Wirkung von entsprechenden Enzymen, die von den Resistenzgenen codiert werden, auf die Antibiotika. In Kolonie-Tests lassen sich dann resistente von nicht resistenten Zellen unterscheiden. ' .

Zur Bestimmung der Resistenz-Enzymaktivität können z. B. an feste Phasen gebundene Antibiotika verwendet werden, die in Gegenwart eines Substrates nur die Resistenz-Gene enthaltenden Zellen wachsen lassen. Dazu sind an feste Phasen gebundene Antibiotika notwendig. Die Bindung von Antibiotika und anderen Medikamenten an feste Phasen ist bekannt. Diese Bindung wird vorzugsweise über kovalente Bindungen durchgeführt.

Durch die Hydrolyse dieser Bindungen in vivo wird dann eine gesteuerte Wirkstoffabgabe möglich. Die Herstellung solcher Produkte sowie ihre Anwendung wird z. B. von S. Dumitriu et al., Cellulose Chemistry and Technology (1985), 19, S. 601 und S. 609 beschrieben. Als feste Phase dienen hier Cellulosederivate, an die z. B. 6-Aminopenicillansäure, 7-Aminocephalosporansäure, Tetracyclin, Ampicillin, Kanamycin, Neomycin, Chloramphenicol oder Oxytetracyclin gebunden werden. Allgemein wird festgestellt, daß diese Art der Kopplung eine niedrige Reaktivität ergibt.

Eine weitere Möglichkeit der Kopplung von Antibiotike an feste Phasen ist die Nutzung quarternisierbarer Stickstoffatome der Antibiotika zur Bindung an saure Ionenaustauscher. Die nach diesem Verfahren hergestellten Produkte werden z. B. zur Bestimmung der Neomycin-Phosphotransferase aus Zellextrakten verwendet, wie es von B.Reiss, R.Sprengel, H. Will und H. Schaller in Gene 30 (1984), S. 211-218 beschrieben wird. Als feste Phase wird hierein handelsübliches Phosphatcellulose-Papier verwendet, bei dem die Phosphatgruppen direkt über die OH-Gruppen der Cellulose verknüpft sind. Bei diesem relativ

aufwendigen Verfahren wird das Resistenz-Enzym zunächst in einem Polyacrylämid-Gel elektrophoretisch aufgetrennt, danach in einer zusätzlich aufgebrachten Agaroseschicht³²P-y-ATP und Kanamycin (nicht trägerfixiert) als Substrate unter Enzym-Reaktionsbedingungen angeboten und anschließend versucht, das phosphorylierte Kanamycin auf Phosphatcellulose-Papier durch eine Kapillarblotting-Technik zu übertragen. Nachteile des Verfahrens sind der Arbeitsschritt mit Radioaktivität enthaltender Agarose, die Vielzahl der Arbeitsschritte, die erforderliche Waschung mit heißem Wasser (80⁰C) (Verluste) und die langen Waschzeiten (3 bis 16 Stunden), um den Untergrund des Trägermaterials zu reduzieren. Im Ergebnis erhält man diffuse Autoradiographien, die bei komplexen Aufgabenstellungen eine Auswertung erschweren oder gar unmöglich machen. Von V. I. Kiselev, A. F. Gorkun und V. O.Rechinski wird in Anal. Biochem. (1985) 146, S.434 ein Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität in Bakterienkoionien unter Verwendung von Kanamycin, das an Carboxymethylcellulose (CM-Cellulose) ist, beschrieben. Mit dieser Methode gelingt nur der Kolonienachweis.Die diffuse Autoradiographie kann darauf hinweisen, daß ein Teil des Kanamycins vom Träger durch die sehr enge Bindung an die Cellulose abgewaschen werden kann. Zu diesem Verfahren ist insgesamt zu sagen, daß derivatisierte Celluloseträger dieser Art, bei denen Cellulosederivate mit direkter Kopplung der ionisch aktiven Gruppe an die Cellulosekette verwendet werden, mechanisch relativ instabil sind und eine nicht ausreichend feste Bindung des Antibiotikums an den Träger ergeben.

