DD259045A1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung von c-reaktivem protein (crp) - Google Patents

Abstract

Objekt der Erfindung ist die quantitative Bestimmung eines Serumproteins, genannt C-reaktives Protein. Ihr Anwendungsgebiet ist die klinische Laboratoriumsdiagnostik, da die Konzentration des CRP im Serum und anderen Koerperfluessigkeiten Rueckschluesse zulaesst auf den gesundheitlichen Zustand der untersuchten Patienten bzw. auf den gesundheitlichen Zustand von Tieren. Die Konzentrationsbestimmung wird durchgefuehrt als Ligandimmunoassay, d. h., es kommen Ligand-Traeger-Konjugate sowie markierte a-CRP-Konjugate zum Einsatz. Durch das hier beschriebene Verfahren ergibt sich eine erhebliche Testzeitverkuerzung und Einsparung von spezifischen bzw. monoklonalen Antikoerpern, deren Herstellung und Reinigung aufwendig ist, von etwa 90%, wodurch das Verfahren kostenguenstig ist. Vorteile ergeben sich weiterhin bei bestimmten Problemproben mit hohem Rheumafaktorgehalt. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass zur Bindung des CRP fuer die Benetzung der festen Phase in einem Zweiseitenbindungsassay einfach herstellbare Ligand-Traeger-Konjugate benutzt werden, waehrend der Nachweisschritt weiterhin mittels markierter Antikoerper erfolgt.

Description

Reduktion mit Natriumborhydrid erwiesen, die spezifischen Antikörper gegen CRP gewinnt man durch Immunisierung von geeigneten Tieren (z. B. Schafen, Kaninchen) und anschließender Festsphaseabsorption bzw. Affinitätschromatographie der gewonnenen Antiseren.

Ausführungsbeispiel

Zweisoitenbindungsassay zur Bestimmung von C-reaktivem Protein

Aus ß-Aminoethylphosphat und Trägerprotein wird unter Verwendung von Glutaraldehyd ein Ligand-Protein-Konjugat hergestellt und mittels 0,1 m Karbonatlösung, pH = 9,5 auf eine Konzentration von 3,2mg/l verdünnt. Diese Lösung wird zur Festphaseadsorption in geeignete Trägermaterialien überführt. Die Inkubation wird über Nacht bei 4⁰C ausgeführt. Anschließend wird die Flüssigkeit entfernt und die Träger bei -20⁰C bis zum Gebrauch gelagert. Für den Test werden die benetzten Festphasenträger auf Raumtemperatur erwärmt und mit Calziumpuffer (0,02m) pH = 7,3 mindestens zweimal gewaschen, mit der jeweiligen Standard-und Probeverdünnung in Calziumpuffer (1:1 000 und 1:5000) versetzt und 15min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernen der Lösung und zweimaligem Waschen mit Calziumpuffer wird mit Peroxydase-a-CRp-antikörperlösung (0,5mg/l) 30min bei 37°C ebenfalls in Calziumpuffer belassen. NaGh Entfernen der Lösung und dreimaligem Waschen wird die Substratreaktion mit o-Phenylendiamin/H₂02 durchgeführt und nach 5min mit Schwefelsäure (1 m/l) gestoppt, die Extinktion am Mehrkanalphotometer resp. Spektrophotometer gemessen, die Eichkurve gekennzeichnet und die Konzentration der Proben ermittelt.

Claims (1)

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von C-reaktivem Protein (CRP), dadurch gekennzeichnet, daß das CRP in einem Festsphase-Zweiseitenbindungsassay zunächst mit Ligand-Träger-Konjugaten bei 0 bis 45°C, vorzugsweise 20⁰C, innerhalb von 5 bis 20 min reagiert und anschließend mit spezifischen bzw. monoklonalen markierten a-CRP-Antikörpem umgesetzt wird. Verfahren nach Anspruch 1 ist gekennzeichnet dadurch, daß als Ligend-Trägerkonjugate Galaktane, Polykationen und Polyanionen, Histone, Protamine, Nucleinsäuren, Aminoalkyl- bzw. mono-, di-, tri-Alkylaminoalkylphosphorylverbindungen, vorzugsweise ß-Aminoalkylphosphoryl-Konjugate eingesetzt werden.

   Anwendungsgebiet der Erfindung

   Die Erfindung stellt ein neues Verfahren zur quantitativen Bestimmung von C-reaktivem Protein dar. Die Konzentration des CRP im Serum und anderen Körperflüssigkeiten erhöht sich bei bakteriellen Infektionen, Verletzungen, nach chirurgischen Eingriffen, Verbrennungen, Gewebsuntergängen.