Ein weiteres Anwendungsgebiet gebundener Antibiotika ist die Reinigung pharmazeutischer Zusammensetzungen, wie sie in der JP-OS 61-76.418 beschrieben wird. Es wird beschrieben, daß durch Bromcyan aktivierte Sepharose in einem Puffermedium mit Paromomycin beladen wird und so ein Material für Säulenfüllungen hergestellt wird, mit dem aus den o.g. Zusammensetzungen pyrogene Stoffe entfernt werden.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren unter Verwendung eines verbesserten Mittels zur qualitativen und quantitativen Bestimmungen der Enzymaktivität phosphorylierender Enzyme zur Verfügung zu stellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem mittels an feste Phasen gebundener Antibiotika die Aktivität von Enzymen bestimmt werden kann.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß ein Lysat oder ein Extrakt oder ein aufgetrenntes Enzym mit einem Flächenträger aus natürlichen und/oder synthetischen Polymeren mit deprotonisierbaren Gruppen, die mindestens über zwei Atome von dem Grundgerüst des Polymeren getrennt und an die über ionische Wechselwirkungen Antibiotika oder Hemmstoffe gebunden sind, in Gegenwart von ³²P-y-Adenosintriphosphat und gegebenenfalls Adenosintriphosphat in ansich üblichen Reaktionsmedien in Kontakt gebracht und das phosphorylierte Antibiotikum oder der phosphorylierte Hemmstoff, durch Autoradiographie oder eine andere Nachweistechnik sichtbar gemacht wird.

Es hat sich bei den Untersuchungen der Enzymaktivität aus Zeilysaten oder aus in Elektrophoresegelen aufgetrennten Enzymen gezeigt, daß sich die Reaktivität der Antibiotika oder Hemmstoffe weitestgehend erhalten läßt, wenn zwischen der Hauptkette des festen Trägermaterials und dem Antibiotikum eine größere Gruppe, ein sog. Spacer, vorhanden ist. Diese trennenden Einheiten weisen je nach verwendetem Enzym und entsprechend den angewendeten Reaktionsbedingungen jeweils eine optimale Länge auf. Sie können aus verschiedenen chemischen Gruppierungen bestehen, z.B. aus Alkylgruppen mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen, aus gegebenenfalls substituierten Phenylgruppen, Aralkylgruppen, gegebenenfalls substituierten Heterozyklen, Alkylenoxygruppen, Alkylenthiogruppen usw. bestehen. Es ist auch möglich, zwei oder mehrere solcher Gruppierungen miteinander zu kombinieren. Wichtig ist, daß schließlich endständige, deprotonisierbare Gruppen erhalten werden. Als solche kommen in erster Linie Carbonsäure-und Sulfonsäuregruppen in Frage, es ist aber auch möglich, endständige Phosphonsäure-, Phosphorsäure-, Sulfinsäure- oder sauer Phenolgruppen zu verwenden. Als Antibiotika oder Hemmstoffe werden solche verwendet, die mindestens ein quarternisierbares Stickstoffatom aufweisen und die durch Enzyme phosphorylierbar sind. In erster Linie werden als Enzyme Phosphortransferasen verwendet. Beispiele für Antibiotika sind Kanamycin, Neomycin, Paromomycin, Framomycin, Aminosidin und Streptomycin. Beispiele für die Phosphortransferasen sind Neomycin-Phosphotransferase und Kanamycin-Phosphotransferase (Aminoglucosid-Phosphotransferasen).

Als Träger, auf die deprotonisierbare Gruppierungen substituiert werden, kommen natürliche und künstliche Polymere oder deren Gemischein Frage. Besonders bevorzugt werden Träger auf der Basis von Cellulose, die in Form von Pulver, Granulat oder Fasern, in letzterer Form als Flächenträger, z. B. in Papierform, vorliegen kann. Cellulose kann mit verschiedenen Reagenzien aktiviert werden, z. B. mit 2,4,6-Trihalogen-s-triazinen, Bromcyan, Aminosilanen und/oder Epoxysilanen. Weiterhin kann die so aktivierte Cellulose oder auch nicht vorbehandelte Cellulose mit Polyethylenimin oder mit Polyaminen umgesetzt werden. Auf die aktivierte Cellulose werden dann reaktive chemische Verbindungen gebunden, die außerdem noch eine deprotonisierbare Gruppe aufweisen. Solche Verbindungen sind z. B. Dicarbonsäuren, die in Gegenwart von Kondensationsmitteln mit der aktivierten Cellulose zur Reaktion gebracht werden, oder Aminocarbonsäuren wie 3-Aminobuttersäure, Anthranilsäure usw., von denen die Aminogruppe mit der reaktiven Gruppe der substituierten Cellulose umgesetzt wird, oder Aminosulfonsäure, die ebenso mit den aktivierten Polymeren umgesetzt werden.

Als Reaktion zur Einführung der deprotonisierbaren Gruppen kommen Substitution, z.B. bei der Aktivierung von Polymeren mit 2,4,6-Trihalogen-s-triazinen und deren Umsetzung mit Amino-Verbindungen, Kondensation, z. B. bei der Umsetzung von Aminogruppen mit Carbonsäuregruppen in Gegenwart von Kondensationsmitteln wie Carbodiimiden, oder Pfropf- ,

Copolymerisationen von ungesättigten Verbindungen mit deprotonisierbaren Gruppen, z. B. bei der Pfropfung von Cellulose mit Acrylsäure oder mit Acrylsäureestern und anschließender Hydrolyse oder bei der Pfropfung von Polyethylenimin-behandelter Cellulose mit solchen Verbindungen oder mit Styrensulfonsäure, in Frage.

Die Lyse der Bakterien erfolgt entweder durch speziell dafür geeignete Puffer, z. B. mit 2OmMTHs-HCL, pH 8,0,0,1 % Triton X-100 und 0,5% Lysozym, oder durch Beschallung mit anschließendem Zentrifugieren, und feste Bestandteile zu entfernen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann nun an den rohen Lysaten durchgeführt werden. Mehr Aussagen werden jedoch erhalten, wenn die Lysate vor dem Nachweis der Enzymaktivität elektrophoretisch aufgetrennt werden und dann die Banden einzeln oder

zusammen, gegebenenfalls nach Transfer auf einen Träger, als phosphorylierendes Enzym nachgewiesen worden. Üblich ist z.B. die Trennung von Proteinen an Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen (SDS-PAA-Gelen, Laemmli-Gelen). Überraschend können auch die aus den L'ysaten erhaltenen Enzyme an solche Gelen getrennt und bestimmt werden. Der Nachweis der Enzymaktivität erfolgt entweder direkt aus dem Gel oder nach dem Transfer der Proteine auf ein flächiges Trägermaterial in Gegenwart von markiertem (z. B. ³²P) und unmarkiertem Adenosintriphosphät.

Diese Technik kann prinzipiell auch zur Bestimmung der Größe von Fusionsproteinen verwendet werden. Dazu werden Lysate von Rekombinanten hergestellt, die innerhalb des Resistanz-Genes Informationen für ein weiteres Protein enthalten und dieses exprimieren. Nach elektrophoretischer Auftrennung wird durch den Kontakt mit den erfindungsgemäßen, an feste Phasen gebundenen Antibiotika in Gegenwart z. B. von ³²P-y-Adenosintriphosphat die Größe der Fusionsproteine und die erzeugte Menge bestimmt. Auch in diesem Falle sind SDS-PAA-GeIe besonders vorteilhaft, da sie eine sehr exakte Bestimmung des Molekulargewichts erlauben. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zwischen resistenten und nicht resistenten Mikroorganismen unterschieden, indem aufgetüpfelte oder elektrophoretisch getrennte Lysate, die phosphorylierende Enzyme enthalten, in Gegenwart von markiertem Adenosintriphosphät mit einem erfindungsgemäßen Produkt, einem an eine feste Phase gebundenen Antibiotikum, in Kontakt gebracht werden. Auf diesem Wege können vorteilhaft Antibiotikum-resistente von nicht resistenten Bakterienkolonien unterschieden werden, indem die Kolonien lysiert und nach der Lyse' mit dem erfindungsgemäßen Antibiotikum enthaltenden Träger in Gegenwart des Substrates in Kontakt gebracht werden. Weiterhin lassen sich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Punkttests durchführen, indem Lysate direkt auf ein Antibiotikum enthaltende feste Phase, bevorzugt einen Flächenträger, aufgetüpfelt werden und anschließend y-markierte Adenosintriphosphät zugegeben wird.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Proteine oder Enzyme zunächst auf einen Träger, z. B. Nitrocellulose, Polyamidmembran oder aktivierte Cellulose transferiert und dieser Komplex mit dem ein Antibiotkum enthaltenden Flächenträger in Gegenwart von y-markiertem ATP in Kontakt gebracht. Andererseits ist es möglich, den Transfer aus den Gelen direkt auf den das Antibiotikum enthaltenden Flächenträger durchzuführen. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Enzymaktivität quantitativ in Enzympräparationen ,bestimmt. Nach dieser Verfahrensvariante werden normierte Flächen oder Mengen der erfindungsgemäßen, mit Antibiotika beladenen festen Phase in Teströhrchen oder in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit einer normierten Menge der Enzympräparation in Kontakt gebracht, dazu oder nach dem Abziehen dieser Präparation in einer festgelegten Zeiteinheit eine bestimmte Menge ³²P-y-ATP zugesetzt, diese bei 37°C in einem üblicherweise angewandten Puffer inkubiert, gewaschen und anschließend in einem Szintillations-Zähler gemessen oderautoradiographiert. Dieses Verfahren läßt sich für eine größere Anzahl von Präparationen parallel durchführen und maschinell auswerten.