   Durch die Bestimmung der Konzentration des CRP erhält der Kliniker Hinweise auf den Zustand des Patienten, da bei Gesundung Normalwerte erreicht werden. Hauptsächliche Anwendungen sind z.B. Erkennen und Beurteilen von Heilungsverläufen nach chirurgischen Eingriffen und Verletzungen, Sepsis bei Neugeborenen, Nachweis von Infarkten und Nekrosen, Zustand bei chronischen Entzündungen, Verläufe und Differentialdiagnose bei akuten bakteriellen und viralen Infektionen. Anwendungsgebiet ist daher die klinische Laboratoriumsdiagnostik. Da Wirbeltiere in ähnlicher Weise reagieren, ist das Verfahren auch für die Überwachung von Tierbeständen und die Beurteilung des Zustandes von Tieren geeignet.

   Charakteristik des bekannten Standes der Technik

   Die quantitative Bestimmung von Eiweißen in Körperflüssigkeiten findet Anwendung in der klinischen Laboratoriumsdiagnostik. Empfindliche Methoden sind bei der Analytik von Hormonen und einer Reihe von Plasmaproteinen notwendig. In den letzten Jahren haben sich hierfür Immunoassays durchgesetzt, die Antikörper einsetzen: Radioimmunoassays, Enzymimmunoassays, Fluorimmunoassays, jetzt auch Lumineszenzimmunoassays. Bei diesen Immunoassays gibt es verschiedene Konstruktionen. Homogene und hetereogene Assays, kompetive Tests, direkte und indirekte Zweiseitenbindungsassays, Immunglobulin- und Antigenbin'dungsassays, Capture-technik. Bei allen diesen Verfahren findet im entscheidenen Schritt eine Reaktion zwischen spezifischen Antikörpern und Antigen bzw. Hapten statt. Die quantitative Auswertung der Reaktion wird durch Zählung radioaktiver Zerfallsprozesse, Substratreaktionen mit anschließender optischer Auswertung, Fluoreszenzuntersuchungen oder Messung der Chemilumineszenz erreicht. Die Empfindlichkeit der Methoden ist hoch, die Meßbereiche liegen in Konzentrationsbereichen von pg/l bzw. ng/l im Test. Hauptnachteil dieser Tests ist die relativ lange Versuchszeit von mehreren Stunden bzw. Tagen. Antikörpertests führen weiterhin bei niedrigem Titer und hoher Rheumafaktorkonzentration zu falsch erhöhten Werten. Am Beispiel des CRP in Gegenwart von Rheumafaktoren wurde dies beschrieben von J. Highton und P. Hessian, J. Immunol. Meth. 68 (1984) 185—192. Immunoassays sind relativ teuer, da die Herstellung, Aufarbeitung und Spezifitätsuntersuchung von polyklonalen bzw. monoklonalen Antikörpern aufwendig ist, d.h., Verringerung des mengenmäßigen Einsatzes an diesen Materialien ist wünschenswert.

   Ziel der Erfindung

   Ziel der Erfindung ist es, ein schnelleres und kostengünstiges Verfahren zur quantitativen Bestimmung des CRP zu entwickeln, wobei gleichzeitig eine richtige Konzentrationsbestimmung bei Problemproben (bei hoher Konzentration von Rheumafaktoren) möglich ist.

   Darlegung des Wesens der Erfindung

   Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein neues Verfahren zur quantitativen Bestimmung des CRP zu entwickeln, indem die Nachteile der bisherigen Verfahren vermieden werden durch die Anwendung neuer Bindungspartner. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, indem ein Festphasen-Zweiseitenbindungsassay entwickelt wurde, wo das CRP mit festphasengebundenen Liganden folgender chemischer Strukturen: Galaktane (galaktosehaltige Polysaccharide), Polykationen und Polyanionen, Bindung an Histone, Protamine, Nucleinsäuren, Aminoalkyl- bzw. mono-, di-, tri-Alkylaminoalkylphosphorylverbindungen, Cu-haltige-Proteine und ß-Aminoalkyl-phosphoryl-konjugaten reagiert und in einem zweiten Reaktionsschritt mit markierten CRP^Antikörpem umgesetzt wird. Als besonders vorteilhaft hat sich der Einsatz von ß-Aminoalkylphosphoryl-Trägerprotein-Konjugaten zur Bestimmung von C-reaktivem Protein erwiesen. Das Verfahren ist weiterhin gekennzeichnet durch einen Temperaturbereich von 0 bis 45⁰C, vorzugsweise 20°C, und einer Reaktionszeit von 30 bis 320min. Die untere Nachweisungsgrenze liegt bei 0,1 mg/l CRp bei einem Normbereich bis8mg/l bei gesunden Erwachsenen. Der Meßbereich des Tests liegt zwischen 1 und 50μg/l. In diesem Bereich betragen die Variationskoeffizienten unter 10% in der Serie und 6-12% von Tag zu Tag bei dem im Anwendungsbeispiel beschriebenen Beispiel. Die Ligand-Träger-Konjugate können mit Hilfe von Kopplungsreaktanten bzw. durch unspezifische Bindung hergestellt werden, als praktikabel hat sich die Kopplung von Trägerprotein (z. B. Albumin, -Globulin, Ferritin) an ß-Aminoalkylphosphat mittels Glutadialdehyd und anschließender