Als Enzyme werden vorzugsweise Phosphotransferasen verwendet. Beispiele sind Neomycin-Phosphotransferase (NPTII) und Kanamycin-Phosphotransferase (Aminoglycosid-Phosphotransferasen).

Ein wesentlicher Teil des erfindungsgmäßen Verfahrens sind die dabei zu verwendenden festen Phasen, an die die Antibiotika gebunden sind. Es hat sich überraschend gezeigt, daß die kovalente Bindung der Antibiotika an feste Phasen zu deren weitgehender oder vollständiger Inaktivierung führt. Die Verwendung von Cellulosederivaten mit direkt gekoppelten sauren Gruppen, z. B. Phosphatcellulose oder Carboxymethylcellulose, brachte eine wesentliche Verbesserung, jedoch keine vollständige Nutzbarkeit der Antibiotika, diffuse Autoradiogramme und mechanisch relativ instabile Träger. Es wurde nun gefunden, daß diese Nachteile der bekannten Verfahren beseitigt werden, wenn zwischen der Kette des natürlichen und/oder synthetischen Polymeren und der deprotonisierbaren Gruppe, z. B. einer Carbonsäure- oder Sulfonsäuregruppe, eine längere Gruppierung von mindestens zwei Atomen, vorzugsweise jedoch vier oder mehr Atome oder carbocyclische und/oder heterozyklische Ringe angeordnet werden. Folglich werden erfindungsgemäß Flächenträger zur Verfugung gestellt, die aus

a) einem natürlichen und/oder synthetischen Polymeren,

b) einer daran gekoppelten Spacergruppe mit mindestens zwei Atomen,

c) einer an diese Spacergruppe gebundenen deprotonisierbaren Gruppe

d) an die deprotonisierbare Gruppe durch Protonisierung eines quartemisierbaren Sticktoffatoms des Antibiotikums gebundenes, phosphorylierbares Antibiotikum

bestehen. Bevorzugt werden Flächenträger mit papierähnlicher Struktur und mit folgendem Aufbau:

a) Cellulose,

b) daran unter Abspaltung von Halogenwasserstoffsäure gebundenen 2,4,6-Trihalogen-s-triazin-Einheiten,

c) an die durch die verbliebenen Halogenatome gekennzeichneten Kohlenstoffatome durch Substitution durch eine NH-, SH- oder OH-Gruppe einer diese Gruppen enthaltenden Carbon- oder Sulfonsäure,

d) an die Sulfonsäure- oder Carbonsäurereste über ionische Wechselwirkungen mit quartemisierbaren Aminogruppen eines oder mehrerer Antibiotika gebundene Antibiotika.

Ein besonders günstiger Flächenträger mit gebundenen Antibiotika wird aus makromolekularen Massen mit chemisch-aktiven Füllstoffen nach DD-WP 154622, dessen Derivatisierung nach DD-WP 237844 und der Umsetzung mit Antibiotika erhalten. Dieser besteht folglich aus

a) makromolekularen Massen mit chemisch aktiven Füllstoffen, bestehend aus

aa) 1 bis 80 Vol.-% einer makromolekularen Verbindung mit4,6-Dihalogen-1,3,5-triazin-Gruppierungen,

ab) 0,5 bis 50Vol.-% eines oder mehrerer 2,4,6-Trihalogen-1,3,5-triazine,

ac) bis zu 20VoI.-% eines oder mehrerer Metallhalogenide,

ad) 5 bis 80 Vol.-% einer makromolekularen Verbindung sowie gegebenenfalls Puffersubstanzen und Dispergiermitteln,

b) an diese durch Dehydrohalogenierung und Substitution gebundene Carbon-oder Sulfonsäuren,

c) an die Carbon- oder Sulfonsäurereste über ionische Wechselwirkungen gebundene, mindestens ein quartemisierbares Stickstoffatom enthaltende Antibiotika oder Hemmstoffe.

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit auf leicht zugänglichem Wege an feste Phasen gebundene Antibiotika zur Verfügung, die ihre volle Wirksamkeit auch nach längerer Lagerzeit behalten. Damit ist insbesondere für den Nachweis der Enzymaktivität in exprimierten Bakterienkolonien ein wesentlicher Fortschritt zur schnellen und quanitativen Bestimmung getan. Bei der Verwendung von Flächenträgern als Grundlage der Umsetzung wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Mittel mit einer hohen Kapazität zur Verfügung gestellt. Das Substrat weist eine sehr feste Bindung auf und bleibt unter diesen Bedingungen gut phosphorylierbar. Bei dem direkten Kontakt mit Bakterienkulturen bleibt eine hohe Schärfe des Signals erhalten. Durch Waschungen mit Wasser ist das Signal auch nicht auswaschbar.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt damit erstmalig die Bestimmung der Enzymaktivität aus Trenngelen heraus direkt auf dem Trägermaterial sowie den Transfer aus SDS-Gelen (Polyacrylamid-Gele mit Natriumdodecylsulfat). Außerdem wird es durch das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, bei Reihenkulturen die bereits erreichte Enzymaktivität oder bei Wachstumsprozessen die Veränderung über der Zeit in großer Zahl durchzuführen und maschinell auszuwerten. Die spezielle Oberfläche der Träger erlaubt die Anfärbung der Proteine mit Coomassie-Brillantblau, ohne daß der Träger eine Untergrundfärbung aufweist. Neben diesen Vorteilen weisen die erfindungsgemäßen festen Phasen mit daran gebundenen Antibiotika, bedingt durch das vorteilhafte Herstellungsverfahren, eine hohe mechanische Stabilität auf.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1: Herstellung einer festen Phase mit Antibiotikum

Es wird eine makromolekulare Masse mit chemisch aktiven Füllstoffen nach DD-WP 154622 wie folgt hergestellt: Cellulose-Papierwird 15 Minuten in 3 η NaOH unter leichtem Schütteln umgesetzt. Dieses Produkt wird nach Abquetschen der größten Menge an Natronlauge in ein Aktivierungsbad aus 5,5Gew.-% Cyanurchlorid, 50Gew.-% Xylen und 44,5Gew.-% Aceton 30 Minuten unter leichtem Schütteln aktiviert, anschließend mit Aceton bzw. Aceton/Essigsäure gewaschen und getrocknet. Das so erhaltene Produkt wird in eine Lösung aus 10Gew.-%des Natriumsalzes der Sulfanilsäure, die durch Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt wurde, gegeben und 5 Stunden unter leichtem Schütteln umgesetzt. Dieses Produkt wird fünfmal mit destilliertem Wasser jeweils 15 Minuten gewaschen und schließlich in eine Lösung aus 1,5Gew.-% Kanamycinsulfat, die mit Triethanolamin auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt worden ist, gegeben und darin unter leichtem Schütteln 5 Stunden inkubiert. Man erhält dadurch ein Trägermaterial, das mit Kanamycin beladen ist.

Beispiel 2: Bestimmung der Enzymaktivität nach Gelelektrophorese

Ein Lysatvon Bakterien mit und ohne Kanamycin-Resistenzgen wird auf ein SDS-PAA-GeI gegeben und die Proteine durch Gelelektrophorese aufgetrennt. Danach wird das Gel 15 Minuten ineiner Lösung von 2OmMoI Tris-HCI-Puffer, pH = 7,2; 125mMol Ammoniumchlorid, 1 mMol Dithiothreitol, 1OmMoI Magnesiumchlorid, 2 mMol ³?P-y-ATP (verdünnt auf eine spezifische Aktivität von 0,3mCi/mMol) inkubiert.

Der nach Beispiel 1 hergestellte Träger und 3 Lagen dickes Filterpapier werden mit der gleichen Lösung getränkt. Es wird folgender Aufbau verwendet: Zuunterst eine Glasplatte, darauf die drei Lagen getränktes Filterpapier, darauf das Gel, anschließend der getränkte, erfindungsgemäße Träger mit Kanamycin, darauf eine Lage nicht getränktes, dickes Filterpapier, einige Lagen Zellstoff, schließlich wieder eine Glasplatte und ein Gewicht von etwa 100g. Dieser Aufbau wird in einem geschlossenen Plastegefäß 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach wird die Versuchsanordnung auseinandergenommen. Zunächst wird das Gel mit Coomassie-Brillantblau angefärbt. Im Ergebnis wird ein komplettes Restbandenmuster festgestellt, d.h. aus dem Gel wurde nichts auf den Träger transferiert.

Der erfindungsgemäße Träger, der vom Gel vorher getrennt wurde, wird 4mal 15 Minuten in Wasser gewaschen und getrocknet. Anschließend wird autoradiographiert (2 Stunden bei Zimmertemperatur). Die Autoradiographie zeigt nach dem Entwickeln in der Position, an der im Gel die Phosphotransferase unter den vielen Lysat-Proteinen vorhanden war, sehr scharfe und der Menge des vorhandenen Enzyms proportionale Schwärzungen (Banden), d. h. diese lassen sich dem Enzym und dessen Menge bzw. Aktivität genau zuordnen. Anhand angefärbter Markerproteine lassen sich die Molekulargewichte des Enzyms und der Fusionsproteine genau bestimmen.

Beispiel 3: Herstellung eines erfindungsgemäßen Mittels .

Aus 0,165 Mol Polyethylenglykol 600, 0,83 Mol Ethylenglykol und 1 Mol Diphenylmethandiisocyanat (MDI) in 1,61 Dimethylformamid wird bei 65-70⁰C innerhalb von 1 Stunde eine Polyurethanlösung hergestellt. Dieser Lösung wird eine Lösung von 7,5Gew.-% Polystyrensulfonsäure (M_n ~ 5000) in Dimethylformamid derart zugesetzt, daß die Lösung einen endgültigen Feststoffgehalt von 13,2 Gew.-% aufweist. Nach der Zugabe dieser Lösung wird weitere 4 Stunden bei70°C unter Rühren umgesetzt. Anschließend wird auf Zimmertemperatur abgekühlt. Mit Hilfe eines Ziehrakels werden 0,4mm starke ' Schichten dieser Lösung auf Glasplatten hergestellt und in Wasser koaguliert. So werden Membranen mit Sulfonsäuregruppen erhalten. Eine Membran von 15 x 15cm Größe wird in einer Glasschale 3 Stunden mit einer Lösung von 1 Gew.-% Neomycinhemisulfat in Wasser inkubiert. Danach wird gewaschen und getrocknet.

Beispiel 4: Test zur Unterscheidung von Bakterienkolonien mit und ohne Neomycin-Resistenzgen

Es wurden E.coli Bakterien des Stammes DH1 mit und ohne Plasmid, das das Neogen desTN-5 enthielt, auf Agarplatten unter üblichen Bedingungen angezogen. Nach 12 Stunden wurde die Agarplatte mit den Kolonien mit einer Nitrocellulosefolie belegt und weiter kultiviert. Nach weiterensechs Stunden wurde diese Folie vorsichtig abgenommen und in folgendem Versuchsaufbau eingesetzt: Auf eine Glasplatte werden drei Schichten dickes Filterpapier, die mit dem gleichen Puffer wie in Beispiel 2 getränkt sind, gelegt, darauf wird das erfindungsgemäße Mittel nach Beispiel 3 gelegt, auf dieses der Nitrocellulosefilm mit den lysierten Kolonien (Lyse durch Inkubieren in einem Lysepuffer aus 2OmMoI Tris-HCI, pH = 8,0; 0,1 %Triton X-100 und 5mg/ml Lysozym, 10 Minuten bei Zimmertemperatur), darauf wieder einige Lagen dickes Filterpapier, eine Glasplatte und ein Gewicht von 250g. Diese Anordnung wird in einer Plastbox eine Stunde bei 37⁰C gehalten. Schließlich wird der Aufbau auseinandergenommen, das beladene erfindungsgemäße Mittel mehrfach gewaschen und autoradiographiert. Die Positionen auf der Agarplatte, an denen die Kolonien mit der,n Neogen gezogen worden waren, wiesen sich durch sehr starke, scharfe Signale nach 2 Stunden aus, während an den Stellen der Kolonien ohne das Neogen keine Signale (Schwärzungen) auftraten.

Beispiel 5

Eine makromolekulare Masse mit chemisch aktiven Füllstoffennach Beispiel 1 wird innerhalb von 2 Stunden mit einer 5%igen, wäßrigen Lösung von Polyethylenimin,diemit 1 η HCI auf einen pH-Wert von 7,6 eingestellt wurde, umgesetzt. Das Produkt wird mit Wasser 3 χ 15 Minuten gewaschen und getrocknet.

a) Ein Teil des so hergestellten, mit Polyethylenimin modifizierten Trägers wird mit 4-Chlor-benzen-sulfonsäure in einem Gemisch ausTetrahydrofuran und Acetonitril umgesetzt. Die Umsetzung wird über Nacht bei Zimmertemperatur unter leichtem Schütteln durchgeführt. Anschließend wird an der Luft abtrocknen gelassen und 5mal je 15 Minuten mit Wasser

gewaschen. Dieser Träger wird mit einer 2,5 mM Lösung von Neomycin über Nacht geschüttelt. Anschließend wird mit Wasser gewaschen und getrocknet. Es wird ein Antibiotikum enthaltendes Trägermaterial mit hoher Beladungsdichte und Reaktivität erhalten.

b) Ein weiterer Teil des so hergestellten, Flächenträgers wird in einer benzolischen Lösung mit etwa 15% Aceton und 5Gew.-% Bernsteinsäure in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid über Nacht geschüttelt. Anschließend wird nacheinander mit Benzen, Aceton und erneut mit Aceton gewaschen, an der Luft getrocknet und mehrmals mit Wasser gewaschen. Danach wird wie oben mit einer 2,5 ml Lösung von Kanamycin in Wässer über Nacht geschüttelt. Anschließend wird 2 χ mit Wasser je 15 Minuten gewaschen. Es wird eine Matrix hoher Reaktivität und hoher Beladungsdichte hergestellt.

Beispiele

Es wird wie in Beispiel 1 verfahren, jedoch wird an Stelle der Sulfanilsäure 3-Aminobuttersäure eingesetzt. Anschließend wird dieser, mit endständigen COOH-Gruppen ausgerüstete Träger, mit Neomycin in 0,001 M Lösung bei einem pH-Wert von 7,0 umgesetzt. Diese Umsetzung wird in 8 Stunden durchgeführt. Anschließend wird zweimal mit Wasser gewaschen. Der so hergestellte, mit Neomycin beladeneTrägerwird zur Bestimmung der Aktivität von Neomycin-Phosphotransferase aus Kolonien verwendet und zeichnet sich durch hohe Reaktivität und Bandentreue aus.

Beispiel 7

Es wird eine Polyurethanlösung aus 1 Mol Triethylenglykol, 1,2 Mol 4,4'-Diphenylmethandiisocyanat in Dimethylformamid mit einer Endkonzentration von 12,5Gew.-% hergestellt. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten bei 65°C wird dem Gemisch 0,12 Mol Sulfanilsäure in kleinen Portionen zugesetzt. Anschließend wird 3 Stunden bei 8O⁰C unter Rühren nach reagiert. Aus dieser Lösung werden durch Beschichten von Glasplatten mit 0,4mm starken Schichten und anschließender Koagulation in Wasser asymmetrische Membranen hergestellt, die an der Oberfläche Sulfonsäuregruppen aufweisen. Ein solcher Träger wird mit einer 1 mM Lösung von Kanamycin bei einem pH-Wert von 7,0 eine Stunde-behandelt und anschließend mit Wasser gewaschen. Es wird ein Flächenträger hergestellt, der eine hohe Reaktivität im Enzymaktivitätstest aufweist.

Beispiel 8

Lysate von E.coli Bakterien, die ein Plasmid mit und ohne Neomycin-Resistenzgen enthalten, werden in eine Tüpfelplatte mit flachen Vertiefungen eingebracht. Durch Auflegen des erfindungsgemäßen Trägers nach Beispiel 5a wird das Lysat entsprechend des Musters der Tüpfel platte aufgenommen.

Anschließend wird der Träger wie in Beispiel 4 weiterbehandelt. Die Auswertung erfolgt durch Autoradiographie, auf der die Lysate von den resistenten Bakterienkolonien als schwarze Punkte erscheinen.

Claims

1. Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der Enzymaktivität phosphorylierender Enzyme in Zellysaten oder Zellextrakten gegebenenfalls nach elektrophoretischer Auftrennung der darin enthaltenen Proteine durch den Nachweis der enzymatischen Aktivität mittels Phosphorylierung von Antibiotika oder Hemmstoffen, gekennzeichnet dadurch, daß das Lysat oder der Extrakt oder das aufgetrennte Enzym mit einem Flächenträger aus natürlichen und/oder synthetischen Polymeren mit deprotonisierbaren Gruppen, die mindestens über zwei Atome von dem Grundgerüst des Polymeren getrennt und an die über ionische Wechselwirkungen Antibiotika oder Hemmstoffe gebunden sind, in Gegenwart von ³²P-y-Adenosintriphosphat und gegebenenfalls Adenosintriphosphat in an sich üblichen Reaktionsmedien in Kontakt gebracht und das phosphorylierte Antibiotikum durch Autoradiographie oder eine andere Nachweistechnik sichtbar gemacht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Substrate für phosphorylierende Enzyme Antibiotika mit mindestens einem quarternierbaren Stickstoffatom verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß Phosphotransferasen verwendet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Träger Cellulose verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß.die Cellulose mit 2,4,6-Trihalogen-striazin, Bromcyan, Aminosilanen oder Epoxysilanen aktiviert und gegebenenfalls mit Polyaminen oder Polyethylenimin umgesetzt und auf den so erhaltenen Träger deprotonisierbare Gruppe aufgebracht werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß die deprotonisierbaren Gruppen durch Substitution, Kondensation oder Pfropf-Copolymerisation an das Polymer oder an das aktivierte oder an das modifizierte Polymer gebunden werden.

7. Verfahren nach Anspruch !,gekennzeichnet dadurch, daß elektrophoretisch getrennte Zellysate eingesetzt werden, wobei eine oder mehrere Banden als phosphorylierendes Enzym nachgewiesen werden.

8. Verfahren nach Anspruch 1 und 7, gekennzeichnet dadurch, daß die elektrophoretische Trennung der Proteine und/oder Fusionsproteine an Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen (SDS-PAA-Gelen) erfolgt und in den so aufgetrennten Proteinen das/die phosphorylierenden Enzyme nachgewiesen werden.

9. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß Zellysate von verschiedenen Rekombinanten mit im Plasmid befindlichen Antibiotika-Resistenzgenen elektrophoretisch aufgetrennt werden und die Größe der Fusionsproteine bestimmt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, gekennzeichnet dadurch, daß die Auftrennung in SDS-PAA-Gelen erfolgt.

11. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß auf Tüpfeltests oder nach elektrophoretischer Auftrennung von Lysaten, die phosphorylierende Enzyme enthalten, zwischen resistenten und nicht-resistenten Mikroorganismen unterschieden wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß Bakterienkolonien nach deren Lyse nach Antibiotikum-resistenten und -nicht-resistenten Kolonien unterschieden werden.

13. Verfahren nach Anspruch !,gekennzeichnet dadurch, daß ein Punkttest durchgeführt wird, indem Lysate direkt auf den Antibiotikum enthaltenden Flächenträger aufgetüpfelt und anschließend das Substrat zugegeben wird.

14. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Proteine zunächst auf einen Träger wie Nitrocellulose, Polyamid oder aktivierte Cellulose transferiert und dieser Komplex mit dem Antibiotikum enthaltenden Flächenträger in Gegenwart eines Substrates in Kontakt gebracht wird.

15. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Proteine direkt aus Gelen auf den das Antibiotikum enthaltenden Flächenträger transferiert werden.

16. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Enzymaktivität quantitativ in Enzympräparationen durch In-Kontakt-Bringen mit einem ein Antibiotikum enthaltenden Flächenträger bestimmt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, gekennzeichnet dadurch, daß das Enzym eine Phosphotransferase ist.

18. Mittel zur Bestimmung der Enzymaktivität, gekennzeichnet dadurch, daß es ein Flächenträger ist, der aus

a) einem natürlichen und/oder synthetischen Polymeren,

b) einer daran gekoppelten Spacergruppe mit mindestens zwei Atomen,

c) einer an diese Spacergruppe gebundenen deprotonisierbaren Gruppe,

d) an die deprotonisierbare Gruppe durch Protonisierung eines quarternierbaren Stickstoffatoms des Antikbiotikums gebundenes, phosphorylierbares Antibiotikum besteht.

19. Flächenträger nach Anspruch 18, gekennzeichnet dadurch, daß er besteht aus

a) Cellulose,

c) an die durch die verbliebenen Halogenatome gekennzeichneten Ko hie η stoff atome durch Substitution durch eine NH-, SH- oder OH-Gruppe einer diese Gruppen enthaltenden Carbonoder Sulfonsäure,

d) an die Sulfon- oder Carbonsäurereste über ionische Wechselwirkungen mit quarternierbaren Aminogruppen eines oder mehrerer Antibiotika gebundene Antibiotika.

20. Flächenträger nach Anspruch 1.9, gekennzeichnet dadurch, daß er besteht aus

a) makromolekularen Massen mit chemisch aktiven Füllstoffen, bestehend aus

aa) 1 bis 80Vol.-% einer makromolekularen Verbindung mit4,6-Dihalogen-1,3,5-triazin-Gruppierungen,

ab) 0,5 bis 50 Vol.-% eines oder mehrerer 2,4,6-Trihalogen-1,3,5-triazine,

ac) bis zu 20Vol.-% eines oder mehrerer Metallhalogenide,

b) an diese durch Dehydrohalogenierung gebundene Carbon- oder Sulfonsäuren,

c) an die Carbonsäure- oder Sulfonsäurereste über ionische Wechselwirkungen gebundene, mindestens ein quarternierbares Stickstoffatom enthaltende Antibiotika oder Hemmstoffe.